Hoàn thiện phương pháp và nghiên cứu sự đa dạng di truyền của cây mắm đen ở khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn cần giờ bằng kỹ thuật RAPD

Hoàn thiện phương pháp và nghiên cứu sự đa dạng di truyền của cây mắm đen ở khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn cần giờ bằng kỹ thuật RAPD

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

***000***

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

HOÀN THIỆN PHƯƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU SỰ ĐA

DẠNG DI TRUYỀN CỦA CÂY MẮM ĐEN (Avecinnia officinalis)

Ở KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ BẰNG KỸ THUẬT RAPD

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2003 - 2007

Sinh viên thực hiện: NGÔ TRẦN VŨ

Thành phố Hồ Chí Minh

Tháng 9/2007

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

************

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

HOÀN THIỆN PHƯƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU SỰ ĐA

DẠNG DI TRUYỀN CỦA CÂY MẮM ĐEN (Avecinnia officinalis)

Ở KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ BẰNG KỸ THUẬT RAPD

Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007

LỜI CẢM TẠ

Con xin thành kính ghi ơn Ba, Mẹ cùng người thân trong gia đình luôn quan tâm, tạo điều kiện và động viên con trong suốt quá trình học tập

Tôi xin chân thành cảm ơn:

- Ban giám hiệu trường Đại học Nông Lâm đã tạo điều kiện cho tôi trong suốt thời gian học tập và thực tập

- Các Thầy, Cô giáo trong bộ môn CNSH và các Thầy, Cô đã trực tiếp giảng dạy trong suốt quá trình học tập 4 năm qua

- Thầy Bùi Minh Trí đã tận tình hướng dẫn và động viên trong suốt thời gian thực hiện đề tài

- Các anh chị trong Trung tâm Phân tích Hoá sinh Trường Đại học Nông Lâm đã tận tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài

- Các anh chị ở Ban quản lý rừng Cần Giờ đã tận tình giúp đỡ tôi trong thời gian làm đề tài

- Toàn thể lớp CNSH29 thân yêu đã động viên và giúp đỡ tôi trong suốt 4 năm học

Tp Hồ Chí Minh Tháng 9 năm 2007 Sinh viên thực hiện Ngô Trần Vũ

TÓM TẮT

Ngô Trần Vũ, Đại Học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 “HOÀN THIỆN PHƯƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÂY

MẮM ĐEN (Avecinnia officinalis) Ở KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN RỪNG NGẬP

MẶN CẨN GIỜ BẰNG KỸ THUẬT RAPD” Giáo viên hướng dẫn:

TS BÙI MINH TRÍ

Rừng ngập mặn Cần Giờ được xem là “lá phổi xanh” của Thành phố với chức năng điều hòa không khí, giảm ô nhiễm môi trường xử lý nước thải của Thành phố, thu nhận khí CO2 và cho ra khí O2 do hoạt động công nghiệp Để có một chiến lược lâu dài và bền vững thì việc đánh giá mức độ di truyền của quần thể này nhằm có chiến lược bảo tồn nguồn gen quý hiếm

Kết quả đạt được:

- Thu thập 50 mẫu lá mắm đen với những đặc điểm hình thái cây khác nhau - Xác định điều kiện bảo quản cho tối ưu

- Hoàn thiện qui trình ly trích DNA

- Primer OPA10 và OPA5 không cho kết quả phản ứng RAPD-PCR - Primer OPD18 cho sản phẩm nhưng chưa được tối ưu

- Primer 1 cho một band kích thước 400bp nên không có ý nghĩa trong nghiên cứu đa dạng di truyền

- Bước đầu khảo nghiệm primer OPAC10, xác định điều kiện tối ưu cho primer - Nghiên cứu đa dạng di truyền cây mắm trên primer OPAC10 của 11 mẫu thu

được trung bình 5,4 band/mẫu Tỷ lệ đồng hình 62,5% và tỷ lệ đa hình 37,5% trong đó 5 band đồng hình và 3 band đa hình Phân tích trên phân mềm NTSYSpc 2.1, cây phân nhóm di truyền cho đồng hình khá cao Cây phân nhóm di truyền chia làm 2 nhóm, nhóm I có hệ số đồng dạng di truyền cao 0,875-1 Nhóm 2 thu được một nhánh do không đủ điều kiện thực hiện trên nhiều mẫu

SUMMARY

Ngo Tran Vu, Nong Lam University, 9/2007 “RESEARCH ON METHOD

DEVELOPMENT AND GENETIC DIVERSITY EVALUATION OF Avecinnia officinalis IN CAN GIO MANGROVE BIOPHERE RESERVE AREA BY RAPD-

PCR”

Supervisor: Bui Minh Tri

Can Gio mangrove forest was economic and environmental value, it was very important for air-condition and waste water treatment of Ho Chi Minh City Can Gio mangrove forest had rich and diversified floristic composition So, studying genetic

diversity of Avecinnia officinalis tree aimed conserve genetic resource gene

The obtained results were:

- To collect 50 samples leaf with many tree different characteristic

- Optimized process extraction DNA for Avecinnia officinalis tree

- Optimized RAPD-PCR reaction for primer OPAC10

- To use software NTSYSpc 2.1 analyses for 11 samples Polymorphism had 3 band and rate 37, 5%, isomorphism had 5 band and rate 62, 5%

Chương 2: TỒNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Tổng quan về khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn 3

2.1.1 Giới thiệu khu vực dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn 3

2.1.2 Vai Trò của khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ 4

2.2 Một số khái niệm về đa dạng sinh học 5

2.2.1 Đa dạng sinh học 5

2.2.2 Sự đa dạng di truyền 5

2.2.3 Ý nghĩa của việc nghiên cứu và bảo vệ sự đa dạng di truyền 6

2.3 Đặc điểm sinh vật học và hình thái học của cây mắm đen 6

2.3.1 Hình thái học 6

2.3.2 Phân bố 8

2.3.3 Vai trò của rừng mắm 9

2.4 Các kỹ thuật trong tách chiết DNA 9

2.4.1 Các thông tin di truyền 9

2.4.3 Đánh giá chất lượng DNA 11

2.4.3.1 Định lượng DNA bằng quang phổ kế 11

2.4.3.2 Định tính DNA bằng phương pháp điện di 12

2.5 PCR (polymerase chain reaction) 12

2.5.1 Nguyên tắc 12

2.5.2 Thành phần cơ bản của phản ứng PCR 14

2.5.3 Các yếu tố ảnh hưởng tới PCR 14

2.5.4 Ưu điểm và nhược điểm 14

2.6 Một số chỉ thị phân tử trong nghiên cứu đa dạng sinh học 15

2.6.1 Chỉ thị RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) 15

2.6.2 Chỉ thị RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) 16

2.6.3 Chỉ thị AFLP 17

Chương 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 20

3.1 Nội dung đề tài 20

3.2 Thời gian thực hiện đề tài 20

3.3 Vật liệu 20

3.3.1 Mẫu mắm đen 20

3.3.2 Hóa chất thí nghiệm 21

3.3.2.1 Các hóa chất dùng trong ly trích DNA 21

3.3.2.2 Hóa chất dùng trong kiểm tra định lượng DNA 22

3.3.2.3 Hóa chất dùng trong định tính DNA 22

3.3.2.4 Hóa chất dùng để phản ứng RAPD 22

3.3.3 Trang thiết bị 22

3.4 Phương pháp 23

3.4.1 Đối tượng nghiên cứu 23

3.4.2 Phương pháp nghiên cứu 23

3.4.3 Cách bố trí thí nghiệm 23

3.4.4 Phương pháp ly trích DNA 23

3.4.4.1 Quy trình ly trích mẫu tươi Doyle và Doyle (1988) 23

3.4.4.2 Quy trình ly trích DNA bằng nitơ lỏng 24

3.4.4.3 Định tính DNA bằng phương pháp điện di 25

3.4.4.4 Phương pháp định lượng DNA bằng quang phổ kế 25

3.4.5 Thực hiện phản ứng RAPD-PCR 26

3.4.5.1 Primer sử dụng 26

3.4.5.2 Bố trí thí nghiệm 26

3.4.6 Phân tích kết quả bằng phần mềm NTSYSpc 30

Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32

4.1 Thu thập mẫu tại các tiểu khu rừng ngập mặn Cần Giờ 32

4.2 Bảo quản và ly trích vật liệu di truyền 33

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Thành phần hóa chất dung dịch ly trích EB 19

Bảng 3.2 Thành phần hóa chất TE 1X 19

Bảng 3.3 Danh sách các primer dùng trong nghiên cứu 23

Bảng 3.4 Thành phần hóa chất cho phản ứng RAPD-PCR của thí nghiệm 1 24

Bảng 3.5 Chu trình nhiệt cho phản ứng RAPD-PCR của thí nghiệm 1 24

Bảng 3.6 Thành phần hóa chất cho phản ứng RAPD-PCR của thí nghiệm 2 25

Bảng 3.7 Chu trình nhiệt cho phản ứng RAPD-PCR của thí nghiệm 2 25

Bảng 3.8 Thành phần hóa chất cho phản ứng RAPD-PCR của thí nghiệm 3 26

Bảng 3.9 Chu trình nhiệt cho phản ứng RAPD-PCR của thí nghiệm 3 26

Bảng 3.10 Thành phần hóa chất cho phản ứng RAPD-PCR của thí nghiệm 4 27

Bảng 3.11 Chu trình nhiệt cho phản ứng RAPD-PCR của thí nghiệm 4 27

Bảng 4.1 Bảng OD của 6 mẫu nghiền theo qui trình cải tiến 34

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1 Hình dáng cây mắm đen 6

Hình 2.2 Lá và hoa của cây mắm đen 7

Hình 2.3 Trái của cây mắm đen 7

Hình 2.4 Nguyên tắc hoạt động của phản ứng PCR 12

Hình 2.5 Nguyên tắc của kỹ thuật RFLP 14

Hình 2.6 Nguyên tắc hoạt động của kỹ thuật RAPD 15

Hình 4.1 Bản đồ vị trí lấy mẫu mắm đen ở Cần Giờ 32

Hình 4.2 Ly trích DNA theo qui trình Doyle và Doyle (1988) 33

Hình 4.3 Ly trích theo qui trình Doyle và Doyle (1988) cải tiến 34

Hình 4.4 Ly trích DNA theo qui trình nitơ lỏng 36

Hình 4.5 Kết quả điện di sản phẩm phản ứng RAPD-PCR với primer OPA10 và OPA5 37

Hình 4.6 Kết quả điện di sản phẩm phản ứng RAPD-PCR với primer RAH8 38

Hình 4.7 Kết quả điện di sản phẩm phản ứng RAPD-PCR với primer 1 39

Hình 4.8 Kích thước band phản ứng RAPD-PCR của primer 1 39

Hình 4.9 Kết quả điện di sản phẩm phản ứng RAPD-PCR với primer OPAC10 40

Hình 4.10 Kết quả điện di sản phẩm của thí nghiệm 2 41

Hình 4.11 Kết quả điện di sản phẩm của thí nghiệm 3 41

Hình 4.12 Kết quả điện di sản phẩm RAPD-PCR của mồi OPAC10 khi đã tối ưu 42

Hình 4.13 Cây phân nhóm di truyền của 11 mẫu mắm đen 43

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

A1, A2, A3… Mẫu 1, mẫu 2, mẫu 3…

AFLP: Amplified Fragment Length Polymorphism

EDTA: Ethylene Diamine Tetra acetic Acid GPS Global Position System

PCR: Polymerase Chain Reaction

RAPD: Random Amplified Polymorphic DNA RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism TAE: Tris – Acetate – EDTA

WWF: World Wildlife Fund (quỹ quốc tế về bảo tồn thiên nhiên)

Trong chiến tranh chống Mỹ, rừng ngập mặn Cần Giờ phải chịu hàng ngàn tấn bom đạn cùng với đó là một lượng hóa chất khổng lồ đã đổ xuống đây làm cho rừng bị tàn phá khủng khiếp Do vậy, từ năm 1978 huyện Cần Giờ đã tiến hành khôi phục lại hệ sinh thái rừng ngập mặn, sau 22 năm khôi phục tổ chức UNESCO đã công nhận là “khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ” vào ngày 21/02/2000.[10]

Khu dự trữ sinh quyển Cần Giờ có vai trò vô cùng quan trọng về kinh tế và môi trường, là khu làm sạch môi trường sinh thái, môi trường nước và không khí Thành phố đã bị ô nhiễm nghiêm trọng Rừng ngập mặn Cần Giờ vừa là rừng phòng hộ, vừa là rừng bảo vệ Thành phố Hồ Chí Minh [2] Vì thế việc nghiên cứu đa dạng di truyền của cây mắm là vô cùng cấp thiết nhằm có chiến lược quản lý và phát triển khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ Chúng ta cũng có thể tìm ra chỉ thị phân tử cho cây mắm và bảo tồn nguồn gene quý

Được sự phân công của Bộ môn Công Nghệ Sinh Học Trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh dưới sự hướng dẫn của thầy Bùi Minh Trí chúng tôi đã thực

hiện đề tài “HOÀN THIỆN PHƯƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG

DI TRUYỀN CỦA CÂY MẮM ĐEN (Avicennia officinalis) Ở KHU DỰ TRỮ

SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ BẰNG KỸ THUẬT RAPD”

1.2 Mục đích, yêu cầu và giới hạn đề tài 1.2.1 Mục đích

 Thiết lập và hoàn thiện quy trình ly trích DNA của cây mắm đen  Tối ưu hóa phương pháp RAPD cho cây mắm đen

 Thông qua kỹ thuật RAPD đánh giá mức độ đa dạng di truyền của quần thể mắm đen

 Tìm ra chỉ thị phân tử cho họ mắm giúp cho quá trình chọn giống

1.2.2 Yêu cầu

 Thu thập mẫu lá cây mắm đen  Ly trích DNA mẫu lá cây mắm đen

 Hoàn thiện kỹ thuật RAPD cho cây mắm đen

 Đánh giá đa dạng di truyền của quần thể cây mắm đen

 Mô tả quan hệ di truyền của các mẫu cây mắm đen bằng phần mềm NTSYSpc

1.2.3 Giới hạn đề tài

 Đề tài chỉ nghiên cứu quần thể một số tiểu khu trong khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn

 Số lượng mẫu nghiên cứu còn ít

 Chưa đủ điều kiện tiến hành kiểm tra tất cả các primer và các tổ hợp các primer  Thời gian thực hiện ngắn từ 05/05/2007 đến 01/09/2007

Chương 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tổng quan về khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn 2.1.1 Giới thiệu khu vực dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn

Khu dự trữ sinh quyển Cần Giờ nằm ở vùng ven biển vịnh Gềnh Rái và cửa sông Đồng Nai với hệ sinh thái rừng ngập mặn đặc trưng, có diện tích gần 71,370 ha Rừng ngập mặn được xem là hệ sinh thái quan trọng, điển hình ở vùng ven biển nhiệt đới không chỉ cung cấp lâm sản có giá trị mà còn là nơi cư trú của nhiều loài hải sản, chim nước, chim di cư và một số loài động vật lưỡng cư trên cạn [10]

Rừng ngập mặn Cần Giờ có cấu trúc địa chất khác xa khu vực rừng ngập mặn Minh Hải, nền thổ nhưỡng chủ yếu là các loại đất phát triển giàu hữu cơ, bị mặn nặng và đất phèn tiềm tàng cận duyên nên hệ sinh thái môi trường rừng ngập mặn Cần Giờ mang nét đặc thù riêng so với các rừng ngập mặn khác của Việt Nam [2]

Tên gọi và phân bố:

Tên chính thức: Khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ, Tp Hồ Chí Minh

Tên ngắn gọn: Khu dự trữ sinh quyển Cần Giờ

Vĩ độ Bắc: 10022’14” – 10037’39”

Kinh độ Đông: 106046’12” – 107000’59”

Phía Bắc giáp với huyện Long Thành của tỉnh Đồng Nai Phía Đông giáp biển Vũng Tàu

Phía Nam giáp với sông Đồng Tranh

Phía Tây giáp với huyện Nhà Bè của Thành phố HCM.[10]

Khí hậu Cần Giờ chia làm hai mùa rõ rệt, mùa mưa từ tháng 5 – 10 và mùa nắng từ tháng 11 – 4, nhiệt độ trung bình ở đây 25,80C Địa hình khá bằng và bị chia cắt bởi các sông lớn như: sông Sài Gòn, sông Đồng Nai, sông Đồng Tranh Tạo nên những đảo nhỏ liên kết với nhau Mức độ mặn giảm dần khi đi vào nội địa Tại Bình

Khánh độ ngập mặn chỉ xấp xỉ 0,6 – 1%, tại Dần Xầy đã xấp xỉ 2% và tại Hào Võ là 3% Tùy theo mùa và lượng nước do các sông Sài Gòn và Đồng Nai cung cấp mà độ mặn chênh lệch khác nhau Do vậy, chúng đã tạo nên sự phong phú về tiềm năng và sự đa dạng sinh học trong vùng Đã có trên 100 loài thực vật tự nhiên trong đó có 51 loài có giá trị kinh tế để làm nguyên liệu cho tiểu thủ công nghiệp và một số cây thuốc chữa bệnh Phần quan trọng hơn với thảm thực vật chịu mặn ở Cần Giờ là có khả năng cung cấp chất hữu cơ cho đất và đây là nguồn dinh dưỡng quan trọng cho vi sinh vật bậc thấp sinh sống, đồng thời là nguồn dinh dưỡng không thể thiếu cho sinh vật phù du tham gia vào dây chuyền thức ăn và liên hệ với động thực vật trong rừng ngập mặn [2]

Tại rừng ngập mặn Cần Giờ chủ yếu là sự hiện diện của cây đước (Rhziophora apiculata), cây mắm trắng (Avicennia alba), đưng (Rhzophora mucronata), vẹt (Sonneratia alba), xu (Xylocarpus spp), cóc (Lumnizera spp), chà là (Phoenix paludosa), giá (Excoecaria aagallocha), mắm đen (Avicennia officinalis), v.v… và nó

thể hiện quy luật diễn thế thảm thực vật rừng ngập mặn, theo độ cao địa một hình rõ rệt và nhạy cảm [14]

2.1.2 Vai trò của khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ

Điều tiết khí hậu, giảm thiểu ô nhiễm không khí Rừng ngập mặn Cần Giờ với độ che phủ cao chính là “lá phổi xanh” của Thành phố Đây là vùng xử lý khí độc, góp phần làm bầu không khí trong lành, điều tiết nhiệt độ, độ ẩm, ngăn cản gió bão Với một Thành phố trên 5 triệu người cùng với hàng chục đô thị, khu công nghiệp ở Bà Rịa - Vũng Tàu, Đồng Nai, hàng ngàn cơ sở sản xuất, hàng triệu xe có động cơ mà không có rừng này chắc chắn sức khỏe của người dân sẽ bị ảnh hưởng xấu [13]

Xử lý nước thải và các tác nhân ô nhiễm từ đất liền Các bãi bồi vùng rừng ngập mặn vừa có tác dụng ngăn sóng, cản trở xói mòn bờ biển, vừa có giá trị to lớn trong việc phân hủy theo cơ chế sinh hóa các tác nhân ô nhiễm từ Thành phố, các khu công nghiệp do sông thải ra Nếu bê tông hóa các bãi bồi này phần lớn chất ô nhiễm sẽ được chuyển ra vịnh Gành Rái gây ô nhiễm biển, gây suy giảm nghề thủy sản và du lịch cho Cần Giờ, Vũng Tàu, Đồng Nai, Long An Nhiều nghiên cứu cho thấy muốn làm sạch các kênh Nhiêu Lộc, Thị Nghè, Tân Hóa - Lò Gốm, Tham Lương và xử lý nước thải sinh hoạt khu vực Thành phố Hồ Chí Minh phải cần đến 300 - 500 triệu USD để xây

dựng các công trình Như vậy, giá trị kinh tế vùng sinh thái ngập mặn Cần Giờ Nhà Bè trong việc xử lý chất thải cũng có thể tính đến nhiều trăm triệu USD Điều này ít nhà qui hoạch, nhà kinh tế tính tới [13]

Vùng sinh thái ngập mặn Cần Giờ có giá trị kinh tế cao về mặt thủy sản Đây là vùng sinh sản, cư trú và phát triển của nhiều loài tôm, cá, cua Thực tế đã chứng minh rằng ở Thái Lan, Malaixia, ở ĐBSCL cũng như ở Cần Giờ, nơi nào rừng ngập mặn bị phá nhiều cũng dẫn tới suy giảm nguồn lợi thủy sản và năng suất tôm nuôi do mất nơi cư trú và gia tăng ô nhiễm nguồn nước [13]

2.2 Một số khái niệm về đa dạng sinh học 2.2.1 Đa dạng sinh học

Đa dạng sinh học có nghĩa là sự phong phú, đa dạng của các dạng sống hiện đang tồn tại trên Trái đất

Theo quỹ quốc tế về bảo tồn thiên nhiên – WWF (World Wildlife Fund) (1989), đa dạng sinh học được định nghĩa như sau: “Đa dạng sinh học là sự phồn thịnh của sự sống trên trái đất, là hàng triệu loài thực vật, động vật và vi sinh vật, là các gen chứa đựng trong các loài và là những hệ sinh thái vô cùng phức tạp tồn tại trong môi trường”

Đa dạng sinh học được biết ở ba mức độ  Sự đa dạng của hệ sinh thái

 Sự đa dạng của loài

 Sự đa dạng di truyền hay là sự đa dạng nguồn gen bên trong loài

2.2.2 Sự đa dạng di truyền

Các cá thể trong một quần thể thường có bộ gen khác nhau Sự đa dạng về bộ gen được biểu hiện qua sự khác nhau về gen giữa các cá thể Những alen khác nhau của cùng một gen có thể làm cho sự phát triển các đặc điểm sinh lý ở mỗi cá thể khác nhau là khác nhau Những cây trồng được lai ghép hay những động vật được lai tạo từ những bộ gen khác nhau có thể tạo ra những giống cây trồng, vật nuôi cho năng suất cao, khả năng chống chịu sâu bệnh tốt

Trong quá trình sinh sản hữu tính, kiểu gen của các cá thể trong quần thể sẽ tăng lên do kết quả tái tổ hợp

Các gen đa hình là nguyên nhân dẫn đến sự tồn tại các kiểu gen dị hợp trong quần thể Sự khác biệt về kiểu gen của các cá thể trong quần thể cho phép các quần thể này thích nghi hơn với những thay đổi môi trường

2.2.3 Ý nghĩa của việc nghiên cứu và bảo vệ sự đa dạng di truyền

Đa dạng di truyền là đòi hỏi của bất kỳ loài nào để đảm bảo sự sinh sản, chịu đựng bệnh tật và khả năng thích nghi với điều kiện môi trường luôn luôn thay đổi

Bảo tồn nguồn gen không chỉ nhằm ngăn chặn sự tuyệt chủng của một loài mà bảo tồn nguồn gen còn nhằm ngăn chặn sự mất mát của các gen, các phức hợp gen và các kiểu hình, ngăn chặn sự tuyệt chủng các nòi địa lý (landraces) mà vốn gen của chúng bị suy giảm nghiêm trọng tới mức một số gen và một số phức hợp gen có thể bị mất đi, tiềm năng di truyền của loài bị giảm mạnh, và trong trường hợp xấu nhất là sự tuyệt chủng của loài

2.3 Đặc điểm sinh vật học và hình thái học của cây mắm đen

Tên Việt Nam: Cây mắm đen

Tên Latin: Avicennia officinalis Giới (regnum): Plantae

Ngành (divisio): Magnoliophyta Lớp (class): Magnoliopsida

Bộ (ordo): Lamiales

Họ (familia): Avicenniaceae Chi (genus): Avicennia

2.3.1 Hình thái học

Hình dáng : Cây mắm đen cao tối đa có thể tới 20 m, đường kính đến 0,7 m,

thân hình trụ, tương đối suôn, có khi thẳng với thân trụ cao 6 – 10 m, cành non có lông tơ trơn, vỏ mỏng không nứt màu xám đen, rễ phổi hình đũa, thường chia đôi [11]

Hình 2.1 Hình dáng cây mắm đen

Lá: Lá đơn, mọc đối, đầu tròn lúc cây còn nhỏ, sau có hình trứng ngược, dài

6 – 8 cm, rộng 2,5 – 4 cm, chân nêm, bìa lá thường cuốn xuống, mặt trên xanh, trơn, mặt dưới có lông rất mịn, sát, màu vàng hung, gân rõ, các đầu gân phụ cong ở đầu, nối với bìa, cuống lá trơn dài 0,5 – 1 cm.[11]

Hình 2.2 Lá và hoa của cây mắm đen

Hoa: Hoa nhỏ, dài 10 mm, vàng, có mùi thơm, hợp thành phát hoa kép dày ở

ngọn, thường có 3 nhánh hoa, mỗi hoa có lá bắc phụ nhỏ hình bầu dục, có lông tơ, đài hoa không rụng, lớn, các tai đài bằng nhau, hình bầu dục, có lông trắng mịn ở dưới thấp, dài 5 – 6 mm, màu đen, vành hoa lớn, hình ống, dài bằng đài, màu vàng cam, ngoài trơn, dài 2 – 4 mm, dính ở dưới, trên có 4 thùy không bằng nhau rụng sớm, 4

tiểu nhị, bầu noãn hình nón, có lông trắng mịn, vòi nhụy hình sợi dài trắng, có lông rậm, đầu nhụy chẻ hai, uốn cong [11]

Trái: Trái là manh nang hình trứng gốc tròn, đầu có mũi nhọn, dài 2 – 3 cm có

khi đến 3,8 cm Mầm xanh đỏ dợt, vỏ đầy lông vàng mịn, 01 hột, không phôi nhũ, nẩy mầm trước khi trái rụng [11]

Hình 2.3 Trái của cây mắm đen 2.3.2 Phân bố

Rừng Sát Việt Nam (Cà Mau, Long Hải) Pakistan, Ấn Ðộ, Myanma, Philippin, Malaixia, Inđônexia, Nouvelle Guinee, Saloman, Caroline, là loại cây ưa sáng, sinh trưởng nhanh, thuộc loại chịu đất kiềm, thích nghi với các loại đất (bùn, cát, sét) và các độ mặn của nước (mặn, lợ, ngọt), cho chồi gốc Tại Cà Mau, cây trổ hoa vào đầu mùa mưa (4 - 6 dương lịch), cho trái vào cuối mùa mưa (9 - 11 dương lịch), vài giờ sau khi rụng, cây mầm hút nước lớn ra, làm vỡ lớp vỏ trái bao ngoài Rừng sát Việt Nam thường chiếm những diện tích mới bồi ven biển, mực thủy triều lên xuống hàng ngày Nói chung, "Ðất bùn có nước triều lên xuống hàng ngày" là đất sinh trưởng, phát triển thích hợp của loài cây gỗ này Tại Cà Mau, cây có thể cao đến 22 – 25 m với đường kính 15 – 20 cm [11]

2.3.3 Vai trò của rừng mắm đen

Mắm đen là loại cây có sinh khối lớn, gỗ mắm đen được sử dụng rộng rãi đóng nhà cửa, đóng vật dụng, làm bè thuyền, cung cấp nguyên liệu cho làm giấy, nguyên

liệu cho làm dược phẩm, cung cấp sắc tố cho công nghiệp thuộc da [15]

Đặc điểm của cây mắm đen là có rễ đất và rễ phổi Rễ phổi có nhiệm vụ hấp thụ dưỡng khí, là biện pháp sinh tồn khi nền đất ngập mặn Rễ phổi cũng là "kiến trúc" của thiên nhiên thích ứng để bảo vệ đất bồi [15] Bên cạnh đó, rừng mắm đen có vai trò quan trọng hơn là làm cân bằng hệ sinh thái, làm dịu mát khí hậu, cung cấp một lượng lớn O2 và cùng với đó là hấp thu một lượng lớn CO2 làm môi trường trong lành Ngoài ra, rừng mắm đen là nơi cư trú của nhiều loài động vật hoang dã quý hiếm [2]

Do vậy, việc nghiên cứu tính đa dạng di truyền của cây mắm đen là vô cùng quan trọng nhằm giúp cho chúng ta có chiến lược quản lý và bảo vệ để bảo tồn nguồn gene quý hiếm ở Việt Nam nói riêng và trên thế giới nói chung Cây mắm đen ở Việt Nam cũng như trên thế giới thật sự chưa có tài liệu nghiên cứu kĩ về tính đa dạng di truyền của quần thể cây này

2.4 Các kỹ thuật trong tách chiết DNA 2.4.1 Các thông tin di truyền

Theo lý thuyết trung tâm của sinh học phân tử (Crick, 1958), thông tin di truyền được mang bởi chuỗi DNA (hay RNA ở vài virus), qua các giai đoạn sao chép và dịch mã, sẽ được chuyển thành các trình tự amino acid của protein

Nucleic acid, vật liệu mang thông tin di truyền của các hệ thống sống, là một polymer hình thành từ các monomer là nucleotide Mỗi nucleotide gồm ba thành phần: Nhóm phosphate, đường pentose (đường 5C) và một base hữu cơ (vì các nucleotide chỉ khác nhau ở base nên người ta thường dùng từ “base” thay cho “nucleotide”)

Các base hữu cơ thuộc hai nhóm: Các purine gồm Adenine (A) và Guanine (G), các pyrimidine gồm Thymine (T), Cytosine (C) và Uracine (U) Các nucleotide được nối với nhau bằng liên kết phosphodiester tạo thành chuỗi dài

Nucleic acid gồm hai loại phân tử có cấu tạo rất giống nhau là deoxyribonucleic acid (DNA) và ribonucleic acid (RNA) DNA cũng như RNA được tạo bởi nhiều nucleotid nối nhau nhờ các cầu nối ester Tuy nhiên, có ba đặc tính của DNA giúp ta phân biệt DNA và RNA

 Đường của DNA là deoxyribose, trong khi đó đường của RNA là ribose

 Các base tạo nên các nucleotid của DNA là A, G, C, và T Các base tạo nên nucleotid của RNA là A, G, C và U

 Phân tử DNA thông thường được tạo bởi hai chuỗi nucleotid, trong khi đó RNA thông thường chỉ có một chuỗi Tuy nhiên, có vài trường hợp ngoại lệ RNA của một số virus có hai chuỗi nucleotide

Ở sinh vật Eucaryote, thông tin di truyền là phân tử DNA, là một chuỗi xoắn

kép gồm hai mạch đơn, mỗi mạch đơn là một chuỗi nucleotide Mỗi nucleotide gồm nhóm phosphate, đường deoxyribose và một trong bốn loại base (A, C, G, T) Hai mạch đơn liên kết với nhau nhờ liên kết hydro, giữa NH2 và CO, N và NH Do đó, A bổ sung cho T có hai nối hydrogen, G bổ sung cho C có ba nối hydrogen, tỷ lệ giữa A/T=1 và G/C=1 Tuy nhiên, tỷ lệ (A+T)/(G+C) rất hay thay đổi giữa các DNA khác nhau và đặc trưng cho loài Mỗi mạch đơn là một trình tự có định hướng với một đầu là 5’ phosphate tự do và một đầu là 3’ hydroxyl tự do (hướng quy ước là 5’ 3’) Hướng của hai mạch đơn trong chuỗi xoắn kép ngược nhau và gọi chúng là hai mạch đối song song Hai mạch đơn liên kết với nhau bởi tính chất bổ sung Chính tính chất này giải thích được cấu trúc chặt chẽ của phân tử DNA, đặc biệt là cách thức tự sao chép để tạo ra hai phân tử con từ một phân tử [9]

2.4.2 Phương pháp tách chiết DNA

Phương pháp tách triết DNA cơ bản gồm ba bước:

Bước1: Phá màng tế bào và màng nhân (Eucaryote) Thông thường người ta

nghiền tế bào, mô trong hợp chất tẩy (như SDS, sarcosyl) và Proteinase (Proteinase K) Hỗn hợp này sẽ phá vỡ màng tế bào và màng nhân, giải phóng DNA ra môi trường

đồng thời phá hủy các protein liên kết với DNA

Bước 2: Loại bỏ các thành phần không mong muốn trong mẫu, chủ yếu là các

protein Mẫu được lắc thật mạnh trong dung dịch Phenol và Chloroform, dung dịch Phenol và Chloroform có tác dụng làm biến tính protein đồng thời không hòa tan acid nucleic Protein khi bị biến tính sẽ không hòa tan trong pha nước có chứa acid nucleic và sau khi ly tâm sẽ tủa thành một lớp nằm giữa pha nước và pha Phenol:Chloroform Pha nước có chứa acid nucleic được thu nhận lại

Bước 3: Tủa acid nucleic Mục đích tủa là nhằm thu acid nucleic dưới dạng cô

đặc, một mặt bảo vệ chúng khỏi sự phân hủy của các enzyme, mặt khác ta có thể hòa tan chúng lại trong dung dịch theo nồng độ mong muốn Có hai phương pháp tủa thường dùng :

 Tủa trong Ethanol (Ethylic alcohol), việc tủa này được thực hiện trong môi trường có lực ion cao (nồng độ muối cao) và nồng độ Ethanol cao (2,5 dung tích Ethanol/1dung tích mẫu), nhiệt độ thấp tạo thuận lợi cho việc tủa

 Tủa trong Isopropanol, điểm khác biệt so với phương pháp trên là không cần sự hiện diện của muối, thể tích Isopropanol/thể tích mẫu là 1/1 Các DNA có phân tử trọng lượng nhỏ không bị tủa Do đó, có thể loại chúng ra khi dùng cách tủa trong Isopropanol

Trong hai phương pháp trên có thể thu acid nucleic bằng ly tâm Sau đó cặn tủa rửa trong Ethanol 70% để loại các muối hoặc Isopropanol còn dính lại trên mẫu [5]

Một số vấn đề gặp phải khi ly trích DNA:  Có lẫn tạp RNA trong mẫu

 Lẫn tạp chất Polysaccharide trong mẫu DNA  DNA bị đứt gẫy

2.4.3 Đánh giá chất lượng DNA

2.4.3.1 Định lượng DNA bằng quang phổ kế

Phương pháp này cho phép ước lượng tương đối nồng độ nucleic acid có trong mẫu sau khi ly trích được Nguyên tắc của phương pháp này dựa vào sự hấp thụ mạnh ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 260 nm của các base purine và pyrimidine Giá trị mật độ quang (OD: Optical density) ở bước sóng 260 nm của các mẫu đo cho phép xác định nồng độ nucleic acid trong mẫu dựa vào tương quan: 1 đơn vị OD260nm tương ứng với nồng độ 50 µg/ml cho dung dịch chứa DNA mạch kép và 40 µg/ml cho một dung dịch RNA hay DNA sợi đơn

Tuy nhiên, cách tính này chỉ đúng với dung dịch chứa nucleic acid sạch Để kiểm tra độ sạch của dung dịch, người ta đo thêm giá trị OD280nm Tại bước sóng 280 nm, protein có mức hấp thụ cao nhất, nhưng các protein cũng hấp thu bước sóng ở 260 nm như các nucleic acid và do đó làm sai lệch giá trị thật của nồng độ nucleic acid Tỉ số OD260nm /OD280nm là tỉ số cho thấy độ tinh sạch của DNA [5]

Tỉ số OD260nm /OD280nm = 1,8 đối với DNA tinh khiết Tỉ số OD260nm /OD280nm = 2 đối với RNA tinh khiết

2.4.3.2 Định tính DNA bằng phương pháp điện di

Nguyên tắc của phương pháp này dựa vào đặc tính của các nucleic acid Đó là các đại phân tử tích điện âm nên khi chịu tác động của một điện trường, chúng sẽ di chuyển về cực dương của điện trường Tính linh động của các phân tử này được phân tích trên bảng gel, nó phụ thuộc vào hai yếu tố: Khối lượng phân tử và nồng độ các chất cấu thành gel Việc lựa chọn các loại gel cũng như nồng độ các chất tạo thành gel tùy thuộc kích thước trung bình của các đoạn phân tử nucleic acid cần phân tách

 Gel agarose: Là loại gel thông dụng nhất, dùng để phân tách những đoạn DNA có kích thước từ 0,5 – 200 kb Dùng điện di phương ngang

 Gel polyacrylamide: Được dùng để phân tách những đoạn có kích thước nhỏ, dưới 1000 bp Dùng điện di phương thẳng đứng

2.5 PCR (Polymerase Chain Reaction)

Phản ứng PCR do K B Mullis (Nobel hóa học, 1993) phát minh ra năm 1985

Đây là phương pháp in vitro để nhân bản nhanh một đoạn DNA nào đó mà chỉ cần một

khối lượng mẫu ban đầu rất nhỏ Kỹ thuật này có độ nhạy rất cao và được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như sinh học phân tử, chẩn đoán, di truyền quần thể và phân tích pháp y

2.5.1 Nguyên tắc

Tất cả Taq DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từ

khuôn đều cần sự hiện diện của những mồi chuyên biệt Mồi là những đoạn

oligonucleotide có khả năng bắt cặp bổ sung đầu 3’ của khuôn Taq DNA polymerase

sẽ kéo dài mồi để hình thành sợi mới

Hiện tượng trên chính là cơ sở của phản ứng PCR Nếu được cung cấp hai mồi (mồi xuôi và mồi ngược) có khả năng bắt cặp chuyên biệt với hai đầu của một trình tự DNA, phản ứng PCR sẽ nhân bản trình tự nằm giữa hai mồi này

Bước 3: Kéo dài dây mới nhờ primer

Nhiệt độ được tăng lên 720C giúp cho Taq DNA polymerase hoạt động tốt nhất

Thời gian của giai đoạn này tùy thuộc vào độ dài của trình tự DNA khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến vài phút

Một chu kỳ gồm 3 bước trên được lặp đi lặp lại nhiều lần Kết quả sau cùng ta có thể thu nhận số lượng lớn bản sao trình tự DNA Tổng số DNA khuếch đại sau phản ứng PCR được tính theo công thức:

Tổng DNA khuếch đại = m * 2n

n: Số chu kỳ

2.5.2 Thành phần cơ bản của phản ứng PCR

 DNA bản mẫu (DNA template)

 Mồi xuôi (primer forward) và mồi ngược (primer reverse)  dNTPs (dATP, dTTP, dGTP, dCTP)

 Dung dịch đệm cho phản ứng PCR (PCR buffer)  MgCl2

 Taq DNA polymerase

 Hai đoạn mồi không có trình tự bổ sung lẫn nhau

 Độ dài của đoạn mồi là 17 - 25 nucleotide (cho PCR bình thường)

2.5.4 Ưu điểm và nhược điểm

 Ưu điểm: Cho kết quả nhanh, nhạy, đặc hiệu, chỉ cần một lượng mẫu nhỏ có

RFLP được định nghĩa là tính đa hình về chiều dài các đoạn cắt giới hạn, biểu hiện sự khác nhau về kích thước các phân đoạn DNA được cắt bằng các enzyme cắt giới hạn

Nguyên tắc của kỹ thuật này dựa trên độ đặc hiệu của enzyme cắt giới hạn đối với vị trí nhận biết của chúng trên DNA bộ gen DNA bộ gen được cắt bằng các enzyme cắt giới hạn, chạy điện di qua gel agarose, thấm qua màng lai và lai với một mẫu dò DNA (được đánh dấu phóng xạ) Sự khác biệt vị trí cắt giữa hai cá thể sẽ tạo ra các phân đoạn cắt khác nhau

Hình 2.5 Nguyên tắc của kỹ thuật RFLP

Chỉ thị RFLP có khả năng sử dụng rất phong phú, vì là chỉ thị đồng trội cho phép phân biệt được cá thể đồng hợp và dị hợp

Ưu điểm khi dùng RFLP:

 Thích hợp cho phân tích đa dạng di truyền đối với DNA có kích thước nhỏ  Chi phí áp dụng thấp

 Kỹ thuật này rất có ý nghĩa trong nghiên cứu dịch tễ học

Vị trí cắt

Đột biến = một vị trí cắt mới

Thấm tách

2.6.2 Chỉ thị RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)

Là phương pháp xác định sự đa hình về kích thước các đoạn DNA sau khi thực hiện PCR mẫu DNA thí nghiệm Kỹ thuật cho phép phát hiện thể đa hình mà không cần biết trước thứ tự các nucleotide bằng cách dùng các primer tổng hợp, đơn, ngắn chỉ khoảng 10 nucleotid, dãy mã được thiết kế ngẫu nhiên để thực hiện PCR Sau khi bắt cặp tại các vị trí chuyên biệt trên sợi DNA, primer tiến hành sự khuếch đại để tạo ra các đoạn có kích thước khác nhau, có khi lên tới 2 kb Các đoạn với kích thước khác nhau này được nhận biết bằng điện di Một primer có thể tạo nên sự đa hình DNA giữa các cá thể và các đoạn đa hình này có thể được dùng như những marker để xác định sự đa dạng di truyền RAPD được xem như một phương pháp tạo sự đa hình DNA nhanh và hữu hiệu là bước đầu đánh giá các tính trạng của sinh vật Các bộ kit primer dùng cho RAPD đã được thương mại hóa trên thị trường và các primer cũng rất dễ được tổng hợp Về trang thiết bị chỉ cần có máy PCR và hệ thống điện di Cần quan tâm đến yếu tố nồng độ DNA, điều kiện thí nghiệm, chương trình phản ứng PCR và cần lựa chọn primer thích hợp cho sự đa hình cao

Hình 2.6 Nguyên tắc của kỹ thuật RAPD Ưu điểm của phương pháp RAPD:

 Không đòi hỏi chất lượng DNA mẫu cao, lượng DNA mẫu cần ít

 Dễ thực hiện và dễ thành công do không cần biết trước trình tự bộ gene của đối tượng cần nghiên cứu, thao tác đơn giản

 Thời gian thực hiện nhanh Khả năng nhân bản cao

Điện di sản phẩm PCR

Vị trí bắt cặp primer

Sản phẩm khuếch đại Nhiễm sắc thể

 Chi phí thực hiện thấp Kỹ thuật RAPD thường được sử dụng kết hợp với những kỹ thuật cao cấp khác để đánh giá đa dạng di truyền và nhận diện chỉ thị phân tử có độ tin cậy cao

Nhược điểm:

 Độ chính xác không cao, kết quả không ổn định

 Khả năng nhân bản trong phản ứng PCR cao nhưng khả năng xuất hiện đa hình thấp và độ tin cậy không cao Khả năng nhận diện chỉ thị phân tử thấp

Ứng dụng:

 Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của quần thể  Đánh giá sự tương quan di truyền giữa các cá thể  Chọn giống

2.6.3 Chỉ thị AFLP

Phương pháp AFLP được xây dựng bởi công ty KeyGene và là phương pháp kết hợp giữa RFLP và RAPD Phương pháp AFLP bao gồm các giai đoạn

 Tách chiết DNA

 Cắt DNA bằng enzyme giới hạn

 Nối trình tự các đoạn DNA được cắt với các adapter  Khuếch đại các đoạn cắt giới hạn

 Chạy điện di các đoạn khuếch đại trên gel polyarylamide hay gel agarose Ở phương pháp này mồi được thiết kế dựa trên trình tự adapter và được gắn thêm 1 nucleotide chọn lọc ở đầu 3’, gọi là primer+1: Là primer tiền chọn lọc Adapter gắn 2 - 3 nucleotide thì gọi là primer chọn lọc Một nucleotide chọn lọc có thể là A, C, G, T Hai nucleotide chọn lọc là những tổ hợp của A, C, T, G như là: AA, AG, AT,… Ba nucleotide có thể là: AAA, ATG, ACC,…

DNA mẫu được khuếch đại hai giai đoạn:

 Giai đoạn 1: Giai đoạn khuếch đại tiền chọn lọc với primer+1  Giai đoạn 2: Giai đoạn khuếch đại chọn lọc với primer+2(3)

Sự chọn lọc ở đây có ý nghĩa:

 Chỉ những trình tự DNA nào gắn với adapter mới được khuếch đại

 Sự khuếch đại tiền chọn lọc giúp chọn lọc bước đầu các trình tự DNA cần được khuếch đại

 Sự khuếch đại chọn lọc giúp chọn lọc chặt chẽ hơn các trình tự DNA cần được khuếch đại

Trong phương pháp AFLP việc ly trích thành phần DNA là khâu hết sức quan trọng, để mà có được DNA tinh khiết ít bị tạp nhiễm Cùng với đó những thành phần làm dung dịch đệm cho enzyme cắt và enzyme gắn cũng quyết định sự thành công của kỹ thuật này Sự thiết kế mồi dựa trên các adapter, mồi được thiết kế phải phù hợp sao cho có sự cân đối giữa các thành phần theo tỷ lệ:

%G + C = 60%, kích thước 17 – 28 base = L Tm = 59,9 + 0,41*(%G,C) – 600/L

Tanneal = Tm-primer - 40C Tm-product – Tanneal >= 300C

Tm: Nhiệt độ nóng chảy Tanneal: Nhiệt độ bắt cặp

Tm-primer: Nhiệt độ nóng chảy của mồi

Tm- product : Nhiệt độ nóng chảy của sản phẩm

Ưu điểm:

 Lượng DNA cần dùng ít

 Tạo nhiều band khuếch đại khả năng đa hình cao  Kết quả có độ tin cậy cao, có khả năng lặp lại  Không cần biết trước trình tự genome

Nhược điểm:

 Chi phí cao

 Không kiểm soát hết sự bắt cặp của các adapter  Enzyme cắt và gắn có thể hoạt động không tốt  Cần chất lượng DNA mẫu cao

Ứng dụng của phương pháp này:

 Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của quần thể  Đánh giá sự tương quan di truyền giữa các cá thể  Lập bản đồ di truyền, chọn giống

Chương 3

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM

3.1 Nội dung đề tài

Đề tài được thực hiện với hai nội dung sau:

 Thu thập mẫu cây mắm đen tại rừng ngập mặn Cần Giờ

 Đánh giá sự đa dạng di truyền của quần thể cây mắm đen bằng kỹ thuật RAPD

3.2 Thời gian thực hiện đề tài

Thời gian bắt đầu thực hiện đề tài từ ngày 1 tháng 5 năm 2007 đến ngày 1 tháng

9 năm 2007 tại rừng ngập mặn Cần Giờ và phòng CNSH thực vật của Trung tâm Phân

tích Thí nghiệm Hóa sinh Trường Đại học Nông Lâm Tp HCM

 Mỗi cây lấy khoảng 5 - 10 lá, cho vào bịch nylon và để vào thùng lạnh để bảo quản độ tươi của lá Đồng thời ghi đầy đủ những thông tin của cây được lấy mẫu

 Mẫu sau khi lấy được cho vào thùng lạnh để bảo quản tạm thời Sau đó, nên chuyển ngay về phòng thí nghiệm cho vào tủ lạnh -200C

3.3.2 Hóa chất thí nghiệm

3.3.2.1 Các hóa chất dùng trong ly trích DNA

 Chloroform:Isoamyl alcohol = 24:1  Polyvinyl pyrrolidone (PVP)

 Sodium acetat 3 M  Ethanol 100%  Isopropanol  Ethanol 70%

Tris – HCl 1 M Nước

3.3.2.3 Hóa chất dùng trong định tính DNA

 Agarose

 Ethidium bromide  TAE

3.3.2.4 Hóa chất dùng để cho phản ứng RAPD-PCR  PCR buffer

- Máy vi ly tâm lạnh (Hettich - Đức) - Máy điện di (Biorad) - Nồi hấp Autoclave (ToMy - Nhật Bản) - Lò Viba (Electrolux) - Máy chụp ảnh DNA (Biorad-Thụy Điển) - Đầu típ các loại (Đức) - Máy đo hấp thu quang phổ (HP - Mỹ) - Máy PCR (PTC 100 - MJ)

- Tủ lạnh các loại (Sanyo - Nhật Bản) - Eppendorf 1,5 ml và 0,2 ml (Pháp)