Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của nấm Metarhizium anisopliae dựa vào trình tự gen Pr1 và vùng rDNA-ITS

Trang 1

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

*************

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CƢ́U SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA NẤM

Metarhizium anisopliae DƢ̣A VÀO TRÌNH TƢ̣

GEN Pr1 VÀ VÙNG rDNA-ITS

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa : 2003 - 2007

Sinh viên thƣ̣c hiê ̣n: TRẦN NHẬT NAM

Thành phố Hồ Chí Minh

Tháng 9/2007

Trang 2

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

*************

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA NẤM

Metarhizium anisopliae DỰA VÀO TRÌNH TỰ

GEN Pr1 VÀ VÙNG rDNA-ITS

Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiê ̣n:

TS LÊ ĐÌNH ĐÔN

Thành phố Hồ Chí Minh

Tháng 9/2007

Trang 3

iii

LỜI CẢM ƠN

 Con xin cảm ơn Ba Mẹ cùng gia đình đã nuôi con đến ngày khôn lớn và cho con ăn học thành tài

Em xin chân thành cảm ơn:

 Các Thầy Cô trong trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh đã tận tình truyền đạt kiến thức cho em trong suốt 4 năm học

 Ban chủ nhiệm cùng các Thầy Cô trong Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học đã động viên, giúp đỡ em trong thời gian thực hiện khóa luận

 TS Lê Đình Đôn, ThS Võ Thị Thu Oanh , CN Lưu Phúc Lợi đã tận tình chỉ dẫn em trong suốt quá trình thực hiện khóa luận

 Anh Nguyễn Văn Lẫm đã hết lòng hướng dẫn em trong quá trình thực hiện khóa luận

 Các anh chị trong Trung tâm Phân tích và Thí nghiệm Hóa sinh đã động viên, chia sẻ kinh nghiê ̣m và giúp đỡ em trong quá trình thực hiện khóa luận

 Xin cám ơn cuô ̣c sống đã đem la ̣i cho tôi những người ba ̣n , những người đã cùng tôi chia sẻ và động viên tôi trong suốt quá trình thực hiê ̣n khóa luâ ̣n

Xin chân thành cảm ơn!

TRẦN NHẬT NAM

Trang 4

Đối tượng nghiên cứu là nấm Metarhizium anisopliae ký sinh trên côn trùng gây

hại Đây là giống nấm có hoa ̣t tính tiêu diê ̣t côn trùng ma ̣nh Mục đích đề tài nhằm nghiên cứu sự đa da ̣ng về mă ̣t di truyền giữa các dòng nấm dựa trên cơ sở trình tự

nucleotide của gen Pr1 và vùng rDNA-ITS

Kết quả thu được như sau:

- Xác định được những dòng nấm Metarhizium anisopliae sử du ̣ng trong nghiên

cứu thuô ̣c dòng Metarhizium anisopliae var anisopliae

- Phát hiện gen Pr1 ở trên 10 dòng nấm Metarhizium anisopliae Tiến hành giải

trình tự gen Pr1 của10 mẫu nấm Kích thước của gen Pr1 ở 7 mẫu nấm là 1091bp

- Có sự khác biệt về mă ̣t di truyền giữa các dòng Metarhizium anisopliae trong

nước và giữa các dòng trong nước với các dòng trên genbank Tỉ lệ tương đồng giữa các dòng trong nước khoảng 95-100%, và giữa các dòng trong nước so với các dòn g

trên thế giới là 94-99% khi so sánh trình tự gen Pr1

- Phát hiện được 4 vị trí đột biến ở 2 dòng BXDTG và RBCQ 9 so vớ i những dòng còn lại Những đô ̣t biến này đều xảy ra ở vùng ITS 1

- Có sự bảo tồn cao trong vùng 5.8S và vùng ITS2 giữa những dòng nấm Metarhizium

anisopliae được sử du ̣ng trong đề tài Tỉ lệ tương đồng giữa những dòng trong nước là 100% và giữa các dòng trong nước với các dòng trên genbank là 92-100% khi so sánh trình tự vùng rDNA-ITS

Trang 5

Danh sách các chữ viết tắt viii

Danh sách các bảng ix

Danh sách các hình x

1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu và yêu cầu đề tài 2

1.2.1 Mục tiêu 2

1.2.2 Yêu cầu đề tài 2

1.3.Đối tượng nghiên cứu 2

2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Giớ i thiê ̣u nấm Metarhizium anisopliae 3

2.2 Sơ lược về phương thức xâm nhiễm của nấm ký sinh trên côn trùng 6

2.3 Hoạt tính sinh học 7

2.4 Hiệu quả phòng trừ sâu hại bằng chế phẩm nấm

2.5 Một số nghiên cứu trong nước và ngoài nước về nấm Metarhizium anisopliae và những nấm ký sinh côn trùng khác ứng dụng để phòng trừ sâu hại 8

2.5.1 Nghiên cứu trong nước 8

2.5.2 Nghiên cứu ngoài nước 9

2.6 Giớ i thiê ̣u gen Pr1 10

2.7 Vai trò của Protease Pr1 10

Trang 6

vi

2.8.Tổng quan về ITS-rDNA 10

2.8.1 Giớ i thiê ̣u về vùng rDNA và vùng ITS 10

2.9 Một số nghiên cứu trong nước và nước ngoài về sự đa da ̣ng của nấm Metarhizium anisopliae dựa vào gen Pr1 và vùng rDNA-ITS 12

2.9.1 Nghiên cứ u nước ngoài 12

2.9.2 Nghiên cứ u trong nước 14

2.10 Phương pháp phát hiê ̣n gen Pr1 và vùng rDNA-ITS 14

3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

3.1 Thời gian và địa điểm 16

3.2.3 Các thiết bị chính 17

3.3 Nội dung nghiên cứu 18

3.4 Phương pháp nghiên cứu 18

3.4.1.Kiểm tra DNA tổng số được ly trích từ các dòng nấm Metarhizium anisopliae 18

3.4.2 Khuếch đại gen Pr1 18

3.4.3 Khuếch đại vùng rDNA-ITS 21

3.5 Tiến hành giải trình tự gen gây đô ̣c Pr1 và vùng ITS 22

3.6 Tinh sa ̣ch sản phẩm PCR 22

3.7 Tinh sạch sản phẩm đọc trình tự 24

3.8 Phương pháp phân tích trình tự 24

4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26 4.4 DNA của các mẫu nấm Metarhizium anisopliae được dùng trong nghiên

Trang 7

vii

cƣ́u 26

4.5 Kết quả tinh sa ̣ch DNA tổng số 28

4.6 Kết quả khuếch đa ̣i vùng ITS1-5.8S-ITS2 28

4.7 Kết quả giải trình tƣ̣ vùng ITS1-5.8S-ITS2 29

4.8 Kết quả khuếch đại gen Pr1……… 36

4.9 Kết quả đo ̣c trình tƣ̣ gen Pr1………36

5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 42

5.4 Kết luận 42

5.4.2 Phát hiện và đọc trình tự gen Pr1 42

5.4.3 Phát hiện và đọc trình tự vùng rDNA-ITS 42

5.5 Đề nghị 43

5.6 Hạn chế của đề tài 43

6 TÀI LIỆU THAM KHẢO 44

7 PHỤ LỤC 47

Trang 8

viii

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Trang 9

Bảng 3.3 Thành phần của phản ứng PCR khuếch đại gen Pr1 vớ i că ̣p primer METPR2/METPR5 20

Bảng 3.4 Thành phần của phản ứng PCR khuếch đại gen vùng rDNA-ITS 21 Bảng 3.5 Thành phần của phản ứng đọc trình tự 23

Bảng 4.1 Các nguồn nấm Metarhizium anisopliae trên genbank được dùng để so sánh trình tự vùng rDNA-ITS 30

Bảng 4.2 Ma trâ ̣n khoảng cách giữa các dòng nấm Metarhizium anisopliae trong

nước khi dựa vào trình tự vùng rDNA-ITS 31 Bảng 4.3 Ma trận khoảng cách giữa các dòng nấm Metarhizium anisopliae trong

nước và trên thế giới dựa vào trình tự vùng rDNA-ITS 33

Bảng 4.4 Các nguồn nấm Metarhizium anisopliae trên genbank đươ ̣c dùng để so sánh trình tự gen Pr1 37

Bảng 4.5 Ma trâ ̣n khoảng cách giữa các dòng nấm Metarhizium anisopliae trong nước khi dựa vào trình tự gen Pr1 38

Bảng 4.6 Ma trận khoảng cách giữa các dòng nấm Metarhizium anisopliae trong nước và trên thế giới dựa vào trình tự gen Pr1 40

Trang 10

Hình 2.2 Sơ đồ của các vùng trên rDNA 12

Hình 3.1 Sơ đồ primer đươ ̣c sử du ̣ng để khuếch đa ̣i gen Pr1 18

Hình 3.2 Sơ đồ primer đươ ̣c sử du ̣ng để khuếch đa ̣i vùng ITS 21

Hình 3.3 Những phương pháp được sử du ̣ng trong phân tích trình tự 24

Hình 3.4 Sơ đồ phân tích trình tự có đô ̣ tương đồng cao 25

Hình 4.1 DNA tổng số của nấm Metarrhizium anisopliae 26

Hình 4.2 Sơ đồ tinh sa ̣ch DNA tổng số của các mẫu nấm Metarhizium anisopliae được sử du ̣ng trong nghiên cứu 27

Hình 4.3 DNA tổng số của nấm Metarhizium anisopliae được tinh sa ̣ch 28

Hình 4.4 Hình khuếch đại vùng rDNA-ITS 28

Hình 4.5 Cây phát sinh loài giữa các dòng Metarhizium anisopliae trong nước dựa vào trình tự vùng rDNA-ITS 32

Hình 4.6 So sánh quan hê ̣ giữa các dòng Metarhizium anisopliae trong nước và trên thế giới dựa vào trình tự vùng rDNA-ITS 34

Hình 4.7 Hình khuếch đại gen Pr1 36

Hình 4.8 Cây phát sinh loài giữa các dòng Metarhizium anisopliae trong nước dựa vào trình tự gen Pr1 39

Hình 4.9 So sánh quan hê ̣ giữa các dòng Metarhizium anisopliae trong nước và trên thế giới dựa vào trình tự gen Pr1 41

Trang 11

Chương 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Nông nghiệp đóng vai trò quan trọng trong nền kinh tế nước ta Trong sản xuất nông nghiệp người nông dân gặp rất nhiều khó khăn, trong đó khó khăn lớn nhất là việc phòng trừ và tiêu diệt các loại côn trùng gây hại cho cây trồng Hiện nay trên thị trường xuất hiện rất nhiều loại thuốc hóa học dùng trong nông nghiệp.Tuy nhiên việc sử dụng những sản phẩm này trong một thời gian dài cộng với liều lượng ngày càng tăng đã và đang ảnh hưởng nặng nề đến môi trường, làm xuất hiện nhiều loại sâu bệnh và côn trùng kháng thuốc, làm giảm chất lượng đất.Và nguy hiểm hơn cả là việc thuốc trừ sâu xuất hiện trong sản phẩm sau khi thu hoạch đã ảnh hưởng trực tiếp tới sức khỏe người tiêu dùng Trước thực trạng này các nhà khoc học đã nghiên cứu và đưa ra phương pháp mới trong việc phòng trừ và tiêu diệt các loài gây hại cho côn trùng Một trong những phương pháp đó là kiểm soát sinh học thông qua việc sử dụng các chế phẩm có nguồn gốc từ nấm, virus, vi khuẩn hoặc sử dụng ký sinh thiên địch, các hợp chất thứ cấp có nguồn gốc thảo mộc để phòng trừ và tiêu diệt các loài côn trùng gây hại một cách hiệu quả và an toàn hơn

Trong các loại vi sinh vật gây hại cho côn trùng đáng chú ý nhất là ngành phụ

nấm bất toàn mà đại diện tiêu biểu là nấm Metarhizium anisopliae-một trong những loài có đặc tính diệt côn trùng mạnh nhất Trên thế giới nấm Metarhizium anisopliae là

đối tượng nghiên cứu của rất nhiều công trình khoa và đã được thương mại hóa từ lâu – như là một loại thuốc trừ sâu sinh học trong công tác phòng chống một số loại côn trùng gây hại trên nhiều loại cây trồng khác nhau

Trang 12

Trước đây việc nghiên cứu về đa dạng sinh học chỉ dừng lại ở mức độ đánh giá hình thái nên còn nhiều hạn chế Ngày nay với sự ra đời của nhiều kĩ thuật mới như kĩ thuật PCR và những ứng dụng từ PCR như RAPD, RFLP, AFLP, Southern blot, Sequence v.v đã giúp cho quá trình nghiên cứu nhanh và chính xác hơn.Tuy nhiên những nghiên cứu như vậy ở nước ta còn rất ít

Xuất phát từ những đặc điểm trên, được sự cho phép và phân công của Bộ môn Công Nghệ Sinh Học chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu sự đa dạng

di truyền của nấm Metarhizium anisopliae dựa vào trình tự gen Pr1 và vùng

rDNA-ITS “

1.2 Mục tiêu và yêu cầu đề tài 1.2.1.Mục tiêu

Nghiên cứu sự đa da ̣ng di truyền của những dòng nấm Metarhizium anisopliae

đươ ̣c phân lâ ̣p trên nhiều đối tượng cây trồng khác nhau ở các tỉnh th ành trên cả nước

dựa vào trình tự của gen gây đô ̣c Pr1 và vùng rDNA-ITS

1.2.2 Yêu cầu đề tài

- Kiểm tra DNA được ly trích từ những dòng nấm Metarhizium anisopliae

đươ ̣c sử du ̣ng trong nghiên cứu

- Xác định gen gây độc Pr1 và vùng rDNA-ITS bằng kỹ thuâ ̣t PCR

- Xác định trình tự gen Pr1 và vùng rDNA -ITS và tìm sự khác biê ̣t về trình tự

giữa các dòng nấm Metarhizium anisopliae

1.3 Đối tượng nghiên cứu

Nấm Metarhizium anisopliae thu thập ở các tỉnh thành khác nhau như: Long

An, Trà Vinh, Tây Ninh, Bến Tre, Bình Đi ̣nh, Quận 9 thành phố Hồ Chí Minh gây hại cho côn trùng trên các đối tượng cây trồng khác nhau

Trang 13

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu nấm Metarhizium anisopliae

Bảng 2.1: Giới thiệu nấm Metarhizium anisopliae

Kingdom (Giới) Fungi Phylum (Ngành) Ascomycota

Class (Lớp) Sordariomycetes

Order (Bộ) Hypocreles

Family (Họ) Clavicipitaceae Genus (Giống) Metarhizium

Species (Loài) Metarhizium anisopliae

Nấm này được Metschinikov phát hiện đầu tiên vào năm 1878 trên bọ hung hại lúa mì Nấm thường gây bệnh cho côn trùng sống trong đất, thuộc vi sinh vật đất trong tự nhiên Bào tử của nấm sau 24 giờ tiếp xúc với bề mặt cơ thể côn trùng thì bắt đầu mọc mầm và xâm nhập vào bên trong Trong cơ thể côn trùng sợi nấm phát triển xâm nhập vào các bộ phận nội quan Sau khi vật chủ chết, sợi nấm mọc ra ngoài cơ thể côn trùng tạo thành lớp nấm màu trắng hơi hồng nhạt Trên đó tạo thành các khuẩn lạc màu xanh xám Quá trình phát triển của bệnh trong cơ thể côn trùng là 4 – 6 ngày tùy thuộc vào loài và tuổi vật chủ cũng như nguồn bệnh ban đầu Vào giai đoạn cuối cùng của quá trình phát triển bệnh lý thì côn trùng chết

Trang 14

Nấm Metarhizium anisopliae có 2 dạng chính: M anisopliae var major có bào tử dài với kích thước bào tử túi 10,0 – 14,0 (18,0) m và M anisopliae var anisopliae

có bào tử ngắn với kích thước bào tử túi là 3,5 – 9,0 (thường 5,0 – 8,0) m Nấm xanh

(nấm Metarrhizium anisopliae) sinh ra các độc tố destruxin A và B (Bùi Xuân Đồng,

Nguyễn Huy Văn, 2000)

Nấm Metarhizium anisopliae ký sinh trên 200 loài côn trùng thuộc các bộ:

Orthoptera (11 loài), Dermaptera (1 loài), Hemiptera (21 loài), Lepidoptera (27 loài), Diptera (4 loài), Hymenoptera (6 loài) và Coloptera (134 loài) Nấm xanh có thể nuôi cấy trên môi trường thức ăn nhân tạo

Metarhizium anisopliae là chủng gây bệnh mạnh nhất cho côn trùng thuộc bộ

Coleoptera Hơn 204 loài côn trùng thuộc họ Elaleridae và Curculionidae bị nhiễm

bệnh bởi Metarhizium anisopliae (Nguyễn Ngọc Tú và Nguyễn Cửu Thị Hương

Giang, 1997)

Ngoài ra Metarhizium anisopliae còn gây bệnh trên ấu trùng muỗi Aedes aegypti, Anopheles stephensi và Clex pipiens thuộc Diptera, côn trùng hại lúa Scotinophara coarctata thuộc họ Heminoptera, châu chấu Schistocera gragaria thuộc họ Testigolidae, loài mối Nasutitermes exitiosus thuộc họ Termitidae Nấm này phân

bố rộng trong tự nhiên

M anisopliae với bào tử dạng trụ và khuẩn lạc xanh đen hoặc đôi khi màu tối

hoặc hồng vỏ quế Khuẩn lạc mọc chậm, trên môi trường OA sau 10 ngày nuôi cấy ở 20oC có đường kính 2 cm

Đã có nhiều nghiên cứu về sự phân bố của chúng: Nepal, New Zealand, New Caledonia, Bahamas, Mỹ, Canada, Bắc Ireland, Italia, Turkey, Liên Xô (cũ) Ở những

nơi không có côn trùng cũng phân lập được Metarhizium anisopliae: nang của Nematod (Heterodenas chachatii và Globodera rostochensis), các hạt ngoài đồng và

trong đất trồng ở Canada, đất trồng chuối ở Honduras, đất trồng dâu ở Braril, đất trồng cỏ ở New Zealand Ngay ở những nơi có thời tiết khắc nghiệt của nước Đức, ở đất

Trang 15

rừng sau khi đốt cháy, trong chất thải hữu cơ (chuẩn bị ô nhiễm), trầm tích cửa sông, đất đầm lầy trồng cây đước, tổ của một số loài chim và rễ của dâu tây cũng đều phân

lập được Metarhizium anisopliae

Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của nấm Metarhizium anisopliae:

- Không thể sinh trưởng tốt trên nền cơ chất không có chitin

- Sống được ở nhiệt độ thấp (8oC), biên độ của độ ẩm rộng, ở nơi tích lũy nhiều CO2 và O2 chúng có thể sống sót tới 445 ngày Khi hoại sinh trong đất, bào tử

dính bị ức chế nảy mầm bởi khu hệ nấm đất, trong đó có chủng Aeromonas (thí nghiệm in vitro)

- Ở dưới 10oC và trên 35oC thì sự hình thành bào tử không thể xảy ra

- Nhiệt độ tốt nhất cho sự nảy mầm bào tử là 25 – 30oC và chết ở 49oC trong 10 phút

- Nhiệt độ tốt nhất cho sự sinh trưởng là 25oC và pH 3,3 – 8,5

- Metarhizium anisopliae có khả năng phân giải tinh bột, cellulose và kitin

(lông và da côn trùng) (Trần Văn Mão, 2004)

Hình 2.1: Nấm Metarhizium anisopliae ký sinh trên những côn trùng khác nhau

Trang 16

2.2 Sơ lược về phương thức xâm nhiễm của nấm ký sinh trên côn trùng

Hầu hết những loài nấm gây bệnh cho côn trùng đều xâm nhập vào cơ thể vật chủ không qua đường miệng, mà qua lớp vỏ cơ thể, nghĩa là phải có sự tiếp xúc của nguồn nấm với bề mặt cơ thể vật chủ Bào tử nấm bám vào bề mặt cơ thể vật chủ, trong điều kiện đủ độ ẩm bào tử mọc mầm và xâm nhiễm vào bên trong cơ thể côn trùng qua lớp vỏ chitin nhờ áp lực cơ giới hoặc hoạt động men của nấm Nấm tiết ra loại men làm mềm lớp vỏ chitin và tạo thành một lỗ thủng tại nơi bào tử mọc mầm, qua lỗ thủng dó bào tử xâm nhập vào bên trong cơ thể côn trùng Do khả năng xâm nhập vào bên trong cơ thể côn trùng qua lớp vỏ cơ thể nên nấm có thể ký sinh được côn trùng chích hút và cả những pha phát triển của côn trùng như trứng, nhộng mà các vi sinh vật khác không ký sinh được

Nấm cũng có thể xâm nhập vào bên trong cơ thể côn trùng qua đường miệng Từ miệng, bào tử đi tới ruột và qua thành ruột xâm nhiễm vào các tế bào nội quan để gây bệnh Xâm nhiễm kiểu này chủ yếu là bào tử của các loài nấm ở nước Dưới tác động của độc tố do bào tử nấm tiết ra có thể dẫn tới hiện tượng ngừng nhu động ruột

của vật chủ Thí dụ, trường hợp bào tử nấm Aspergillus trong ruột ong mật Bào tử

nấm còn có thể xâm nhập qua lỗ thở hoặc cơ quan sinh dục để vào bên trong cơ thể côn trùng nhưng rất ít

Sự xâm nhiễm và phát triển của nấm trong cơ thể côn trùng là một quá trình phức tạp, gồm 3 giai đoạn chính sau đây

Sự xâm nhập

Nấm ký sinh côn trùng có thể xâm nhập vào cơ thể côn trùng bằng sự xâm nhập trực tiếp qua lớp cutin, theo cách này thì nấm tiết ra enzyme phân hủy lớp cutin để có thể xâm nhập vào bên trong cơ thể côn trùng Ngoài ra nấm ký sinh côn trùng còn có thể xâm nhập gián tiếp vào cơ thể vật chủ qua thành ống tiêu hoá, qua lổ thở, qua vết

thương trên cơ thể côn trùng

Trang 17

Sự phát triển của nấm tới khi côn trùng chết

Sau khi xâm nhập vào cơ thể côn trùng thì chúng bắt đầu sinh sôi nảy nở bên trong cơ thể côn trùng và côn trùng chết trong khoảng 3 tuần

Sự sinh trưởng và phát triển của nấm sau khi côn trùng vật chủ chết

Sau khi côn trùng chết, nấm tiếp tục phát triển hình thành lớp bào tử bao phủ toàn bộ bề mặt ngoài của vật chủ Lớp bào tử này ban đầu có màu trắng sau chuyển qua màu xanh lục

Các nấm gây bệnh cho côn trùng chỉ sinh trưởng phát triển để hoàn thành một chu kỳ sống của chúng: từ mọc mầm bào tử đến hình thành bào tử mới Nấm gây bệnh côn trùng có tính chuyên tính hẹp, chỉ ký sinh một vật chủ hoặc một giai đoạn nhất định của vật chủ Nhiều trường hợp chúng là ký sinh có tính chuyên hóa thức ăn rộng, có thể ký sinh nhiều loài côn trùng thuộc các giống, họ, bộ khác nhau

Để có thể gây được những dịch bệnh nấm lớn cho sâu hại, các đặc điểm của nấm đóng một vai trò quan trọng là: độc tính của nấm, khả năng di chuyển bào tử trong những điều kiện không thuận lợi và khả năng phát tán trong thiên nhiên Đặc điểm đặc biệt đối với các nấm họ Entomophthoraceae đó là hoạt động bắn bào tử xa một khoảng cách gấp hàng nghìn lần kích thước của nó Điều đó tạo khả năng phát tán rộng lớn hơn trong quần thể côn trùng Sự phát tán có hiệu quả cao hay không ở mức độ nhất định cũng phụ thuộc vào độ nhất định cũng phụ thuộc vào

2.3 Hoạt tính sinh học

Theo nhiều tài liệu của nhiều tác giả cho biết các nấm Muscardine (ví dụ nấm

Muscardine trắng: Beauveria bassiana, nấm Muscardine xanh : Metarhizium anisopliae có khả năng tổng hợp một lượng lớn các enzyme.Trong đó có ý nghĩa lớn

nhất có khả năng gây bệnh cho côn trùng có chitinase, proteinase, lipase và amylase

2.4 Hiệu quả phòng trừ sâu hại bằng chế phẩm nấm

Nấm Metarhizium anisopliae và Beauveria được nghiên cứu sản xuất để trừ

một số sâu hại quan trọng trong nông nghiệp Hiệu quả của chế phẩm đã thử đối với

Trang 18

rầy nâu, sâu đo đay, châu chấu xanh, châu chấu ở điều kiện trong phòng thí nghiệm và ở nhà lưới Chế phẩm có tác dụng giảm tỷ lệ rầy nâu 55,2 – 58,8%, rầy lưng trắng 64 – 92%, rầy xanh 75 – 96% và sâu đo xanh hại đay 43,9 – 64,2% Hiệu lực diệt các loài

rầy hại lúa trên đồng ruộng của nấm Beauveria bassiana biến động từ 33 – 75% tùy

theo vụ và năm khác nhau Hiệu lực của nấm kéo dài 3- 4 tuần sau khi phun nấm, vì vậy chỉ cần phun nấm một lần trong một vụ là đủ để quản lý các loài rầy hại lúa trong

vụ Dùng nấm B bassiana để quản lý các loài rầy hại lúa đã làm tăng năng suất từ 19 – 95% so với đối chứng (tùy theo từng vụ và từng năm) Nấm B bassiana không gây

ảnh hưởng gì cho lúa và cũng không gây hại đối với các thiên địch sâu, gầy hại lúa (Trần Văn Mão, 2004)

Nấm M anisopliae có khả năng gây bệnh làm chết 84,6% châu chấu Nomadacris succincta sau 10 ngày xử lý và nấm M flavoviride gây chết 100% châu

chấu thí nghiệm sau 7 ngày Chế phẩm nấm diệt châu chấu được tiến hành ở Bà Rịa – Vũng Tàu, Đồng Nai cho kết quả tương đối tốt nhưng không đều (Trần Văn Mão, 2004)

2.5 Một số nghiên cứu trong nước và ngoài nước về nấm Metarrhizium anisopliae

và những nấm ký sinh côn trùng khác ứng dụng để phòng trừ sâu hại 2.5.1 Nghiên cứu trong nước

Lần đầu tiên tại Bến Tre, Phạm Thị Thuỳ (2000) đã sử dụng nấm Metarhizium để trừ bọ dừa, kết quả ban đầu cho thấy nấm Metarhizium sau khi đã thử nghiệm trong

phòng, trong nhà lưới và ngoài đồng có hiệu quả đối với bọ dừa ở Bến Tre

Tạ Kim Chỉnh và ctv (2001), đã chọn được môi trường nhân giống cho các

chủng Metarhizium anisopliae là môi trường Saubouraund có bổ sung vỏ trấu

Bùi Xuân Đồng và Nguyễn Huy Văn (2000) đã thử nghiệm chế phẩm B.75 từ

Beauveria bassiana dạng bột để phòng trừ sâu róm hại cây thông và cho biết sâu chết

80% sau một năm xử lý Nguyễn Thị Lộc và ctv (2004) đã thử nghiệm , sản xuất và

Trang 19

ứng dụng chế phẩm nấm ký sinh để phòng trừ sâu hại lúa ở Đồng Bằng Sông Cửu Long

Ngoài ra, ở nước ta cũng tiến hành nghiên cứu nấm gây bệnh trên các loài sâu hại đậu nành Theo Tống Kim Thuần, Vũ Quang Côn (2001), các vi nấm có khả năng

gây bệnh sâu hại trên đậu tương chủ yếu là các loài sau: Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae và Normurea rileyi Chúng gây bệnh hầu hết các loài sâu hại

thuộc bộ cánh vảy – Lepidoptera, Entomophthora sp gặp ở bộ cánh nửa cứng – Hemiptera

2.5.2 Nghiên cứu ngoài nước

Trên thế giới, việc sử dụng nấm trong đấu tranh chống sâu hại có lịch sử khá lâu đời, Meschnikoff (1884) là người đầu tiên trình bày vấn đề sử dụng nấm trong đấu tranh sinh học với sâu hại (Nguyễn Ngọc Tú và Nguyễn Cửu Thị Hương Giang, 1997) Theo Juntin L Hatting, Richard A Humber, Tadeusz J Poprawsski và Ray M.Miller (1999), các nghiên cứu về các nấm gây bệnh rầy mềm ở Nam Phi được định hướng từ 1995-1998, và cho biết trong 8 loài nấm được tìm thấy đều lan truyền và giết

chết rầy mềm, gồm 6 loài thuộc Entomophthorales (Pandora neoaphidis, connidiobolus thromboides, C.coronatus, Entomophthora planchoniana và neozygites fresenii) và hai loài thuộc Hyphomycetes (Beauveria basssiana, Verticillium lecanii)

Theo A.M Kammp và M J Bidochka (1994), tiến hành đánh giá sự sản xuất

bào tử của 3 loại nấm gây bệnh côn trùng Metarrhizium anisopliae, Beauveria bassiana và Verticillium lecanii được đánh giá ở các độ sâu khác nhau (2mm, 3mm,

4mm tương ứng với 10ml, 15ml, 20ml) và các loại môi trường khác nhau (SDA, MEA, NA, CMA, YPDA, PDA) và cho biết sự sản xuất bào tử sau 14 ngày của nấm

Metarhizium anisopliae và Beauveria bassiana tốt nhất trong môi trường PDA ở độ sâu 2mm, trong khi Verticillium lecanii sản xuất bào tử tốt nhất trên môi trường YPDA

và độ sâu của môi trường thì không đáng kể

Trang 20

Theo Nguyễn Ngọc Tú và Nguyễn Cửu Thị Hương Giang (1997), thì Codaira

Y (1961) đã tách được hai độc tố ở nấm Metarhizium anisopliae là destruxin A, liều

gây chết với tầm là 0,28kg/g trọng lượng cơ thể và destruxin B, liều gây chết là 0,34kg/g trọng lượng cơ thể

2.6 Giới thiệu gen Pr1

Những nấm gây bệnh trên côn trùng xâm nhập vào côn trùng bằng cách xâm nhập trực tiếp qua lớp cutin Chúng sản xuất những enzyme ngoại bào ảnh hưởng trực

tiếp lên lên lớp vỏ bọc của côn trùng Nấm Metarhizium sản xuất một protease subtilisinlike ngoại bào được gọi là Pr1 Pr1 gây thoái hoá protein của lớp cutin Pr1

được tổng hợp như là một tiền chất lớn (40.3 kDa) chứa một peptide tín hiệu, một tiền

peptide và một protein hoàn thiện Cấu trúc sơ cấp của Pr1 có độ tương đồng lớn

(30-60%) với những enzyme của phân lớp subtilisin của serine endopeptidase và serine, histidine và aspartyl

2.7 Vai trò của protease Pr1

Những enzyme tác nhân gây bệnh hội tụ ngoài tế bào có thể làm suy thoái cấu trúc polymer của biểu bì (protein, chitin và lipid) trong suốt giai đoạn phát sinh bệnh, giúp cho quá trình thâm nhập của nấm được dễ dàng và cung cấp những dinh dưỡng cho nấm phát triển nhanh hơn Sản phẩm của những enzyme làm phân hủy biểu bì này thì thường được phân lập bởi sự nuôi cấy trên môi trường chứa biểu bì hoặc chitin (Raymond và ctv, 1995)

2.8 Tổng quan về ITS-rDNA

2.8.1 Giới thiệu về vùng rDNA và vùng ITS

rDNA là nhóm gene mã hoá rRNA của ribosome và đóng vai trò quan trọng trong các nghiên cứu quan hệ phát sinh loài rDNA được nghiên cứu vì nó là gen có nhiều bản sao và đặt biệt không mã hoá cho bất kỳ protein nào Các bản sao của gen nằm liên tiếp trên một locus và liên quan mật thiết tới quá trình tiến hoá Ribosome hầu như tồn tại trong mọi sinh vật và có cùng nguồn gốc Phần lớn phân tử rDNA tương

Trang 21

đối bảo tồn nên được xem là cơ sở để tìm ra sự tương đồng và các khác biệt khi so sánh các sinh vật khác nhau Các primer thiết kế dựa trên những Oligonucleotide có tính bảo tồn cao được sử dụng cho tất cả sinh vật nhằm khuếch đại các vùng tương đương dùng trong so sánh Ngoài ra, nhiều primer và probe cũng được thiết kế dựa trên các vùng không bảo tồn dùng trong phát hiện và định danh vi sinh vật (Van de peer và cộng sự, 1996)

rDNA chứa vùng 18S, ITS1, 5,8S (một tiểu đơn vị ribosome nhỏ hơn trở thành một phần của LSU), ITS2, 28S và vùng IGS (intergenic spacer) Vùng phiên mã 18S kết thúc tiểu đơn vị nhỏ (SSU), trong khi 28S cộng với 5,8S và một gen 5S thêm vào từ những phần khác của genome hình thành tiểu đơn vị lớn (LSU) của ribosome RNA Những vùng ITS được phiên mã (tổng hợp từ RNA), nhưng bị cắt trước khi rRNA hoàn thiện được hình thành, tuy nhiên ITS lại có chức năng trong sự hình thành ribosome (Albert và cộng sự 1994) Ở đầu kết thúc 5’ của 18S và đầu kết thúc 3’ của 28S, cũng có một vùng được biết đến là ETS (external transcribel spacer) IGS (intergenic spacer) là vùng kém bảo tồn nhất của rDNA Tuy nhiên vùng không gian không phiên mã của những rDNA chứa trình tự kết thúc phiên mã của những gene rRNA

Các rDNA 5,8S; 18S; 28S phiên mã thành các tiền rRNA riêng rẽ, nằm xen kẽ với các vùng phiên mã bên trong (ITS) và các vùng phiên mã bên ngoài (ETS) Giữa các nhóm gen gồm nhiều bản sao lập lại là vùng không phiên mã Có một rDNA 5S thường không có vị trí cố định và có chiều sao mã ngược với các gen còn lại, rDNA 5S thường chỉ có ở nhân, không có ở ty thể của một số loài nấm (Guarro, 1999)

rDNA 18 S thường được quan tâm nghiên cứu, rDNA 5,8 S có kích thước rất nhỏ và ít có sự biến đối song rRNA 5 S là thành phần không thể thiếu của nu-LSU- rRNA, có vai trò ổn định cấu trúc ribosome và thúc đẩy quá trình tổng hợp protein (Szymanski và cộng sự, 2001)

Trang 22

Vùng ITS là vùng có rất nhiều biến đổi, mặc dù vùng ITS thường được sử dụng trong nghiên cứu tiến hoá của sinh vật tuy nhiên phần lớn các so sánh trên vùng này chỉ thường sử dụng ở mức độ xác định các biệt hoá trong cùng loài (Guarro, 1999)

Những gene rRNA ở sinh vật có nhân điển hình (ribosome DNA hay rDNA) được tìm thấy như những phần đơn vị lặp lại được sắp xếp thành từng cặp

Mỗi đơn vị lặp lại chứa một vùng phiên mã (ETS1, ETS2, 18S, 25S và 5,8S) và một vùng không phiên mã (NTS) Trong vùng phiên mã, ITS được tìm thấy trên gen 5,8S rRNA bao gồm ITS1 và ITS2

Hình 2.2: Sơ đồ của các vùng trên rDNA

2.9 Một số nghiên cứu trong và ngoài nước về sự đa da ̣ng của nấm Metarhizium

anisopliae dựa vào gen Pr1 và vùng rDNA-ITS

2.9.1 Nghiên cứ u nước ngoài

Savita Bagga, Gang Hu, Steven E Screen, Raymond J St.Leger đã phân tích sự

giống nhau về mă ̣t trình tự và cấu trúc exon -intron các subtilisin của nấm M.anisopliae

và đã chia thành 4 nhóm:

Nhóm I gồm có Pr1C

Nhóm II được chia thành hai nhóm phụ có hoạt tính extracellular

Trang 23

Nhóm phụ I: gồm có Pr1A, Pr1B, Pr1G, Pr1I, Pr1K Nhóm phụ II gồm có Pr1D, Pr1E, Pr1F, Pr1J Nhóm III gồm có Pr1H có hoạt tính endocellular

Cheng Wang, Milton A Typas, Tariq M Butt (2002) đã sử du ̣ng kỹ thâ ̣t Nested-PCR để xác đi ̣nh những đô ̣t biến ở hai gen Pr1A và Pr1B bằng cách sử du ̣ng

những că ̣p pr imer chuyên biê ̣t cho từng gen và kiểm tra bằng kỹ thuật Southern Blot

Kết quả: phát hiện được gen Pr1 ở dòng cha mẹ , không phát hiê ̣n được ở những dòng

đột biến Tuy nhiên hoa ̣t tính của enzyme giữa dòng cha me ̣ và dòng đô ̣t biến không

thay đổi Như vâ ̣y dòng đô ̣t biến nếu bi ̣ mất gen quan tro ̣ng nhấ t là gen Pr1 vẫn có thể

gây bê ̣nh trên côn trùng

Sorayac C M Leal và ctv (1997) đã mô tả mô ̣t phương pháp để xác đi ̣nh

những dòng nấm Metarhizium bằng cách sử du ̣ng kỹ thuâ ̣t RFLP để phân cắt sản phẩm PCR của gen Pr1 và phân tích những phân đoạn b ằng kỹ thuâ ̣t điê ̣n di Bằng kỹ thuâ ̣t này 40 dòng nấm Metarhizium thu đươ ̣c từ 15 loại ký chủ khác nhau đã được xác định

và chia làm 4 nhóm

Chikako và Susumu Shimizu (2002) đã tiến hành khuếch đa ̣i vùng rDNA từ đầu 3’ củ a 18S rDNA tới đầu 5’ của 28S rDNA bằng cách sử du ̣ng că ̣p mồi đă ̣c hiê ̣u là TW 81 và AB28 và giải trình tự vùng 5.8S và vùng Flanking để nghiên cứu mối quan hệ di

truyền giữa nấm Metarhizium anisopliae được phân lâ ̣p từ Nhâ ̣t Bản và Hàn Quốc với

các loài có mối quan hệ

Malena P Panton, Annoula Mavridou, Milton A.Typas (2003) so sánh sự khác biê ̣ trong trình tự của vùng IGS và vùng rDNA -ITS để nghiên cứu sự khác biê ̣t về mă ̣t

di truyền của 40 dòng nấm Metarhizium

N.D.Pipe, D.Chandler, B W Bainbridge và J B.Heale (1995) sử du ̣ng kỹ thuâ ̣t RFLP-PCR để phân tích gen mã hóa cho ribosome RNA (rDNA) từ những dòng nấm

Metarhizium khác nhau như M.anisopliae var anisopliae, M.anisopliae var majus, M.album và M.flavoviride có nguồn gốc từ nhiều quốc gia khác nhau

Trang 24

Marilena Aquino de Muro, Samina Mehta, David Moore (2003) sử du ̣ng kỹ

thuâ ̣t RFLP, giải trình tự và AFLP để phân tích vùng ITS của 50 dòng nấm Beauveria bassiana Trình tự vùng ITS đã chỉ ra sự khác biệt về trình tự của các dòng B.bassiana

thấp hơn 2%

Mavridou và ctv (1998) đã phân tích sự đa hình trong loài Metarhizium anisopliae var anisopliae bằng cách sử du ̣ng phân tích RFLP đối với phức hợp gen rDNA và mtDNA Dựa vào viê ̣c phân tích sự lai của DNA , 25 dòng được chia làm 20 nhóm khác biệt về di truyền

Driver và ctv (2000) đã sử du ̣ng kỹ thuâ ̣t RAPD và trình tự của toàn bô ̣ vùng ITS của rDNA để xác đi ̣nh sự phân loài Những dòng nấm được chia thành 10 nhánh riêng biê ̣t

Curran và ctv (1994) đã nghiên cứu mối quan hê ̣ phát sinh loài của nấm

Metarhizium bằng việc sử du ̣ng trình tự rDNA

Rakotonirainy và ctv (1994) đã phân tích sự khác biê ̣t về isoenzyme và trình tự

của ribosomal RNA trong giống nấm Metarhizium

2.9.2 Nghiên cứ u trong nước

Những nghiên cứu về sự đa da ̣ng di truyền trong quần thể nấm Metarhizium anisopliae dựa vào gen Pr1 và vùng rDNA -ITS ở Việt Nam có rất ít Phần lớn những nghiên cứu về sự đa da ̣ng di truyền của quần thể nấm Metarhizium anisopliae chỉ dừng

lại ở mức độ đánh giá hình thái của bào tử hoặc khuẩn lạc

2.10 Phương pháp phát hiện gen Pr1 và vùng rDNA-ITS

Có nhiều phương pháp khác nhau (như ELISA, allozyme electrophoresis hoặc RFLPs) có những ưu và khuyết điểm khác nhau, chỉ phân biệt giữa mỗi loài hoặc đòi hỏi số lượng lớn của DNA tinh khiết (Hegedus và ctv, 1993) Sự phân lập DNA thì tốn nhiều thời gian và giới hạn số lượng mẫu có thể phân tích được trong thời gian thích hợp RAPD – PCR thì cũng được sử dụng để mô tả đặc điểm những giống

Metarhizium anisopliae Tuy nhiên, RAPD – PCR rất dễ bị nhiễm tạp và thường

Trang 25

không ổn định, chỉ có thể thực hiện một cách chắc chắn trên DNA từ nuôi cấy ở ký chủ

Sử dụng phương pháp mà cho phép sự khám phá về những đặc điểm của

những giống Metarhizium anisopliae lây nhiễm trên côn trùng Đó là phương pháp kết

hợp kỹ thuật PCR và phân tích RFLP (RFLP – PCR), dựa trên sự khuếch đại của phần

gen mã hóa chủ yếu là protease subtilisin Pr1 (St Leger và ctv, 1992) được tiết ra bởi nấm Metarhizium anisopliae và vùng ITS1- 5.8S – ITS2

Trang 26

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm 3.1.1 Thời gian

Đề tài được tiến hành từ ngày 26 tháng 3 năm 2007 đến ngày 31 tháng 8 năm 2007

3.1.2 Địa điểm

Phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học thực vật - Trung tâm phân tích thí nghiệm Hóa Sinh trường Đa ̣i ho ̣c Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh

3.2 Vật liệu và hoá chất 3.2.1 Vật liệu

DNA được ly trích từ những dòng nấm Metarhizium anisopliae ký sinh trên côn

trùng gây hại cây trồng theo quy trình của Leal, 1994 do anh Nguyễn Văn Lẫm cung cấp và được trữ ở -20oC Các mẫu nấm Metarhizium anisopliae được thu thập và phân

lập trên một số côn trùng gây hại ở một số tỉnh thành trong nước

Bảng 3.1: Nguồn nấm Metarhizium anisopliae được thu thập ở một số địa phương

dùng trong thí nghiệm

Trang 27

Các hoá chất dùng trong điện di:

Gel agarose, thường sử dụng gel có nồng độ 1% agarose

Đệm TAE 0,5X dùng để pha gel agarose và làm dung dịch đệm trong chạy điện di với thành phần như sau:

3.3 Nội dung nghiên cứu

Trang 28

1 Sử dụng kỹ thuật PCR phát hiện gen liên quan tới tính độc (gen Pr1 )và vùng rDNA-ITS của nấm Metarhizium anisopliae

2 Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của nấm Metarhizium anisopliae dựa vào trình tự vùng rDNA-ITS và gen Pr1

3.4 Phương pháp nghiên cứu

3.4.1 Kiểm tra DNA tổng số được ly trích từ các dòng nấm Metarhizium anisopliae

DNA tổng số đươ ̣c kiểm tra bằng kỹ thuâ ̣t điê ̣n di trên gel agarose 1% với hiê ̣u điê ̣n thế 100V trong 20 phút

3.4.2 Khuếch đại gen Pr1

Hình 3.1: Sơ đồ primer được sử du ̣ng khuếch đa ̣i gen Pr1

Trang 29

Tiến hành hai phản ứng PCR riêng biê ̣t với 2 cặp mồi khác nhau Đầu tiên đoạn

DNA đƣợc khuếch đại với cặp primer có trình tự cụ thể nhƣ sau: - METPR1: 5’CAC TCT TCT CCC AGC CGT TC 3’ - METPR4 : 5’GTA GCT CAA CTT CCG CAC TC 3’ (Nguồn : Leger St., 1992)

Thành phần hóa chất đƣợc trình bày ở bảng 3.2

Bảng 3.2: Thành phần hóa chất của phản ứng PCR khuếch đại gen Pr1 với că ̣p primer

Quy trình PCR khuếch đại gen Pr1

Số chu kỳ lặp lại (37 chu kỳ)

Trang 30

Sau khi có đƣợc sản phẩm của phản ứng PCR lần một, chúng tôi tiến hành thực hiện phản ứng PCR lần hai với cặp primer METPR2/METPR5

Trình tự cặp primer METPR2/METPR5

- METPR2: 5’AGG TAG GCA GCC AGA CCG GC 3’ - METPR5 : 5’TGC CAC TAT TGG CCG GCG CG 3’ (Nguồn : Leger St., 1992)

Bảng 3.3: Thành phần hóa chất của phản ứng PCR khuếch đại gen Pr1 với că ̣p primer

Số chu kỳ lặp lại (37 chu kỳ)

Trang 31

3.4.3 Khuếch đại vùng ITS

Primer đƣợc sử dụng để khuếch đại vùng ITS có trình tự nhƣ sau: - ITS 4: 5’ TCCTCCGCTTATTGATATGC 3’

Trang 32

Quy trình PCR

Tách đoạn DNA 950C 3 phút Số chu kỳ lặp lại (37 chu kỳ)

- Tách đoạn DNA 950C 1 phút - Ủ bắt cặp 580C 45 giây - Kéo dài 720C 1 phút Kéo dài 720C 5 phút Ủ 40C 10 phút

3.5 Tiến hành giải trình tự gen gây độc Pr1 và vùng ITS trên nấm Metarhizium

anisopliae

Sau khi chạy PCR chúng tôi tiến hành đọc trình tự sản phẩm PCR vừa khuếch

đại để xác định chính xác đây là đoạn gen gây độc Pr1 và vùng ITS1 – 5.8S – ITS2

nhằm xác định trình tự nucleotide của đoạn gen độc này, từ đó so sánh với những trình tự trên Genbank Đầu tiên để đạt được kết quả cao nên phải tiến hành tinh sạch sản phẩm PCR để việc đọc trình tự đạt kết quả cao

3.6 Tinh sạch sản phẩm PCR

1.Lấy GFX cho vào ống thu dịch lọc đã khử trùng sạch (số lượng GFX tương ứng với số mẫu cần tinh sạch) Cho vào GFX 500µl capture buffer

2.Cho 100 µl sản phẩm PCR vào GFX

3.Trộn đều lên xuống bằng pipette khoảng 4-6 lần

4.Ly tâm với tốc độ khoảng 12000 vòng trong 30 giây ở 40C

5.Loại bỏ dung dịch trong ống thu dịch lọc, sau đó đặt lại GFX vào ống thu dịch lọc

6.Thêm 500 µl wash buffer vào cột GFX Ly tâm ở tốc độ 12000 vòng khoảng 30 giây ở 40

C

7.Loại bỏ ống thu dịch lọc và chuyển GFX sang effpendorf mới

Trang 33

8.Thêm 50 µl elution buffer trực tiếp vào giữa cột GFX 9.Giữ ở nhiệt độ phòng khoảng 1 phút

10.Ly tâm 10000 vòng trong 1 phút ở 40C Sản phẩm tinh sạch đƣợc bảo quản ở- 40C

 Quy trình nhiệt của phản ứng PCR trong đọc trình tự

Đối với gene Pr1

1 Đặt tube vào máy PCR và chỉnh đúng các thông số 2 Biến tính hoàn toàn: 960C trong 1 phút

3 Lặp lại 25 chu kỳ: 960C trong 10 giây 500C trong 5 giây 600C trong 4 phút 4 Giữ ở 40C

Đối với vùng ITS

1 Đặt tube vào máy và chỉnh đúng các thông số 2 Biến tính hoàn toàn: 950C trong 5 phút 3 Lặp lại 25 chu kỳ: 950C trong 30 giây 500C trong 10 giây 600C trong 4 phút 4 Giữ ở 40C

Trang 34

3.7 Tinh sạch sản phẩm đọc trình tự

Sản phẩm đọc trình tự được tinh sạch bằng phương pháp EDTA

- Cho 5 µl EDTA vào mỗi eppendorf

- Thêm vào 60 µl ethanol 100% mỗi eppendorf - Trộn đều lên xuống hỗn hợp vài lần

- Đem ủ mẩu ở nhiệt độ phòng khoảng 15 phút - Ly tâm tốc độ 12000 vòng trong 30 phút

- Loại bỏ phần dịch bên trên, thêm vào 60µl ethanol 70% - Ly tâm 12000 vòng trong 15 phút ở 40C

- Lọai bỏ dịch, thu DNA, làm khô ở nhiệt độ phòng

- Làm tan DNA bằng cách cho vào 2 µl hidiformamide, biến tính 950C trong 3 phút Chạy điện di và ghi nhận tính hiệu trên máy sequencer ABI PRISM 3100

3.8 Phương pháp phân tích trình tự

Hình 3.3: Sơ đồ những phương pháp được sử dụng trong phân tích trình tự

Trang 35

Chọn ra cây phân loài tốt nhất

Hình 3.4: Sơ đồ phân tích trình tự có đô ̣ tương đồng cao

Trang 36

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Kiểm tra DNA tổng số của các mẫu nấm Metarhizium anisopliae được sử

dụng trong nghiên cứu

DNA tổng số 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Trang 37

đó chúng tôi đã tiến hành tinh sa ̣ch DNA tổng số Quy trình tinh sa ̣ch được thể hiê ̣n ở hình 4.2