ĐỊNH DANH LOÀI VÀ PHÂN TÍCH SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA NẤM Trichoderma spp. DỰA VÀO TRÌNH TỰ VÙNG ITS và ech42 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP

ĐỊNH DANH LOÀI VÀ PHÂN TÍCH SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA NẤM Trichoderma spp. DỰA VÀO TRÌNH TỰ VÙNG ITS và ech42 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH ….WUX…. HUỲNH THỊ MỸ PHI ĐỊNH DANH LOÀI VÀ PHÂN TÍCH SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA NẤM Trichoderma spp. DỰA VÀO TRÌNH TỰ VÙNG ITS và ech42 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 11 2009 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH ….WUX…. HUỲNH THỊ MỸ PHI ĐỊNH DANH LOÀI VÀ PHÂN TÍCH SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA NẤM Trichoderma spp. DỰA VÀO TRÌNH TỰ VÙNG ITS và ech42 Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học Mã số : 60.42.80 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP Hướng dẫn khoa học: TS. LÊ ĐÌNH ĐÔN Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 11 2009 i ii LÝ LỊCH CÁ NHÂN Tôi tên là Huỳnh Thị Mỹ Phi sinh ngày 18 tháng 11 năm 1983 tại huyện An Nhơn, tỉnh Bình Định. Con Ông Huỳnh Kim Hùng và Bà Nguyễn Thị Tuyết Mai. Tốt nghiệp Trung học Phổ thông tại Trường Trung học phổ thông An Nhơn I, tỉnh Bình Định. Tốt nghiệp Đại học ngành Công nghệ Sinh học hệ chính quy tại trường Đại học Nông Lâm, TP. Hồ Chí Minh. Tháng 9 năm 2006 theo học cao học ngành Công nghệ Sinh học tại trường Đại học Nông Lâm, Thủ Đức, thành phố Hồ Chí Minh. Tình trạng gia đình: độc thân Địa chỉ liên lạc: 18 Quang Trung, Thị trấn Bình Định, huyện An Nhơn, tỉnh Bình Định Điện thoại: 0983596082 Email: myphi1811yahoo.com iii LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác Ký tên Huỳnh Thị Mỹ Phi iv LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn: TS. Lê Đình Đôn, trưởng Bộ môn Công Nghệ Sinh học, Trường Đại học Nông Lâm, đã hướng dẫn tận tình trong suốt quá trình làm luận văn tốt nghiệp. TS. Từ Thị Mỹ Thuận, Th.S Lê Cao Lượng cho tôi những ý kiến đóng góp để hoàn thành luận văn tốt nghiệp. PGS.TS. Nguyễn Ngọc Tuân và tập thể cán bộ Phòng Đào tạo Sau Đại học trường Đại học Nông Lâm TP. HCM đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi trong thời gian học tập và hoàn thành luận văn tốt nghiệp. TS. Trần Thị Lệ Minh và tập thể cán bộ, giáo viên Bộ môn Công Nghệ Sinh học, trường Đại học Nông Lâm TP. HCM đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi trong suốt quá trình học tập. Tập thể cán bộ tại Trung tâm phân tích hóa sinh, Viện Công Nghệ Sinh học và Công nghệ môi trường, trường Đại học Nông Lâm TP. HCM đã tạo điều kiện hoàn thành các thí nghiệm liên quan trong luận văn tốt nghiệp. Ks. Nguyễn Văn Lẫm và Ks. Trần Thị Vân đã giúp đỡ tôi trong quá trình làm thí nghiệm liên quan luận văn. Các anh, chị và các bạn lớp CHSH2006, luôn ủng hộ và động viên trong học tập và cuộc sống. Bạn bè và người thân luôn quan tâm, động viên trong suốt quá trình học tập và làm luận văn tốt nghiệp. Tác giả luận văn, Huỳnh Thị Mỹ Phi v TÓM TẮT Đề tài “Định danh loài và phân tích sự đa dạng di truyền của nấm Trichoderma spp. dựa vào trình tự vùng ITSrDNA và ech42” được tiến hành nhằm xác định mức độ tương đồng giữa số liệu hình thái và dữ liệu phân tử trong định danh tên loài của Trichoderma và xem xét mức độ biến đổi giữa các cá thể trong quần thể nấm hiện diện. Ba mươi chín mẫu nấm Trichoderma được phân lập từ nhiều vùng địa lý khác nhau và trình tự vùng ITS – rDNA và ech42 được sử dụng để so sánh phân tích định danh loài nhờ vào so sánh dữ liệu trên GenBank kết hợp với công cụ TrichOKey trên www.isth.info. Sự phân nhóm di truyền của 39 MPT được phân tích trên sơ đồ phân nhóm phân tích bằng ma trận khoảng cách di truyền, Neighbor – Joining. Kết quả khẳng định được 5 loài Trichoderma hiện diện trong các mẫu phân tích. Trong đó, 18 MPT là T. asperellum; 4 MPT là T. harzianum; 6 MPT là T. virens; 3 MPT là T. longibrachiatum và 2 MPT là T. koningii phân bố trong 3 section là Trichoderma, Pachybasium và Longibrachiatum, cùng với 6 mẫu có kết quả định danh khác biệt giữa hình thái và phân tử. Có sự biến động di truyền giữa các mẫu Trichoderma trong loài T. asperellum và T. harzianum đã được ghi nhận trong nghiên cứu. Vùng ITS1 – rDNA cho thấy sự khác biệt đặc trưng cho từng loài nhiều hơn vùng ITS2, và có thể được sử dụng như công cụ để phân tích định danh tên loài Trichoderma. Các mẫu Trichoderma phân nhóm tách biệt với các mẫu Trichoderma so sánh từ dữ liệu từ GenBank. Chứng tỏ Trichoderma ở Việt Nam là quần thể bản địa và chưa có hiện tượng xâm lấn ngoại lai. vi SUMMARY The thesis Species identification and genetic diversity of Trichoderma spp. based on the ITS – rDNA and ech42 sequences was conducted to determine the concurrence of morphological and molecular data in identification the scientific name of Trichoderma isolates and to evaluate the genetic diversity among individuals in present fungal populations. Thirty – nine Trichoderma isolates from different geographical regions and their ITS – rDNA and ech42 sequences were used for comparison analysis with reference data on GenBank by using TrichO Key (www.isth.info). The genetic clustering of the 39 MPT was performed based on the genetic distance matrix and Neighbor – Joining analyse. The results confirmed at least five Trichoderma species presenting in which 18 MPT were T. asperellum; 4 MPT, T. harzianum; 6 MPT, T. virens; 3 MPT, T. longibrachiatum; and 2 MPT, T. koningii, those species belonging to three sections as Trichoderma, Longibrachiatum and Pachybasium. It was also found that six isolates were not identified based on morphology and molecules data. There was a genetic variation among isolates in a species such as in T. asperellum and T. harzianum. ITS1 rDNA region showed specific differences to each species in compared with ITS2 region, and it could be used as a tool to identity the scientific name of Trichoderma isolates. Studied Trichoderma isolates were grouped separately from GenBank reference isolates suggesting that Trichoderma species in the study originated from an indigenous population. vii MỤC LỤC CHƯƠNG ......................................................................................................TRANG Trang tựa Trang chuẩn y .................................................................................................... i Lý lịch cá nhân ................................................................................................. ii Lời cam đoan ................................................................................................... iii Lời cảm tạ ....................................................................................................... iv Tóm tắt ............................................................................................................. v Mục lục........................................................................................................... vii Danh sách các chữ viết tắt ................................................................................ x Danh sách các bảng ......................................................................................... xi Danh sách các hình ........................................................................................ xii Chương 1 .................................................................................................................... 1 MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1 1.1. Đặt vấn đề........................................................................................................... 1 1.2. Mục tiêu .............................................................................................................. 3 1.3. Yêu cầu ............................................................................................................... 3 Chương 2 .................................................................................................................... 4 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................................................... 4 2.1. Tổng quan về nấm Trichoderma......................................................................... 4 2.1.1. Phân loại và phân bố ...................................................................................... 4 2.1.2. Đặc điểm sinh học nấm Trichoderma. ........................................................... 4 2.1.2.1. Đặc điểm hình thái học của tế bào nấm ..................................................... 4 2.1.2.2. Đặc tính sinh lý và sinh hóa ...................................................................... 7 2.1.2.3. Cơ chế đối kháng giữa nấm Trichoderma và các nấm gây bệnh ............... 8 viii 2.1.3. Ứng dụng trong Nông nghiệp, bảo vệ thực vật .............................................. 9 2.2. Tổng quan về các vùng bảo tồn ........................................................................ 10 2.2.1. Vùng ITS – rDNA ở sinh vật ....................................................................... 10 2.2.2. Tổng quan về ech42 – Endochitinase 42 ..................................................... 12 2.3. Những nghiên cứu về đa dạng sinh học của nấm Trichoderma. ...................... 15 2.3.1. Những nghiên cứu trên vùng ITS – rDNA .................................................. 15 2.3.2. Những nghiên cứu phân tích kết hợp ITS – rDNA và các gen đơn ............. 16 2.4. Ý nghĩa của phân loại nấm Trichoderma ......................................................... 18 Chương 3 .................................................................................................................. 19 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP .......................................................................... 19 3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện ....................................................................... 19 3.2. Nội dung nghiên cứu ......................................................................................... 19 3.3. Vật liệu nghiên cứu ........................................................................................... 19 3.3.1. Các mẫu nấm ............................................................................................... 19 3.3.2. Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu ............................................................ 24 3.3.3. Dụng cụ và trang thiết bị thí nghiệm ........................................................... 24 3.4. Phương pháp thực hiện ..................................................................................... 24 3.4.1. Tăng sinh khối và thu nhận sinh khối nấm Trichoderma............................................ 24 3.4.2. Ly trích DNA tổng số của nấm Trichoderma .............................................. 25 3.4.3. Quy trình thực hiện phản ứng PCR .............................................................. 25 3.4.4. Phương pháp định danh và phân tích sự đa dạng loài ................................. 26 3.4.4.1. Phương pháp định danh các mẫu nấm Trichoderma phân lập ................. 26 3.4.4.2. Phân tích sự đa dạng loài của nấm Trichoderma ..................................... 28 Chương 4 .................................................................................................................. 29 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................................ 29 4.1. So sánh kết quả định danh tên loài theo hình thái và phân tử dựa trên vùng ITS – rDNA .................................................................................................... 29 4.2. Sự khác biệt di truyền của các loài nấm Trichoderma spp. dựa vào trình tự vùng ITS – rDNA ........................................................................................... 32 ix 4.2.1. Sự biến động di truyền của các loài Trichoderma dựa trên vùng ITS – rDNA .............................................................................................................. 32 4.2.3.1. Sự biến động di truyền của loài Trichoderma asperellum......................... 32 4.2.3.2. Sự biến động di truyền của loài Trichoderma harzianum.......................... 36 4.2.3.3. Sự biến động di truyền của loài Trichoderma virens................................. 38 4.2.2. Sự tương đồng trình tự trên vùng ITS – rDNA............................................ 40 4.2.2.1. Sự tương đồng trình tự trên vùng ITS1 ...................................................... 40 4.2.2.2. Sự tương đồng trình tự trên vùng ITS2 ...................................................... 44 4.2.2.3. Sự tương đồng trình tự trên toàn vùng ITS – rDNA .................................. 48 4.2.3. So sánh kết quả phân nhóm trên vùng ITS – rDNA với các mẫu so sánh ... 51 4.3. Kiểm tra bằng phân tích trên gen ech42 ........................................................... 56 o Kết quả định danh tên loài dựa vào hình thái, vùng ITS và ech42 .............. 56 o Kết quả phân nhóm trên vùng ech42 ........................................................... 56 4.4. Thảo luận chung ............................................................................................... 60 Chương 5. ................................................................................................................. 64 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ..................................................................................... 64 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 65 x DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT Bp : base pair cDNA : Complement Deoxyribonucleic Acid ctv : cộng tác viên DNA : Deoxyribonucleic Acid ech42 : endochitinase 42 ITS : Internal Transcribed Spacer LSU : Large Subunit rDNA MP : Maximum Parsimony MPT : Mẫu phân tích NCBI : Natural Center for Biotechnology Information NJ : Neighbor Joining nu : nucleotide ORF : Open Reading Frame PCR : Polymerase Chain Reaction PGA : Potato Glucose Agar rDNA : Ribosome Deoxyribonucleic Acid S. rolfsii : Sclerotium rolfsii SSU rDNA : Small Subunit rDNA tef1α : Translation Elongation Factor 1 WA : Water Agar xi DANH SÁCH CÁC BẢNG Trang Bảng 3.1 Các mẫu nấm Trichoderma được sử dụng trong phân tích....................... 20 Bảng 3.2 Trình tự các cặp primer tương ứng trong phản ứng PCR ......................... 26 Bảng 3.3 Các loài Trichoderma được sử dụng từ nguồn GenBank ......................... 27 Bảng 4.1 Kết quả định danh theo hình thái và dựa vào trình tự vùng ITS ............... 29 Bảng 4.2 Tỷ lệ tương đồng (%) của 20 MPT cùng loài T. asperellum trên toàn vùng ITS – rDNA ..................................................................................... 33 Bảng 4.3 Tỷ lệ tương đồng (%) và số nucleotide thay đổi của 20 MPT cùng loài T. asperellum trên vùng ITS1 ............................................................ 34 Bảng 4.4 Tỷ lệ tương đồng (%) và số nucleotide thay đổi của 20 MPT cùng loài T. asperellum trên vùng ITS2 ............................................................ 35 Bảng 4.5 Tỷ lệ tương đồng (%) và số nucleotide thay đổi của 4 MPT cùng loài T. harzianum trên vùng ITS1 và ITS2...................................................... 37 Bảng 4.6 Tỷ lệ tương đồng (%) và số nucleotide thay đổi của 8 MPT cùng loài T. virens trên vùng ITS – rDNA ............................................................... 39 Bảng 4.7 Tỷ lệ tương đồng (%) trình tự DNA trên vùng ITS1 – rDNA giữa các MPT thuộc 8 loài Trichoderma ............................................................... 42 Bảng 4.8 Tỷ lệ tương đồng (%) trình tự DNA trên vùng ITS2 – rDNA giữa các MPT thuộc 8 loài Trichoderma ............................................................... 46 Bảng 4.9 Tỷ lệ tương đồng (%) trình tự DNA trên toàn vùng ITS – rDNA giữa các MPT thuộc 8 loài Trichoderma ......................................................... 49 Bảng 4.10 Kết quả định danh theo hình thái và trình tự vùng ITS và ech42 ........... 57 Bảng 4.11 Tỷ lệ tương đồng (%) trình tự DNA trên vùng ech42 của 12 MPT ........ 58 xii DANH SÁCH CÁC HÌNH Trang Hình 2.1 Các hình dạng của cuống sinh bào tử của các loài nấm Trichoderma ........ 5 Hình 2.2 Các hình dạng cụm bào tử của các loài nấm Trichoderma ......................... 5 Hình 2.3 Các hình dạng bào tử đính của các loài nấm Trichoderma......................... 6 Hình 2.4 Cấu trúc của một đơn vị lặp lại rDNA ...................................................... 10 Hình 2.5 Các vị trí của primer trên vùng ITS ........................................................... 11 Hình 2.6 Sơ đồ vị trí primer trên Nu SSU rDNA ............................................... 12 Hình 2.7 Cấu trúc gen ech42 .................................................................................... 13 Hình 2.8 Cấu trúc domain chitinase 18 của Hypocrea jecorina. ............................. 14 Hình 4.1 Điểm khác biệt trình tự đặc trưng của các loài Trichoderma trên vùng ITS1 – rDNA ............................................................................................ 41 Hình 4.2 Sơ đồ phân nhóm của 39 MPT trên vùng ITS1 – rDNA ........................... 43 Hình 4.3 Điểm khác biệt đặc trưng theo loài của các mẫu nấm Trichoderma trên vùng ITS2 .......................................................................................... 45 Hình 4.4 Sơ đồ phân nhóm của 39 MPT trên vùng ITS2 – rDNA ........................... 47 Hình 4.5 Sơ đồ phân nhóm của 39 MPT trên toàn vùng ITS – rDNA ..................... 50 Hình 4.6 Sơ đồ phân nhóm của 39 MPT và các loài trên GenBank trên vùng ITS – rDNA với thuật toán NJ.................................................................. 53 Hình 4.7 Sơ đồ phân nhóm của 39 MPT và các loài trên GenBank trên vùng ITS – rDNA với thuật toán MP ................................................................ 54 Hình 4.8 Sơ đồ phân nhóm của 12 MPT và trên vùng ech42 .................................. 59 0 1 Chương 1 MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Trichoderma là loại nấm có nhiều ứng dụng trong lĩnh vực bảo vệ thực vật, thường được tìm thấy trong đất, rễ cây, lá và cả trên thân cây mục (Harman, 2004). Cùng với đặc tính đối kháng với một số nấm gây bệnh trên cây trồng như Phytophthora, Pythium, Rhizoctonia, Sclerotina, Fusarium v.v… Trichoderma có khả năng tạo ra một số chất kháng sinh gây độc cho những vi sinh vật khác và hoạt động như vi sinh vật kiểm soát sinh học (Samuels, 2004). Ngoài khả năng hạn chế vi sinh vật gây bệnh cho thực vật, Trichoderma có những ảnh hưởng tốt lên sự sinh trưởng và phát triển của cây trồng (Harman, 2005). Từ những năm 1990 trở lại đây, nhiều nhà khoa học dùng Trichoderma spp. như là một trong những nguyên liệu chính trong sản xuất chế phẩm sinh học phòng ngừa các bệnh hại do một số loại nấm ký sinh gây ra cho cây trồng. Tại Việt Nam, một số chế phẩm chứa Trichoderma đã được thử nghiệm và sử dụng để điều trị một số bệnh trên cây trồng và có khả năng cải thiện chất lượng môi trường nông nghiệp. Trên thế giới, nấm Trichoderma được sản xuất với nhiều thương hiệu khác nhau như BinabT, RootShield PlantShield, T – 22G, T – 22 Planter Box, Trichodex đang được sử dụng rộng rãi ở Mỹ và các nước ở châu Âu (Gardener M.B, 2005). Hiện nay, nấm Trichoderma được tìm thấy với hơn 100 loài khác nhau (Druzhinina và ctv, 2008). Điều này cho thấy sự đa dạng loài của nấm Trichoderma rất lớn. Mỗi loài Trichoderma có những đặc điểm riêng biệt theo loài, cũng như tính đối kháng và khả năng phân giải enzym của nấm. Nhưng một số loài Trichoderma có những điểm rất giống nhau, sự khác nhau của các loài này chỉ ở một số điểm nhỏ, rất khó phát hiện khi phân tích dựa vào các đặc điểm hình thái. Điều này có thể 2 dẫn đến việc nhầm lẫn giữa các loài và gây khó khăn trong sử dụng và khai thác những loài có ích. Nhưng theo Bisset (1991), định danh dựa vào hình thái vẫn được xem là nền tảng, là yếu tố ban đầu để có thể nhận dạng về giống và loài của Trichoderma. Với sự tiến bộ của ngành công nghệ sinh học hiện đại, các kỹ thuật sinh học phân tử đã và đang được ứng dụng rất nhiều trong các nghiên cứu phân loại và định danh các loài sinh vật. Do đó, việc định danh tới loài của nấm và đồng thời phân tích được sự đa dạng di truyền, đa dạng loài và cả đa dạng sinh học của nấm trong tự nhiên có thể được phân tích dựa trên các vùng gen đặc trưng của loài. Với nấm Trichoderma, phương pháp phân tích di truyền đã và đang được sử dụng rộng rãi và thường dựa vào sự khác biệt ở các vùng Internal Transcribed Spacer – ITS trên DNA ribosome của nấm cũng như các vùng gen đơn khác như: tef1α, act1, ech42... (Samuels, 2004). Tuy nhiên, một số nghiên cứu khi phân tích đơn lẻ trên vùng này cho kết quả với độ tin cậy không cao và đã được đề nghị cần có sự kết hợp nhiều vùng gen với nhau để đạt được kết quả chính xác hơn (Druzhinina và ctv, 2004). Tại Việt Nam, hiện nay các nghiên cứu về nấm Trichoderma chỉ tập trung vào hướng khai thác sử dụng là chính, chưa có nghiên cứu hệ thống và chưa có sự quan tâm đến ý nghĩa và vai trò của loài cũng như những tác động bất lợi của Trichoderma đến sức khỏe cộng đồng. Trên cơ sở đó, đề tài: “Định danh loài và phân tích sự đa dạng di truyền của nấm Trichoderma spp. dựa vào trình tự vùng ITS và ech42” được thực hiện. Sự đa dạng di truyền của Trichoderma ở Việt Nam trên các vùng địa lý khác nhau được phân tích dựa vào sự khác biệt về trình tự DNA trên vùng ITS và ech42. 3 1.2. Mục tiêu nghiên cứu Phân tích sự đa dạng di truyền của nấm ở các vùng khác nhau ở Việt Nam dựa vào trình tự các vùng ITS và ech42 và hình thái học. 1.3. Mục đích nghiên cứu Đánh giá sự đa dạng di truyền của nấm Trichoderma spp. trên toàn lãnh thổ Việt Nam. 1.4. Yêu cầu Mẫu nấm được thu thập ở nhiều vùng khác nhau. Trình tự vùng ITS và ech42 được sử dụng để so sánh. 4 Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Tổng quan về nấm Trichoderma 2.1.1. Phân loại và phân bố Năm 1801, Persoon ex Gray đã phân loại nấm Trichoderma thuộc giới Fungi, ngành Ascomycota, lớp Euascomycetes, bộ Hypocreales, họ Hypocreaceae, giống Trichoderma. Theo Bissett (1991), giống Trichoderma được phân chia thành 5 giống phụ: Pachybasium, Trichoderma, Saturnisporum, Longibrachiatum, Hypocreanum với các loài khác nhau. Trichoderma phân bố trên toàn cầu (Kulling và ctv, 2000; Kubicek và ctv, 2003; Wuczkowski và ctv, 2003; Druzhinina và ctv, 2005; Zhang và ctv, 2005) và thường cư trú ở trong đất, rễ cây, thân cây và gỗ mục (Harman, 2004; Samuels, 2004; Druzhinina và ctv, 2005). Trichoderma có mặt ở hầu hết các nơi trừ các cực Bắc và Nam (Samuel, 2004), và trở thành thành phần chiếm ưu thế trong đất ở các điều kiện sinh thái khác nhau, ví dụ như: đất nông nghiệp, đất đồng cỏ, đất rừng, đất vùng đầm lầy nước mặn, đất sa mạc trong các vùng khí hậu khác nhau. 2.1.2. Đặc điểm sinh học nấm Trichoderma 2.1.2.1. Đặc điểm hình thái của tế bào nấm Nhìn chung, Trichoderma cũng có những đặc điểm cấu tạo tế bào như những tế bào nấm sợi khác. Sợi nấm có đường kính từ 0,5 – 1,0 μm, được bao bọc bởi một lớp màng mỏng gọi là thành tế bào. Thành tế bào không chứa cellulose như ở thực vật mà chứa chitin và một số thành phần: polysaccharid, lipid, protein, hexozamin, chất màu (melanin). Màng tế bào chất dầy khoảng 7 μm, chứa lipid (40 %) và protein (38 %). Nhân phân hóa, thường có hình tròn và đôi khi kéo dài, đường kính 5 khoảng 2 – 3 μm. Ty thể có hình elip và luôn di động (T.M. Châu và V.T.V. Hoa, 2000). Đặc tính hình thái của nấm Trichoderma còn tùy thuộc vào đặc tính của từng loài, và thường được dựa vào một số đặc điểm chính để nhận biết và phân biệt các loài với nhau. a. Khuẩn ty của Trichoderma không màu, có tốc độ phát triển rất nhanh, trên môi trường PGA ban đầu có màu trắng, khi sinh bào tử thì chuyển sang xanh đậm, xanh vàng hoặc lục trắng. Ở một số loài còn có khả năng tiết ra một số chất làm thạch của môi trường PGA hóa vàng. b.Cuống sinh bào tử ở các loài Trichoderma còn chưa được xác định rõ, nên việc xác định cách tạo bào tử cũng gặp nhiều khó khăn. Cuống sinh bào tử đặc trưng của Trichoderma là một nhóm sợi nấm quấn vào nhau nhiều hay ít, và thường mọc thành nhóm hay cụm pustules, dọc theo sợi nấm hay trong vùng tỏa ra của tản nấm. Cuống sinh bào tử có nhiều cách phân nhánh trên trục chính, mọc đối xứng nhau hay riêng lẻ và độ dài của những lóng giữa các nhánh trên cuống tùy thuộc vào từng loài. Hình 2.1: Các hình dạng cuống sinh bào tử của các loài nấm Trichoderma A: T. aggressivum, B: T. harzianum, C: T. fertile, D: T. flavofuscum (http:nt.arsgrin.govtaxadescriptionskeysframephotogallery) c. Cụm bào tử – pustules thường có kích thước từ 1 – 7 mm, có hình dạng kết cụm lại rất chặt và chồng lên nhau ở một số loài như T. hamatum, T. polysprorum, T. spirale, nhưng một số loài khác thì có hình dạng như bông hoặc liên kết lỏng lẻo với nhau như T. longibrachiatum, T. harzianum. Đây là một đặc tính rất khó phân biệt ở các loài với nhau. A B C D 6 d.Bào tử đính (conidia) thường có màu xanh, một ít có màu trắng, vàng hay xám xanh, đặc tính này nó còn phụ thuộc vào các loài khác nhau. Bào tử đính là những tế bào đơn bào, có thể có hình chữ nhật, với tỷ lệ chiều dài rộng hơn 1,4 nhưng có một số loài có hình cầu hoặc oval với tỷ lệ dài rộng là 1,0 – 1,1 và không dài hơn 5 μm. Hầu hết các loài Trichoderma đều có bào tử đính trơn láng, ngoại trừ một số loài: T. nigrovirens, T. viride, T. saturnisporum có bào tử gồ ghề. Hình 2.3: Các hình dạng bào tử đính của các loài nấm Trichoderma A: T. asperellum, B: T. citrinoviride, C: T. minutisporum, D: T. nigrovirens (http:nt.arsgrin.govtaxadescriptionskeysframephotogallery) e. Bào tử vách dày được xem như là dạng chống chịu, làm tăng khả năng tồn tại trong đất của một số loài Trichoderma, thường được sử dụng làm nguyên liệu trong sản xuất chế phẩm kiểm soát sinh học. Hầu hết các loài Trichoderma spp. đều tạo ra nhiều bào tử vách dày trong môi trường nuôi cấy. Dựa vào các đặc điểm hình thái: màu sắc, hình dạng và sự sắp xếp của bào tử đính; hình thái của cuống sinh bào tử; đặc tính kéo dài của cuống sinh bào tử; cách Hình 2.2: Các hình dạng cụm bào tử của các loài nấm Trichoderma A: T. croceum, B: T. fasiculatum, C: T. hamatum, D: T. longibrachiatum (http:nt.arsgrin.govtaxadescriptionskeysframephotogallery) A B C D A B C D 7 mọc trên môi trường nuôi cấy và các cụm bào tử, người ta có thể phân biệt được các loài nấm với nhau trong cùng giống Trichoderma. 2.1.2.2. Đặc tính sinh lý và sinh hóa Trichoderma có thể thích nghi được dưới mọi điều kiện sống khác nhau. Nấm phát triển rất nhanh trong điều kiện nhiệt độ từ 25 – 300C, ít loài sống tốt trong ở 350C, có một số loài phát triển được ở nhiệt độ 400C (Samuels, 2004). Trichoderma có khả năng tạo ra một số chất có tính chất đối kháng với nấm gây bệnh cho cây trồng như: Alkyl pyron, tạo mùi dừa, từ nấm T. atroviride, viride, koningii, hamatum, ngăn cản sự nảy mầm của noãn bào tử của nấm Phytophthora cinnamoni và các bào tử Botrytis cinerea. Chỉ có những mẫu thuộc giống phụ Trichoderma có thể tạo ra 6PAP6 (6npentylαpyrone, a δlactone) trong môi trường nuôi cấy. Gliotoxin và gliovirin, là những hợp chất diketopiperazin, được tạo ra bởi T. virens, ức chế sự nảy mầm và phát triển của Rhizoctonia solani và Pythium. Isonitriles, tạo ra từ T. hamatum, T. harzianum, T. koningii, T. polysporum, T. viride ức chế sự phát triển của nấm gây bệnh. Peptaibol, từ T. polysporum, T. koningii, T. harzianum, hoạt động trên màng của tế bào nấm gây bệnh, ngăn cản sự hoạt động của các enzyme màng liên quan đến sự tổng hợp vách tế bào và trợ giúp các enzyme phân hủy màng tế bào, ức chế sự phát triển của nấm gây bệnh. Đồng thời peptaibol còn có thể làm kích hoạt tính kháng của cây trồng đối với các tác nhân gây bệnh. Steroid: viridin, từ T. virens, ức chế sự nảy mầm của bảo tử. Ngoài ra, Trichoderma còn có những khả năng đặc biệt trong quá trình đối kháng của nấm như: (1) phát triển theo hướng có hóa chất, sự phát triển trực tiếp theo một sự kích thích của hóa chất, giúp định hướng sự phát triển trong một khoảng cách, là một đặc tính có lợi trong tính đối kháng; (2) nhận dạng và phân biệt các phân tử đối kháng và ký sinh, có thể theo tính vật lý hay hóa học và nhận dạng hóa học thường qua trung gian lectin trên bề mặt của nấm đối kháng hay nấm ký 8 sinh; (3) tấn công trực tiếp, bao vây và bắt giữ sợi nấm theo sự nhận biết đặc hiệu giữa những cấu trúc và những thể bám. Hơn nữa, Trichoderma có khả năng cạnh tranh dinh dưỡng, vị trí kết tập trên các mô hoại tử và cả chất tiết từ thực vật với các loài nấm gây bệnh ở xung quanh môi trường sinh sống của nấm. 2.1.2.3. Cơ chế đối kháng giữa nấm Trichoderma với các nấm gây bệnh Trichoderma là nấm có tính chất đối kháng cao với một số nấm gây bệnh cho cây trồng, với một số cơ chế đối kháng trực tiếp và gián tiếp như sau: Ký sinh trên nấm gây bệnh, phát triển theo hướng hóa chất do nấm ký chủ tiết ra, phân biệt các phân tử đối kháng và ký sinh. Cạnh tranh về dinh dưỡng, nơi ở, chất tiết từ cây với các nấm gây bệnh. Tự tạo kháng sinh: Gliotoxin và gliovirin, alkyl pyrones, 6PAP6, peptaibol, steroid, sesquiterpenes, polyketides ngăn cản sự nảy mầm của các bào tử nấm gây bệnh trên cây trồng. Theo Harman (2005), quá trình đối kháng của nấm Trichoderma diễn ra theo một loạt các hoạt động như: phát triển về hướng có các sợi nấm khác, cuộn chúng lại trong phản ứng lectin làm trung gian và phá vỡ thành tế bào của nấm mục tiêu. Quá trình này làm hạn chế sự phát triển và hoạt động của các nấm gây bệnh trên cây trồng. Có thể cơ chế duy nhất của sự kiểm soát sinh học của Trichoderma là ảnh hưởng trực tiếp tới tác nhân gây bệnh cho cây. Nhưng thực tế thì Trichoderma hoạt động theo một số cơ chế khác nhau. Một số nấm ảnh hưởng trực tiếp trên tác nhân gây bệnh, đồng thời có một số ít ảnh hưởng gián tiếp qua rễ cây, chúng cạnh tranh vị trí với tác nhân gây bệnh và loại bỏ các tác nhân tiềm năng, cung cấp dinh dưỡng cho cây trồng (Samuels, 2004). 9 2.1.3. Ứng dụng trong nông nghiệp, bảo vệ thực vật Ngày nay, Trichoderma thường được sử dụng như chất kiểm soát sinh học, bảo vệ thực vật để chống các loại nấm gây bệnh: Phytophthora, Pythium, Rhizotonia, Sclerotina, Botrytis, Fusarium và Crinipellis trên cây bông vải, nho, bắp, rau diếp, hành, táo, cà rốt và ca cao. Một số nghiên cứu cho thấy các loại bào tử đính hay chlamydospores có hiệu quả đối kháng cao khi đưa vào đất trồng có tác nhân gây bệnh. Hai loài được coi là có nhiều ứng dụng nhất là T. harzianum, nấm ký sinh và kích thích cây phát triển, và T. virens, tác nhân hóa học bằng cách tạo ra gliotoxin (Samuels, 2004). Trichoderma được nghiên cứu rất kỹ về các cơ chế cạnh tranh cũng như là đặc điểm bám dính trên các ký chủ của nó. Harman (2005) tạo ra một loại nấm dung hợp giữa 2 mẫu nấm T. harzianum (mẫu T22), mang các đặc tính tăng trưởng mạnh và khả năng cạnh tranh vị trí kết tập ở rễ với hoạt tính chống nấm rất mạnh. Mẫu này được thử nghiệm cho kết quả khá tốt và đang được đưa ra thị trường thương mại hóa như là một chất bảo vệ cho rễ ở Mỹ và một số nước ở Châu Âu. Bên cạnh đó, Lê Đình Đôn và ctv (2006) đã đánh giá hiệu quả phòng trừ nấm bệnh hại cây trồng trong điều kiện đồng ruộng của T. virens, T. harzianum và T. asperellum. Quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm sinh học của ba loại nấm này đã được thiết lập khá hoàn chỉnh và đã đăng ký tên thương mại cho ba chế phẩm “Trichoderma cho cây sầu riêng”, “Trichoderma cho cây rau xanh” và “NLU – Tri” góp phần tạo sản phẩm nông nghiệp an toàn trong sử dụng. Hiện nay, có rất nhiều loài chế phẩm chứa Trichoderma được thương mại hóa tại Việt Nam, chẳng hạn như: Vi – ĐK của Công ty thuốc sát trùng Việt Nam, Trico – ĐHCT của Đại học Cần Thơ, BIOPROMOT của Viện Sinh học Nhiệt đới, TriB1 của Viện Bảo Vệ Thực Vật và hơn 10 sản phẩm khác. Các chế phẩm này đang được nông dân ở khu vực TP. Hồ Chí Minh, Đồng bằng sông Cửu Long và Đông Nam Bộ sử dụng rộng rãi trong việc ủ phân chuồng bón cho cây trồng. Việc sử dụng các chế phẩm này đã đẩy nhanh tốc độ ủ hoai phân chuồng từ 2 – 3 lần so với phương 10 pháp thông thường, giảm thiểu ô nhiễm môi trường do mùi hôi thối của phân chuồng. Người nông dân vừa tận dụng được nguồn phân tại chỗ, vừa đáp ứng được nhu cầu ứng dụng tăng khả năng kháng bệnh cho cây trồng do tác dụng của nấm đối kháng Trichoderma có chứa trong phân ủ. 2.2. Tổng quan về vùng gen ITS – rDNA và ech42 2.2.1. Giới thiệu vùng ITS – rDNA ở nấm rDNA là nhóm gen mã hóa rRNA của ribosom, đóng vai trò quan trọng trong các nghiên cứu quan hệ phát sinh loài, vì có nhiều bản sao và đặc biệt không mã hóa cho protein nào. Các bản sao của gen nằm liên tiếp trên một locus và liên quan mật thiết tới quá trình tiến hóa. Ribosome hầu như tồn tại trong mọi sinh vật và có cùng nguồn gốc tiến hóa, tương đối bảo tồn nên được xem là cơ sở để tìm ra sự tương đồng và các khác biệt khi so sánh các sinh vật khác nhau trong cùng một loài hoặc khác loài. Hình 2.4: Cấu trúc của một đơn vị lặp lại rDNA. (http:en.wikipedia.orgwikiImage:Eucaryot_rdna.png.) Theo White và ctv (1989), rDNA có thể chia thành 2 nhóm: rDNA nhân và rDNA ty thể. Trong đó, rDNA nhân (nu – rDNA) gồm nu – SSU – rDNA (17 – 18S) mã hóa rRNA tiểu đơn vị nhỏ (small subunit rDNA) và nu – LSU – rDNA (26 – 28S) mã hóa rRNA tiểu đơn vị lớn (large subunit rDNA). Nu – SSU – rDNA tiến hóa tương đối chậm, thường được sử dụng trong nghiên cứu các sinh vật có ít quan hệ về mặt di truyền. Nu – LSU – rDNA mặc dù có ít vùng biến đổi nhưng lại rất có ý nghĩa trong nghiên cứu so sánh và phân loại ở nhiều mức độ (Guarro, 1999). Riêng rDNA ty thể (mt – rDNA) cũng được phân chia thành: mt – SSU – rDNA 11 (19S) và mt – LSU – rDNA. Các mt – rDNA tiến hóa khá nhanh, thường được sử dụng trong nghiên cứu các sinh vật cùng họ (Yamamoto và ctv, 1995). ITS là một đoạn gen không chức năng, nằm giữa những vị trí mã hóa RNA ribosome cấu trúc (rRNA) trên một đơn vị bản sao chung. Đọc từ đầu 5’ – 3’, đơn vị bản sao rRNA polycistronic này bao gồm: trình tự 5’ ETS (external transcribed sequence), 18S rRNA, ITS – 1, 5.8S rRNA, ITS – 2, 28S rRNA và cuối cùng là 3 ETS. Trong quá trình hoàn thiện chứa năng của rRNA, các đoạn ETS và ITS bị cắt bỏ, cũng như các sản phẩm không có chức năng khác. Hình 2.5: Các vị trí của primer trên vùng ITS. (Vilgalys lab, Duke University) Các primer vùng ITS được thiết kế dựa trên vùng bảo tồn của các gen 18S, 5,8S, 28S. Primer ITS1 có trình tự bổ sung với primer NS8, là primer đặc hiệu trên vùng bảo tồn của rDNA 18S, Nu – SSU – rDNA (Hình 2.3). Primer ITS2 và ITS3 được thiết kế và sàng lọc dựa trên vùng bảo tồn thuộc 5,8 S của N. crassa, Schizosaccharomyces pombe và S. cerevisiae, Vicia faba và chuột. Vùng bảo tồn trên rDNA 28 S của S. prombe, S, cerevisiae và lúa (Oryza sativa) được so sánh để thiết kế ITS4. Primer ITS5 có trình tự giống với rDNA 18 S của N. crassa, có đầu 5’ chỉ cách primer ITS1 25 Nu (White và cộng sự, 1989). Sự so sánh trình tự trên vùng ITS thường được sử dụng nhiều trong các phân tích phân loại ở mức độ phân tử của các loài sinh vật khác nhau, vì một số lý do: (1) rRNA có số lượng bản sao cao nên dễ dàng khuếch đại ngay cả khi số lượng DNA tổng số rất ít, (2) vùng ITS có độ biến động cao giữa các loài có quan hệ gần gũi với nhau. Điều này có thể được giải thích bằng áp lực tiến hóa tương đối chậm tác động lên các trình tự không chức năng. 12 Hình 2.6: Sơ đồ vị trí primer trên Nu – SSU – rDNA (White và ctv, 1989) Việc nghiên cứu so sánh trình tự của rDNA đóng vai trò quan trọng trong phân loại và xác định quan hệ di truyền và đặc biệt có ý nghĩa trong ngành phân loại nấm. Từ trước đến nay nấm thường được phân loại dựa trên đặc điểm hình thái, cơ chế trao đổi chất, cấu trúc vách tế bào và thành phần protein nên kết quả phân loại thường khó được đồng nhất do sự thay đổi môi trường nghiên cứu và điều kiện trong phòng thí nghiệm. Nên các so sánh dựa trên trình tự nucleotide được xem là cơ sở, rất có ý nghĩa trong phân loại (Guarro, 1999). Những nghiên cứu phân loại Trichoderma được thực hiện trên vùng ITS – rDNA rất nhiều và rất sớm, bắt đầu từ giữa những năm 1990 (Samuels, 2004). Các nghiên cứu trên vùng này có thể cho thấy sự đa dạng loài của nấm Trichoderma. 2.2.2. Tổng quan về ech42 – Endochitinase 42 ech42 là một gen đơn trên genome của nấm Trichoderma (Carsolio và ctv, 1994; Garcia và ctv, 1994), mã hóa cho protein endochitinase có khối lượng phân tử là 42 kDa, còn được gọi với tên là ThEn – 42 (Hayes và ctv, 1994). Cấu trúc của ech42 gồm có 3 đoạn intron với 3 kích thước tương ứng 56, 69 và 70 bp; 4 exon nằm xen kẽ nhau; đoạn 209 bp ở đầu 3’ không được dịch mã và vùng promoter 240 bp (Carsolio và ctv, 1994; Lieckfedlt và ctv, 2000). Kích thước trình tự của cDNA ech42 có 1554 bp, chứa một vùng ORF, biểu hiện cho 424 amino acid (Hayes và ctv, 1994). 13 Hình 2.7: Cấu trúc gen ech42 (Lieckfeldt và ctv, 2000) Gen ech42 chịu sự điều hòa của các yếu tố như cơ chất trong môi trường nuôi cấy, vách tế bào nấm hay chất keo chitin hay sự thiếu carbon có tác dụng cảm ứng sự biểu hiện của ech42 rất lớn. Trong khi đó, sự có mặt với nồng độ cao của glucose và glycerol gây ức chế sự biểu hiện của gen (Carsolio và ctv, 1994; Garcia và ctv, 1994; Virterbo và ctv, 2002). Một số nghiên cứu cho thấy rằng sự biểu hiện của ech42 không phải trực tiếp bỡi chitin mà do sự thiếu carbon bỡi việc rút chất dinh dưỡng. Một số nghiên cứu khác cho thấy sự phiên mã của ech42 cảm ứng bởi các stress về sinh lý như là nhiệt độ thấp và áp suất thẩm thấu cao (Duo – Chuan, 2006). Trong điều kiện ký sinh trên nấm, ech42 được hoạt hóa trong suốt quá trình tương tác với ký chủ (Carsolio và ctv, 1994). Hệ thống phân giải chitin của Trichoderma gồm có 5 đến 7 enzyme phân biệt, có thể bao gồm 2 β – (1,4) – N – acetyl – glucosaminidases (102 và 73 kDa) và 4 endochitinases (52, 42, 33, và 31 kDa), tùy thuộc vào nấm (Haran và ctv, 1995). Đa số enzyme chitinase của Trichoderma thuộc họ protein chitinase 18 (Duo – Chuan, 2006) và được đặt tên theo chi18, từ chi18 – 1 đến chi18 – 18, tùy theo cấu trúc domain của enzyme (Seidl và ctv, 2005) (Hình 2.8). Endochitinase 42 kDa có tác dụng phân hủy chitin rất mạnh, là một loại enzyme được quan tâm nhiều nhất trong hỗn hợp của hệ thống phân giải chitin của nấm, tương đồng với protein chitinase chi18 – 5, họ chitinase 18, khi so sánh trình tự protein của chúng với nhau (Seidl và ctv, 2005). 14 Hình 2.8: Cấu trúc domain chitinase 18 của Hypocrea jecorina. (Seidl và ctv, 2005) Trong quá trình tương tác giữa nấm với nấm, gen tương ứng – ech42 biểu hiện rất mạnh. Khi nấm phát triển trên môi trường có sự hiện diện của hệ sợi nấm bị khử hoặc chất keo chitin như là nguồn cacbon duy nhất, ech42 cũng được tạo ra nhiều. Sự biểu hiện của ech42 bị ức chế bởi glucose và được kích hoạt bởi cường độ ánh sáng quá nhiều và những điều kiện stress về dinh dưỡng (Carsolio và ctv, 1994; Carsolio và ctv, 1998). 15 Vì endochitinase 42 kDa có tính ứng dụng trong thực tế cao, một số nhà nghiên cứu đã dùng một số kỹ thuật để thu nhận đoạn gen ech42 sau đó chuyển vào các vi sinh vật có khả năng sản xuất enzyme nhanh: vi khuẩn E. coli, nấm men Saccharomycese cerevisiae, Trichoderma reesei, với mục đích thu enzyme endochitinase ở số lượng lớn. Carsolio và ctv (1994) đã tạo ra mẫu T. harzianum mang nhiều bản sao của gen mã hóa endochitinase. Ngoài ra, cDNA của gen ech42 được tách ra, đưa vào vi khuẩn E. coli nuôi cấy để gia tăng nhanh sản lượng enzyme. 2.3. Những nghiên cứu về đa dạng sinh học ở nấm Trichoderma 2.3.1. Những nghiên cứu trên vùng ITS – rDNA Theo Samuels (2004), những nghiên cứu dựa vào trình tự DNA được ứng dụng vào phân tích phân loại Trichoderma đầu tiên vào giữa những năm 1990. Với những phân tích về hình thái, các nhà nghiên cứu chưa đưa ra được một kết luận chính xác về các mức độ loài và dưới loài mà cần phải có sự kết hợp với phân tích di truyền phân tử để dịnh danh và phân loại nấm Trichoderma (Bisset, 1991a, 1991b và 1991c). Năm 1994, Rehner và Samuels đã dùng trình tự của vùng tiểu đơn vị lớn của rDNA để chứng minh rằng Gliocladium virens là một loài của Trichoderma, và không có quan hệ gần với giống Gliocladium. Năm 1997, Kuhls đã khẳng định giống phụ Longibrachiatum bằng trình tự của vùng ITS – rDNA là một nhóm phân biệt và giống phụ Saturnisporum không thể là một nhánh từ giống phụ Longibrachiatum mặc dù những bào tử đính của nó có cùng đặc điểm gồ ghề (Samuels, 2004). Năm 1998, Kindermann và ctv, dùng vùng ITS để phân tích mối quan hệ của loài Trichoderma trong giống phụ Pachybasium, chứng minh giống phụ Pachybasium là một giống phụ đa nhóm, chia các loài trong giống phụ thành ba nhóm chính. Druzhinina và ctv (2005b) tìm thấy sự thay đổi trình tự trên vùng ITS của 88 loài nấm Trichoderma trong tổng số 979 mẫu phân tích. Sự thay đổi này đặc trưng cho giống và cho các loài Trichoderma, tạo ra sự khác biệt rõ ràng giữa các loài 16 khác nhau trong cùng giống. Dựa vào sự khác biệt đặc trưng này, Druzhinina và ctv (2005b) đã tìm ra những vùng DNA chỉ thị riêng cho từng loài Trichoderma và tạo ra một chương trình nhận dạng trình tự của các loài nấm Trichoderma, TriOkey trên trang web www.isth.info. Tuy nhiên, những kết quả đôi khi không có độ tin cậy cao, vì ITS là vùng phổ biến ở các loại nấm, dễ gây nhầm lẫn với các loài nấm khác. Đặc biệt là một số giống phụ gần với nấm Fusarium cũng có mang một số bản sao của nhóm gen rDNA này (Druzhinina và ctv, 2005a). 2.3.2. Những nghiên cứu phân tích kết hợp ITS – rDNA và các đơn gen Năm 2000, các nhà vi nấm học nghiên cứu về sự phát sinh loài của Trichoderma, thường kết hợp phân tích nhiều marker phân tử cùng lúc để có được kết quả chính xác hơn so với những phân tích với một marker duy nhất. Kullnig – Gardinger và ctv (2002) dùng 4 vị trí khác nhau: ITS, mitssuDNA, intron ngắn thứ 5 tef1 và một đoạn của exon lớn của ech42, để đánh giá sự phát sinh loài trên toàn cầu của giống Trichoderma. Cây phát sinh dòng được tạo ra có bốn nhánh chính, phân biệt các giống phụ khác nhau của giống Trichoderma. Tuy nhiên, các gen được dùng cho phân tích không phù hợp cho tất cả các mẫu nấm nghiên cứu, nên phân tích chưa phân biệt được về phát sinh dòng một cách rõ ràng về các giống phụ Hypocreanum và Pachybasium, đưa ra một nền tảng định hướng cho những nghiên cứu phát sinh loài tiếp theo của hai giống phụ này. Bisset và ctv (2003) đã phát hiện thêm một số loài Trichoderma mới ở châu Á, dựa vào các đặc điểm hinh thái, đặc tính sinh lý của nấm và sự phân tích của các mẫu nấm này dựa trên vùng ITS – rDNA và một phần của tef1α . Bên cạnh đó, Chaverri và ctv (2003) phân tích vùng ITS, intron lớn tef1 và những đoạn nhỏ của những trình tự exon: actin (act1) và calmodulin (cal1) ở H. lixii T. harzianum, xác định sự phát sinh loài của bảy mẫu nấm Trichoderma. Overton và ctv (2006) dùng ITS, một phần trình tự của tiểu đơn vị RNA polymerase II (rpb2) và một phần của exon lớn của tef1 để nghiên cứu sự phân loại của 9 mẫu Hypocrea ở dạng vô tính (anamorph) có thể là loài Trichoderma thuộc giống phụ Hypocreanum. 17 Cùng với những nghiên cứu phát sinh, một số công trình điều tra về phân bố của các loài Trichoderma đã và đang được tìm hiểu và là một phần trong nghiên cứu sự đa dạng sinh học của nấm theo các khu vực địa lý và vùng lãnh thổ khác nhau. Kullnig và ctv (2000) phân tích 75 mẫu được phân lập ở Nga, Siberia và núi Himalaya, thu được số lượng mẫu T. harzianum chiếm đa số và chứng tỏ sự hiện diện rộng khắp của chúng trong khu vực. Với những loài Trichoderma thuộc giống phụ Longibrachiatum, chúng chỉ hiện diện ở những nơi có độ cao nhất định. Kubicek và ctv (2003) phân tích đa dạng di truyền của Trichoderma trong khu vực Đông Nam Á cũng chỉ ra sự hiện diện của T. harzianum chiếm ưu thế. Sự có mặt với số lượng nhiều của các loài: T. asperellum, T. atroviride và T. virens, là điểm khác biệt so với nghiên cứu ở Nga, Siberia và núi Himalaya. Zhang và ctv (2005) phân tích được sự phân bố của Trichoderma trên các vùng địa lý có độ cao và khí hậu khác nhau ở Trung Quốc (Hình 2.9). Loài T. harzianum phân bố theo một xu hướng từ Bắc đến Nam ở Đông Á. Phía Bắc của Trung Quốc là trung tâm điển hình của sự phân bố T. harzianum. Ở Việt Nam, những năm gần đây bắt đầu có sự quan tâm đến sự phát sinh loài của Trichoderma. L. H. T. Hoa (2006) đã có nghiên cứu ban đầu trên vùng ITS của rDNA và tef1 của nấm Trichoderma, phân tích sự khác biệt và phân nhóm của các mẫu nấm Trichoderma spp. có mặt trên các đối tượng ở các địa điểm khác nhau trên đất nước Việt Nam. Tuy nhiên, phân tích được thực hiện với số lượng mẫu hạn chế nên chưa cho độ tin cậy cao, chưa được thực hiện trên số lượng lớn các loài Trichoderma, đa dạng trên các đối tượng và các khu vực địa lý khác nhau. 18 2.4. Ý nghĩa của công tác phân loại nấm Trichoderma Bên cạnh những tác dụng tốt trong nông nghiệp của Trichoderma, một số loài của Trichoderma có khả năng gây bệnh trên một số loại nấm ăn (Komón – Zelazowska, 2007; Szczech và ctv, 2008) và cả trên người và động vật. Muzor và ctv (1997), người đầu tiên phát hiện ra T. longibrachiatum có thể gây bệnh ở người. Sự lây nhiễm Trichoderma là cơ hội và phát triển ở những bệnh nhân bị bệnh tự miễn như trường hợp rối loạn bạch cầu và người được cấy ghép nội tạng. Trichoderma được phân lập trong một số bệnh nhân bị gây viêm xoang dị ứng với nấm (Tang và ctv, 2003) và ở mô phổi của bệnh nhân bị bệnh sơ hóa phổi (Druzhinina và ctv, 2008). Do vậy, việc định danh tên loài và phân loại chính xác các loài nấm Trichoderma là cần thiết. Công tác phân loại phân biệt được loài nấm gây bệnh và không gây bệnh, nhằm giúp hạn chế được các thiệt hại do các loài gây bệnh ra cho người sản xuất và cây trồng khi tiếp xúc trực tiếp với nấm Trichoderma. 19 Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện Thời gian tiến hành từ tháng 3 năm 2008 đến tháng 4 năm 2009. Địa điểm tiến hành thí nghiệm tại phòng Bảo vệ thực vật, khoa Nông học, trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh và Viện Nghiên cứu Công nghệ sinh học và môi trường – phòng Công nghệ sinh học thực vật, trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh. 3.2. Nội dung nghiên cứu Đề tài được thực hiện với các nội dung chính: • Phân tích định danh và phân nhóm các mẫu nấm Trichoderma spp. dựa vào các trình tự ở các vùng ITS – rDNA và ech42. • Phân tích sự đa dạng loài của Trichoderma. 3.3. Vật liệu nghiên cứu 3.3.1. Các mẫu nấm Ba mươi chín mẫu nấm – MPT (mẫu phân tích) được phân lập và định danh hình thái tại Bộ môn Bảo vệ thực vật, trường Đại học Nông lâm TP. Hồ Chí Minh. Các mẫu Trichoderma spp. được sử dụng có các đặc điểm là đã được định danh hình thái; được phân tích tính đối kháng với các loại nấm gây bệnh trên cây trồng như Phytophthora capsici, Furasium spp., Sclerotium rolfsii, Rhizoctonia solani. 1 Bảng 3.1: Các mẫu Trichoderma được sử dụng trong nghiên cứu STT Ký hiệu Đối tượng lấy mẫu Địa điểm phân lập Tên định danh bằng hình thái Tính đối kháng S. rolfsii R. solani P. capsici F. spp. 1 T29 Cây trà, tỉnh Lâm Đồng, thị xã Bảo Lộc T. asperellum +++ +++ + 2 T18 Đất đậu phộng, tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu T. asperellum ++ +++ 3 T101L Đất mới khai hoang, tỉnh Gia Lai T. asperellum + + + 4 T31 Đất nông nghiệp, TP. Cần Thơ T. asperellum + +++ 5 T77 Đất rừng, Khánh Hòa, Đà Lạt T. asperellum +++ +++ +++ + 6 T75 Đất rừng, Khánh Hòa, Đà Lạt T. asperellum +++ ++ ++ ++ 7 T13 Đất trồng ca cao, TP. Hồ Chí Minh, quận Thủ Đức T. asperellum ++ 8 T5 Đất trồng dứa, tỉnh Bạc Liêu, thị xã Mỏ Cày T. asperellum + +++ ++ 9 T162 Đất vườn, tỉnh Đồng Nai T. asperellum +++ +++ ++ 10 T231H Đất, tỉnh Bạc Liêu T. asperellum +++ + 11 T93L Thân cây sầu riêng, tỉnh Daklak, TP. Buôn Mê Thuộc T. asperellum ++ +++ +++ +++ Ký hiệu. +++: kháng mạnh; ++: kháng trung bình; +: kháng yếu; : không kháng 2 Bảng 3.1: Các mẫu Trichoderma được sử dụng trong nghiên cứu (tt) STT Ký hiệu Đối tượng lấy mẫu Địa điểm phân lập Tên định danh bằng hình thái Tính đối kháng S. rolfsii R. solani P. capsici F. spp. 12 T55 Gỗ mục, TP. Hồ Chí Minh, quận Thủ Đức T. asperellum + ++ 14 T89 Cây mãng cầu, tỉnh Tây Ninh T. asperellum T. harzianum +++ +++ +++ 17 T133H Đất đậu phộng, tỉnh Tây Ninh, huyện Tân Châu T. asperellum T. harzianum + +++ +++ ++ 13 T30 Đất nông trường, TP. Hồ Chí Minh T. asperellum T. harzianum +++ +++ 16 T164 Đất núi, tỉnh Ninh Thuận, huyện Ninh phước T. asperellum T. harzianum +++ 15 T128H Đất vườn, tỉnh Đồng Nai, huyện Định Quán T. asperellum T. harzianum + +++ +++ + 20 T138 Thân cây dó bầu, TP. Hồ Chí Minh, quận Thủ Đức T. harzianum ++ ++ ++ +++ 22 T70 Đất rừng, tỉnh Bình Phước, xã Trà Thiết T. harzianum +++ +++ + 18 T158 Đất trồng cao su, tỉnh Bình Phước T. harzianum + 19 T186 Quả cau, tỉnh Trà Vinh, huyện Trà Cú T. harzianum +++ +++ + 21 T178 Thân cây cao su, tỉnh Bình Phước T. harzianum + +++ +++ Ký hiệu. +++: kháng mạnh; ++: kháng trung bình; +: kháng yếu; : không kháng 3 Bảng 3.1: Các mẫu nấm Trichoderma được sử dụng trong phân tích (tt) STT Ký hiệu Đối tượng lấy mẫu Địa điểm phân lập Tên định danh bằng hình thái Tính đối kháng S. rolfsii R. solani P. capsici F. spp. 23 T39 Thân cây bắp, tỉnh Đồng Nai T. koningii +++ 24 T56 Vỏ cây dó bầu, tỉnh Bình Phước T. koningiii T. sinensis + ++ +++ 25 T45 Đất đậu phộng, tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu T. koningiii T. sinensis + + ++ +++ 27 T187 Thân tre khô, TP. Hồ Chí Minh, quận Thủ Đức T. longibrachiatum +++ +++ +++ 26 T87 Đất rừng khai hoang, tỉnh Bình Phước, xã Trà Thiết T. longibrachiatum +++ 29 T165 Đất nông nghiệp, Côn Đảo T. longibrachiatum T. sinensis 28 T36 Đất trồng cà chua, TP. Hồ Chí Minh, huyện Củ Chi T. longibrachiatum T. sinensis + +++ 32 T17 Đất nông nghiệp, TP. Hồ Chí Minh T. sinensis +++ +++ + 31 T8 Đất nông trường, TP. HCM, huyện Bình Chánh T. sinensis ++ +++ + + 30 T4 Đất vườn, TP. HCM, huyện Củ Chi T. sinensis 33 T67 Đất rừng, tỉnh Bình Phước, xã Trà Thiết T. virens +++ ++ +++ +++ Ký hiệu. +++: kháng mạnh; ++: kháng trung bình; +: kháng yếu; : không kháng 4 Bảng 3.1: Các mẫu Trichoderma được sử dụng trong nghiên cứu(tt) STT Ký hiệu Đối tượng lấy mẫu Địa điểm phân lập Tên định danh bằng hình thái Tính đối kháng S. rolfsii R. solani P. capsici F. spp. 38 T103L Đất mới khai hoang, tỉnh Gia Lai T. virens +++ +++ +++ + 34 T79 Đất rừng, tỉnh Gia Lai T. virens +++ ++ +++ 35 T92L Đất trồng ca cao, tỉnh Daklak, TP. Buôn Mê Thuộc T. virens +++ +++ +++ 36 T95L Đất trồng hồ tiêu, tỉnh Daklak, huyện Cư M`Gar `T. virens +++ +++ +++ + 37 T98L Đất trồng hồ tiêu, tỉnh Gia Lai, huyện Mang Yang T. virens +++ + ++ 39 T51 Gỗ cao su, tỉnh Long An T. viride +++ +++ Ký hiệu. +++: kháng mạnh; ++: kháng trung bình; +: kháng yếu; : không kháng 1 3.3.2. Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu • Nuôi cấy tăng sinh khối với môi trường chứa các hóa chất: MgSO4 0,5 g; KH2PO4 0,5 g; K2HPO4 0,5 g; CaCl2 rất ít; yeast extract 5 g và glucose 20 g (thành phần trong 1 lít môi trường). • Ly trích DNA tổng số với hóa chất gồm: nitơ lỏng (dùng để nghiền mẫu); dung dịch lysis buffer (Tris – HCl 50 mM pH = 7,2; EDTA 50 mM; SDS 3 %; 2 – mercaptoethanol 1 %); phenol cloroform isoamyl cloroform (25:24:1); cloroform isoamyl cloroform (24:1); isopropanol 100 %; sodium acetate 3 M pH = 5,2; ethanol 70% và TE 1 X (Tris – HCl 10 mM và EDTA 1 mM pH = 8,0). • Điện di trên gel agarose với dung dịch đệm TAE 0,5 X (Tris HCl; Na2EDTA 0,5 M (pH 8,0); Glacial acetic acid; Nước cất). • Phản ứng PCR gồm có các thành phần: primer (primer xuôi và primer ngược), dung dịch đệm cho phản ứng, enzyme Taq polymerase, MgCl2, dNTP và nước khử ion hấp khử trùng (Promega). 3.3.3. Dụng cụ và trang thiết bị thí nghiệm • Bộ pipette: 0,5 – 10; 10 – 100; 100 – 1000 μl cùng với các loại đầu tip cùng loại tương ứng. • Eppendorf 1,5 ml; 200 μl. • Máy ly tâm, máy PCR Eppendoft, máy điện di, vortex, bồn ủ nhiệt, tủ cấy vô trùng. 3.4. Phương pháp thực hiện 3.4.5. Tăng sinh khối và thu nhận sinh khối nấm Trichoderma spp. Ổn định đặc tính của nấm. Từ môi trường WA, nấm được cấy chuyền sang môi trường PGA, sau 2 – 3 ngày nấm mọc lan ra khắp bề mặt thạch trên đĩa petri, đường kính khoảng 5 – 6 cm. Tăng sinh trên môi trường lỏng: nhiều khối nấm được cấy vào môi trường tăng sinh ở các bình tam giác, lắc liên tục từ 48 – 72 giờ ở nhiệt độ phòng (28 – 300C) ở tốc độ 150 vòng phút. 2 Tản nấm hay sợi nấm được thu trên mảng vải lọc, có chất liệu trơn và không bám đính. Sau khi lọc bỏ môi trường tăng sinh, sinh khối nấm được cán mỏng trên bề mặt giấy bạc. Mẫu nấm sau khi thu được có thể nghiền ngay với ni tơ lỏng hoặc được trữ ở – 700C. 3.4.6. Ly trích DNA tổng số của Trichoderma DNA được ly trích theo phương pháp của Lee và Taylor (1990) và có cải tiến gồm các bước sau: 1. Mẫu nấm sau khi nghiền thật kỹ với nitơ lỏng thành dạng bột, được cho vào (khoảng ½ thể tích) eppendorf 1,5 ml; thêm 500 μl lysis buffer. Trộn đều bằng máy vortex và ủ mẫu ở 650C trong 1 – 2 giờ. 2. Lấy mẫu ủ ra, thêm vào 300 μl dung dịch phenol cloroform isoamyl cloroform (25:24:1) và trộn đều. Ly tâm mẫu ở tốc độ 12.000 vòng phút trong 10 phút ở 40C. 3. Hút khoảng 450 μl dịch bên trên cho vào eppdendorf 1,5 μl mới. Lặp lại bước 2 nhưng thay bằng dung dịch cloroform isoamyl cloroform (24:1). 4. Thêm 60 %V isopropanol và 3 %V sodium acetate vào, đảo nhẹ eppdendorf khoảng 8 – 10 lần và ủ mẫu ở – 200C trong 30 phút hoặc qua đêm. 5. Ly tâm mẫu với tốc độ 12.000 vòng phút trong 5 phút ở 40C. 6. Loại bỏ phần dịch nổi, thu nhận kết tủa bên dưới và rửa lại bằng ethanol 70 %. Ly tâm với tốc độ 12.000 vòng phút trong 5 phút ở 40C. 7. Làm khô kết tủa ở điều kiện nhiệt độ phòng. Hòa tan kết tủa trong 100 μl dung dịch TE 1X. Mẫu được trữ ở 40C. Các sản phẩm DNA sau ly trích được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose với nồng độ 1 %. 3.4.7. Quy trình thực hiện phản ứng PCR Mỗi phản ứng PCR gồm có các thành phần hóa chất chính: dung dịch đệm (Taq buffer) 1 X, MgCl2 1,5 mM, dNTP 0,2 mM, primer mỗi loại 10 pmol µl, Taq polymerase 1 U, DNA khuôn 100 ng và nước khử ion. Tổng thể tích của mỗi phản ứng PCR là 50 µl. 3 Quy trình phản ứng PCR trên vùng ITS với cặp primer ITS4 và ITS5 (Bảng 3.2) gồm 3 bước: tách DNA ở 950C trong 3 phút; thực hiện 30 chu kỳ 950C trong 1 phút, 580C trong 45 giây và 720C trong 1 phút; 1 chu kỳ ở 720C trong 7 phút. Quy trình phản ứng PCR trên vùng ech42 với cặp primer chit42 – 1a và chit42 – 2a (Bảng 3.2) gồm 3 bước: tách DNA ở 940C trong 3 phút; thực hiện 30 chu kỳ 940C trong 1 phút, 620C trong 45 giây và 720C trong 1 phút; 1 chu kỳ ở 720C trong 7 phút. Bảng 3.2: Trình tự các cặp primer tương ứng trong phản ứng PCR Primer Trình tự Tác giả tham khảo ITS ITS4: T

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH ….WUX… HUỲNH THỊ MỸ PHI ĐỊNH DANH LỒI VÀ PHÂN TÍCH SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA NẤM Trichoderma spp DỰA VÀO TRÌNH TỰ VÙNG ITS ech42 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 11/ 2009 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH ….WUX… HUỲNH THỊ MỸ PHI ĐỊNH DANH LỒI VÀ PHÂN TÍCH SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA NẤM Trichoderma spp DỰA VÀO TRÌNH TỰ VÙNG ITS ech42 Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học Mã số : 60.42.80 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP Hướng dẫn khoa học: TS LÊ ĐÌNH ĐƠN Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 11/ 2009 i LÝ LỊCH CÁ NHÂN Tôi tên Huỳnh Thị Mỹ Phi sinh ngày 18 tháng 11 năm 1983 huyện An Nhơn, tỉnh Bình Định Con Ơng Huỳnh Kim Hùng Bà Nguyễn Thị Tuyết Mai Tốt nghiệp Trung học Phổ thông Trường Trung học phổ thông An Nhơn I, tỉnh Bình Định Tốt nghiệp Đại học ngành Cơng nghệ Sinh học hệ quy trường Đại học Nơng Lâm, TP Hồ Chí Minh Tháng năm 2006 theo học cao học ngành Công nghệ Sinh học trường Đại học Nơng Lâm, Thủ Đức, thành phố Hồ Chí Minh Tình trạng gia đình: độc thân Địa liên lạc: 18 Quang Trung, Thị trấn Bình Định, huyện An Nhơn, tỉnh Bình Định Điện thoại: 0983596082 Email: myphi1811@yahoo.com ii LỜI CAM ĐOAN Tơi cam đoan cơng trình nghiên cứu Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Ký tên Huỳnh Thị Mỹ Phi iii LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn: TS Lê Đình Đơn, trưởng Bộ môn Công Nghệ Sinh học, Trường Đại học Nông Lâm, hướng dẫn tận tình suốt trình làm luận văn tốt nghiệp TS Từ Thị Mỹ Thuận, Th.S Lê Cao Lượng cho tơi ý kiến đóng góp để hồn thành luận văn tốt nghiệp PGS.TS Nguyễn Ngọc Tuân tập thể cán Phòng Đào tạo Sau Đại học trường Đại học Nông Lâm TP HCM nhiệt tình giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi thời gian học tập hoàn thành luận văn tốt nghiệp TS Trần Thị Lệ Minh tập thể cán bộ, giáo viên Bộ môn Công Nghệ Sinh học, trường Đại học Nông Lâm TP HCM giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi suốt trình học tập Tập thể cán Trung tâm phân tích hóa sinh, Viện Cơng Nghệ Sinh học Công nghệ môi trường, trường Đại học Nông Lâm TP HCM tạo điều kiện hồn thành thí nghiệm liên quan luận văn tốt nghiệp Ks Nguyễn Văn Lẫm Ks Trần Thị Vân giúp đỡ tơi q trình làm thí nghiệm liên quan luận văn Các anh, chị bạn lớp CHSH2006, ủng hộ động viên học tập sống Bạn bè người thân quan tâm, động viên suốt trình học tập làm luận văn tốt nghiệp Tác giả luận văn, Huỳnh Thị Mỹ Phi iv TĨM TẮT Đề tài “Định danh lồi phân tích đa dạng di truyền nấm Trichoderma spp dựa vào trình tự vùng ITS-rDNA ech42” tiến hành nhằm xác định mức độ tương đồng số liệu hình thái liệu phân tử định danh tên loài Trichoderma xem xét mức độ biến đổi cá thể quần thể nấm diện Ba mươi chín mẫu nấm Trichoderma phân lập từ nhiều vùng địa lý khác trình tự vùng ITS – rDNA ech42 sử dụng để so sánh phân tích định danh lồi nhờ vào so sánh liệu GenBank kết hợp với cơng cụ TrichOKey www.isth.info Sự phân nhóm di truyền 39 MPT phân tích sơ đồ phân nhóm phân tích ma trận khoảng cách di truyền, Neighbor – Joining Kết khẳng định loài Trichoderma diện mẫu phân tích Trong đó, 18 MPT T asperellum; MPT T harzianum; MPT T virens; MPT T longibrachiatum MPT T koningii phân bố section Trichoderma, Pachybasium Longibrachiatum, với mẫu có kết định danh khác biệt hình thái phân tử Có biến động di truyền mẫu Trichoderma loài T asperellum T harzianum ghi nhận nghiên cứu Vùng ITS1 – rDNA cho thấy khác biệt đặc trưng cho lồi nhiều vùng ITS2, sử dụng cơng cụ để phân tích định danh tên lồi Trichoderma Các mẫu Trichoderma phân nhóm tách biệt với mẫu Trichoderma so sánh từ liệu từ GenBank Chứng tỏ Trichoderma Việt Nam quần thể địa chưa có tượng xâm lấn ngoại lai v SUMMARY The thesis "Species identification and genetic diversity of Trichoderma spp based on the ITS – rDNA and ech42 sequences" was conducted to determine the concurrence of morphological and molecular data in identification the scientific name of Trichoderma isolates and to evaluate the genetic diversity among individuals in present fungal populations Thirty – nine Trichoderma isolates from different geographical regions and their ITS – rDNA and ech42 sequences were used for comparison analysis with reference data on GenBank by using TrichO Key (www.isth.info) The genetic clustering of the 39 MPT was performed based on the genetic distance matrix and Neighbor – Joining analyse The results confirmed at least five Trichoderma species presenting in which 18 MPT were T asperellum; MPT, T harzianum; MPT, T virens; MPT, T longibrachiatum; and MPT, T koningii, those species belonging to three sections as Trichoderma, Longibrachiatum and Pachybasium It was also found that six isolates were not identified based on morphology and molecules data There was a genetic variation among isolates in a species such as in T asperellum and T harzianum ITS1 - rDNA region showed specific differences to each species in compared with ITS2 region, and it could be used as a tool to identity the scientific name of Trichoderma isolates Studied Trichoderma isolates were grouped separately from GenBank reference isolates suggesting that Trichoderma species in the study originated from an indigenous population vi MỤC LỤC CHƯƠNG TRANG Trang tựa Trang chuẩn y i Lý lịch cá nhân ii Lời cam đoan iii Lời cảm tạ iv Tóm tắt v Mục lục vii Danh sách chữ viết tắt x Danh sách bảng xi Danh sách hình xii Chương MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu 1.3 Yêu cầu Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan nấm Trichoderma 2.1.1 Phân loại phân bố 2.1.2 Đặc điểm sinh học nấm Trichoderma 2.1.2.1 Đặc điểm hình thái học tế bào nấm 2.1.2.2 Đặc tính sinh lý sinh hóa 2.1.2.3 Cơ chế đối kháng nấm Trichoderma nấm gây bệnh vii 2.1.3 Ứng dụng Nông nghiệp, bảo vệ thực vật 2.2 Tổng quan vùng bảo tồn 10 2.2.1 Vùng ITS – rDNA sinh vật 10 2.2.2 Tổng quan ech42 – Endochitinase 42 12 2.3 Những nghiên cứu đa dạng sinh học nấm Trichoderma 15 2.3.1 Những nghiên cứu vùng ITS – rDNA 15 2.3.2 Những nghiên cứu phân tích kết hợp ITS – rDNA gen đơn 16 2.4 Ý nghĩa phân loại nấm Trichoderma 18 Chương 19 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 19 3.1 Thời gian địa điểm thực 19 3.2 Nội dung nghiên cứu 19 3.3 Vật liệu nghiên cứu 19 3.3.1 Các mẫu nấm 19 3.3.2 Hóa chất sử dụng nghiên cứu 24 3.3.3 Dụng cụ trang thiết bị thí nghiệm 24 3.4 Phương pháp thực 24 3.4.1 Tăng sinh khối thu nhận sinh khối nấm Trichoderma 24 3.4.2 Ly trích DNA tổng số nấm Trichoderma 25 3.4.3 Quy trình thực phản ứng PCR 25 3.4.4 Phương pháp định danh phân tích đa dạng loài 26 3.4.4.1 Phương pháp định danh mẫu nấm Trichoderma phân lập 26 3.4.4.2 Phân tích đa dạng loài nấm Trichoderma 28 Chương 29 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29 4.1 So sánh kết định danh tên lồi theo hình thái phân tử dựa vùng ITS – rDNA 29 4.2 Sự khác biệt di truyền loài nấm Trichoderma spp dựa vào trình tự vùng ITS – rDNA 32 viii Bảng 4.10: Kết định danh theo hình thái trình tự vùng ITS ech42 STT Tên mẫu Tên loài định danh Tên loài định danh hình thái vùng ITS - rDNA Tên lồi định danh vùng ech42 Tên loài % T101L T asperellum T asperellum T asperellum 100 T55 T asperellum T asperellum T asperellum 99 T5 T asperellum T asperellum/ T hamatum T asperellum 100 T18 T asperellum T asperellum/ T harzianum T asperellum 100 T30 T asperellum/ T harzianum T asperellum T asperellum 100 T89 T asperellum/ T harzianum T asperellum T asperellum 100 T128H T asperellum/ T harzianum T asperellum/ T harzianum T asperellum 99 T186 T harzianum T asperellum T asperellum 99 T51 T viride T asperellum T asperellum/ T viride 99 10 T178 T harzianum T harzianum/ T aureoviride T harzianum 99 11 T39 T koningii T erinaceum T koningii 93 12 T45 T koningii/ T sinensis T koningii/ T koningiopsis T koningii 96 Bảng 4.11: Tỷ lệ tương đồng (%) trình tự DNA vùng ech42 12 MPT TÊN MẪU (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11) T5-T.asp (1) 100 T18-T.asp (2) 100 100 T186-T.asp (3) 100 100 100 T30-T.asp (4) 99,74 99,74 99,74 100 T55-T.asp (5) 98,41 98,41 98,39 98,67 100 T128H-T.asp (6) 98,41 98,41 98,4 98,68 100 100 T89-T.asp (7) 98,81 98,81 98,8 99,08 99,6 99,61 100 T101L-T.asp (8) 98,81 98,81 98,8 99,08 99,6 99,61 100 100 T51-T.asp (9) 99,33 99,33 99,32 99,6 99,06 99,06 98,65 98,65 100 T39-T.kon (10) 93,13 93,13 93,04 93,41 93,4 93,41 93,83 93,83 91,9 100 T45-T.kon (11) 92,26 92,26 92,26 92,56 92,25 92,25 92,7 92,7 92,1 91,94 100 T178-T.haz (12) 80,7 80,7 80,47 81,04 80,39 80,36 80,88 80,88 80,25 80,38 80,65 (12) 100 Tỷ lệ tương đồng (%) tính vị trí nucleotide thay đổi (không bao gồm nucleotide) Chương trình DNAdist phần mềm PHYLIP version 3.66 A B Hình 4.8: Sơ đồ phân nhóm 12 MPT vùng ech42 Sơ đồ phân tích thuật tốn Neighbor – Joining Ký hiệu tên lồi kèm theo MPT kết định danh loài Số bên nhánh lần lặp lại 1000 lần nhánh Nhánh có số lần lặp < 50 % nhánh Chín MPT lồi T asperellum có dao động tỷ lệ tương đồng trình tự, từ 98,39 – 100 % Chứng tỏ có biến động trình tự vùng ech42 loài T asperellum Loài T asperellum phân chia thành nhóm tách biệt nhau, A B với độ tin cậy cao So sánh phân nhóm tồn vùng ITS – rDNA (Hình 4.5) với vùng ech42 MPT lồi T asperellum, kết thu giống Điều chứng minh phân nhóm ITS – rDNA xác phù hợp với kết thu vùng ech42 khẳng định biến động quần thể lồi T asperellum mà khó xác định hình thái 4.8 Thảo luận chung Trichoderma thường tìm thấy nhiều tự nhiên, đặc biệt đất thân mục (Samuels, 2004; Harman, 2005; Druzhinina ctv, 2006) Ba mươi chín mẫu nấm Trichoderma sử dụng nghiên cứu, thu thập từ nhiều vật chủ vùng địa lý khác miền Nam Việt Nam Các mẫu phân lập từ loại đất chiếm đa số nghiên cứu, chứng tỏ diện Trichoderma đất phong phú Hơn 100 lồi Trichoderma tìm thấy Nhờ vào khả đối kháng với nấm gây bệnh hệ enzyme phân giải mạnh, Trichoderma sử dụng làm chất kiểm soát sinh học cơng tác phòng ngừa trị bệnh cho trồng loại nấm gây bệnh (Samuels, 2004; Harman, 2005) Tuy nhiên, số lồi Trichoderma, điển hình T longibrachiatum, có khả gây bệnh, tìm thấy số nội tạng bệnh nhân (Muzor ctv, 1997; Tang ctv, 2003; Druzhinina ctv, 2008) Vì đa dạng chủng loài tác dụng quần thể Trichoderma, nên việc phân loại Trichoderma cần thiết nghiên cứu ứng dụng vào thực tiễn Việc xác định tên loài Trichoderma thường dựa vào yếu tố: đặc tính hình thái, phản ứng sinh hóa liệu phân tử nấm Các đặc điểm hình thái Trichoderma mơ tả sử dụng nhiều phân tích định danh tên loài nấm (Bissett, 1991; Lieckfeldt, 1998; Bissett, 2003; Samules, 2004) Ba mươi chín mẫu nấm Trichoderma định danh hình thái, tổng cộng lồi: T asperellum, T harzianum, T koningii, T longibrachiatum, T sinensis, T virens T viride Vì số lồi Trichoderma đặc tính hình thái giống nhau, gây khó khăn cho công tác phân loại nấm Trong 39 MPT, mẫu cho kết lẫn lộn loài T asperellum T harzianum, mẫu lẫn lộn T koningii T sinensis, mẫu lẫn lộn T longibrachiatum T sinensis Do đó, kết hợp phân tích hình thái với liệu phân tử cho kết xác sử dụng năm 1990 (Samuels, 2004) Hiện nay, 100 loài Trichoderma phát liệu phân tử (Druzhinina ctv, 2006) Các liệu phân tử dưa vào Chương trình TrichOKey TrichoBLAST để phát lồi Trichoderma cách xác nhờ vào vùng DNA thị (Druzhinina ctv, 2005a) DNA thị toàn vùng ITS – rDNA nằm vùng ITS1 ITS2 Đó điểm khác biệt đặc trưng cho lồi Trong nghiên cứu này, 39 mẫu phân tích định danh dựa trình tự vùng ITS – rDNA, xác định loài: T asperellum, T harzianum, T longibrachiatum, T koningii, T erinaceum, T spirale, T reesei T virens Đây kết định danh thu nhận từ kết so sánh liệu GenBank, NCBI kết hợp với liệu TrichOKey, www.isth.info (Druzhinina ctv, 2005a) Kết so sánh tương đồng trình tự vùng ITS - rDNA 39 MPT cho thấy mẫu loài T harzianum khác biệt trình tự với nhiều Sự khác biệt xảy vùng ITS1 ITS2 Có thể, khác biệt biến dị di truyền T harzianum Và điều Kullnig ctv (2000) chứng minh loài T harzianum có dạng biến dị di truyền So sánh kết tương đồng trình tự 39 MPT vùng ITS1 ITS2, vùng ITS1 cho kết biến động trình tự nhiều so với vùng ITS2 Dodd ctv (2000) chứng minh điều phân tích biến động di truyền Trichoderma Do vậy, số nghiên cứu khác phân tích Trichoderma vùng ITS1 (Kindermann ctv, 1998; Siddiquee ctv, 2007) Kết nghiên cứu cho thấy cần phân tích vùng ITS1 cặp primer: forward primer ITS5 reverse primer ITS2; forward primer ITS1 reverse primer ITS2 (Hình 2.6, White ctv, 1989) đủ xác định lồi nấm Kết phân nhóm di truyền Trichoderma vùng ITS – rDNA cho thấy 39 MPT phân nhóm với theo lồi giống phụ giống Trichoderma (Kubicek ctv, 2003; Druzhinina ctv, 2005a) Và có giống phụ xác định Việt Nam: Trichoderma, Pachybasium Longibrachiatum Mỗi nhóm thể mối quan hệ di truyền gần gũi lồi Trichoderma nhóm Sự phân nhóm di truyền vùng ITS - rDNA cho thấy biến dị quần thể loài T asperellum Các mẫu T asperellum phân chia thành nhóm với sơ đồ phân nhóm liệu phân tích vùng ITS – rDNA ech42 Đây biến dị di truyền, mà khơng thể quan sát mắt thường phân tích dựa vào tiêu hình thái lồi T asperellum Kết phân nhóm với mẫu Trichoderma GenBank cho thấy MPT Việt Nam phân tách riêng biệt, khơng có lẫn lộn với mẫu Thế giới Đây vấn đề nghiên cứu đa dạng di truyền Trichoderma Việt Nam, khẳng định loài Trichoderma Việt Nam chưa có xâm nhiễm lồi giới bảo tồn tính địa lồi Ba mươi chín MPT phân tích tính kháng với loại nấm gây bệnh cho trồng: Scleroticum rolfsii, Rhizoctonia solani, Phytophthora capsici Fusarium spp (Bảng 3.1) Kết cho thấy tính kháng xảy khơng đồng MPT lồi với Có thể tính đối kháng nấm Trichoderma phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác yếu tố loài ký chủ địa điểm phân lập nấm Và MPT cho thấy tính kháng với nấm Phytophthora capsici nhiều loại nấm gây bệnh Theo Yaqub F Shahzad S (2005) lồi Trichoderma có khả kháng mạnh với Sclerotium rolfsii, kết thí nghiệm lại thu hoàn toàn trái ngược Điều chứng tỏ, khả kháng mẫu Trichoderma có nhiều điểm khác biệt Mặc dù tính đối kháng Trichoderma thể có liên quan đến yếu tố lồi, kết phân tích tính đối kháng 39 MPT khơng cho thấy mối quan hệ với phân nhóm di truyền vùng ITS – rDNA Có thể, ITS – rDNA vùng gen trung tính, khơng quy định tính trạng (T.T.M Thuận, 2008), nên chưa có tài liệu chứng minh liên quan phân nhóm di truyền vùng ITS – rDNA tính đối kháng Ví dụ, mẫu nấm lồi T asperellum khả đối kháng với loại nấm gây bệnh trồng (Bảng 12) Bảng 4.12: Sự liên quan phân nhóm khả đối kháng với loại nấm gây bệnh loài T asperellum Kết định danh STT Ký hiệu phân tử Kết phân nhóm Tính đối kháng S R P F solani capsici spp rolfsii T101L T asperellum A + - + + T55 T asperellum A + - ++ - T89 T asperellum A +++ +++ +++ - T128H T asperellum A + +++ +++ + T5 T asperellum B - + +++ ++ T18 T asperellum B ++ - - +++ T30 T asperellum B - +++ +++ - T186 T asperellum B - +++ +++ + T51 T asperellum B - +++ +++ - Ký hiệu +++: kháng mạnh; ++: kháng trung bình; +: kháng yếu; -: khơng kháng Kết nghiên cứu phần nghiên cứu đa dạng sinh học nấm Trichoderma lãnh thổ Việt Nam Một số trình tự loài T asperellum vùng ITS – rDNA đăng ký Genbank, đóng góp có ý nghĩa việc cung cấp liệu khoa học cho nghiên cứu loài Trichoderma CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Dựa kết hợp kết định danh hình thái phân tử, kết nghiên cứu khẳng định tên loài Trichoderma tương ứng với 33 MPT Mười tám MPT thuộc loài T asperellum Bốn MPT thuộc loài T harzianum Sáu MPT thuộc loài T virens Ba MPT thuộc loài T longibrachiatum Và hai MPT thuộc loài T koningii Sự biến dị di truyền xảy loài T asperellum T harzianum Vùng ITS1 – rDNA cho thấy nhiều điểm khác biệt loài so với ITS2, chi phối kết phân nhóm di truyền nấm Trichoderma Có tương đồng phân nhóm dựa vào ITS – rDNA với ech42 chưa xác định mối liên quan phân nhóm ITS – rDNA với tính kháng với loài nấm gây bệnh cho trồng Chưa có xâm nhập ngoại lai mẫu nấm Trichoderma Việt Nam 5.2 Đề nghị Kiểm tra định danh lại MPT chưa xác định tên loài nấm Trichoderma dựa vùng gen đơn khác: translation elongation factor 1α (tef1α), calmodulin (cal1), actin (act1), RNA polymerase B subunit (rpb2) Tăng số lượng MPT lồi khác nhau, để tìm hiểu rõ đa dạng di truyền, đa dạng loài đa dạng sinh học loài nấm Trichoderma TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Lại Hà Tố Hoa, 2006 Định danh nấm Trichoderma spp dựa vào trình tự vùng ITS – rDNA vùng tef1 Luận văn tốt nghiệp kĩ sư Công nghệ sinh học, trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh Tơ Minh Châu Vương Thị Việt Hoa, 2000 Vi sinh vật học đại cương Trường Đại học Nông Lâm TP HCM , trang 59 – 71 Từ Thị Mỹ Thuận, 2008 Nghiên cứu đa dạng di truyền nấm Rhizoctonia solani KUHN gây bệnh số loài thực vật Việt Nam Luận án Tiến sĩ nông nghiệp, trường Đại học Nông Lâm TP HCM Tiếng Anh Bisset J., Szakactv G., Nolan C.A., Druzhinina I., Gradinger C and Kubicek C.P., 2003 New species of Trichoderma from Asia Can J Botany 81: 570 – 586 Bissett J., 1991a A revision of the genus Trichoderma II Infrageneric classification Can J Botany 69: 2357 – 2372 Bissett J., 1991b A revision of the genus Trichoderma III Sect Pachybasium Can J Botany 69: 2373 – 2417 Bissett J., 1991c A revision of the genus Trichoderma IV Additional notes on section Longibrachiatum Can J Botany 69: 2418 – 2420 Brinkman F.S.L., 2005 Chapter fourteen: Phylogenetic analysis, Bioinformatic: A pratical guide to the Analysis of Genes and proteins, Baxevanis A.D and Ouellette B.F.F, A John Wiley & Son, Inc, Publication, Canada, pp 366 – 392 Carsolio C., Benhamou N., Haran S., Cortés C., Gutiérrez A., Chet I and Herrera – Estrella A., 1998 Role of the Trichoderma harzianum endochitinase gene, ech42, in Mycoparasitism Applied and Environmental Microbiology 65: 929 – 935 10 Carsolio C., Gutiérrez A., Jiménez B., Van Montaqu M and Herrera-Estrella A., 1994 Characterization of ech – 42, a Trichoderma harzianum endochitinase gene expressed during mycoparasitism Proc Natl Acad Sci USA 91: 10903 – 10907 11 Chaverri P., Castlebury L.A., Samuels G.J and Geiser D.M., 2003 Multilocus phylogenetic structure within the Trichoderma harzianum/ Hypocrea lixii complex Molecular Phylogenetics and Evolution 27: 302 – 313 12 Dodd S.L., Crowhurst R.N., Rodrigo A.G., Samuels G.J., Hill R.A and Stewart A., 2000 Examination of Trichoderma phylogenies derived from ribosomal DNA sequence data Mycological research 104: 23 – 34 13 Dodd S.L., Lieckfeldt E and Samuels G.J., 2003 Hypocrea atroviridis sp nov., the telemorph of Trichoderma atroviride Mycologia 95: 27 – 40 14 Druzhinina I., Kopchinskiy A.G., Komon M., Bisset J., Szakactv G and Kubicek C.P., 2005a Technological advancement: An oligonucleotide barcode for species identification in Trichoderma and Hypocrea Fungal Genetics and Biology 42: 813 – 828 15 Druzhinina I and Kubicek C.P., 2005b Special concept and biodiversity in Trichoderma and Hypocrea: from aggregate species to species clusters Journal of Zeijiang University SCIENCE 6B: 100 – 112 16 Druzhinina I.S., Kopchinsky A.G., and Kubicek C.P., 2006 Review: The first 100 Trichoderma species characterized by molecular data Mycoscience 47: 55 – 64 17 Druzhinina, I S., LaFe, K., Willinger, B., Komoń-Zelazowska, M., Ammirati, J., Kubicek, C P and Rogers, J.D., 2008 An unknown species from Hypocreaceae isolated from human lung tissue of a patient with non-fatal pulmonary fibrosis Clinical Microbiology Newsletters 29: 180 – 184 18 Duo – Chuan L., 2006 Review of fungal chitinases Mycopathologia 161: 345 – 360 19 Felsenstein J., 2004 PHYLIP (Phylogeny Inference Package) version 3.6.6, Distributed by the author, Department of Genome Sciences, University of Washington, Seattle, USA 20 Gam W and Meyer W., 1998 What exactly is Trichoderma harzianum Rifai? Mycologia 90: 904 – 915 21 Garcia I., Lora J.M., De La Cruz J., Llobell A and Pintor – Toro J.A., 1994 Cloning and characterization of a chitinase (CHIT42) cDNA from the mycoparasitic fungus T harzianum Current Genetic 27: 83 – 89 22 Gardener M.B, 2005 Commercial biocontrol products available in the U.S.A For use against plant pathogens (http://www.oardc.ohio-state.edu/apsbcc/productlist2005USA.htm) 23 Grams W and Grafenhan T., 2006 Highlights of progress and remaining problems in the taxonomy of Trichoderma Keynote Lecture on 4th ISTH Meeting, Vienna, Austria 24 Guarro Josep, Gené Josepa, and Stchigel Alberto M., 1999 Developments in fungal taxonomy Clinical Microbiology Reviews 12: 454 – 500 25 Haran S., Schickler H., Oppenheim A and Chet I., 1995 New components of the chitinolytic system of Trichoderma harzianum Mycological Research 99: 441 – 446 26 Harman G.E., 2005 Overview of mechanism and uses of Trichoderma spp Phytopathology 96: 190 – 194 27 Harman G.E., Howell C R., Viterbo A., Chet I and Lorito M., 2004 Trichoderma species – opportunistic, avirulent plant symbionts Nature Reviews Microbiology 2: 43–56 28 Hayes C.K., Klemsdal S., Lorito M., Di Pietro A., Peterbauer C., Nakas J.P., Tronsmo A and Harman G.E., 1994 Isolation and sequence of an endochitinase – encoding gene from a cDNA library of Trichoderma harzianum Gene 138: 143 – 29 Kindermann J., El – Ayouti Y., Samuels G.J and Kubicek C.P., 1998 Phylogenetic of the genus Trichoderma based on sequence analysis of the internal transcribed spacer region of the rDNA clade Fungal Genetic and Biology 24: 298 – 309 30 Klein D and Eveleigh E., 1998 Ecology of Trichoderma In: Kubicel C.P., Harman G.E (Eds), Trichoderma and Gliocladium Basic Biology, Taxonomy and genetictv Taylor & Francis Ltd., London, UK p 57 – 74 31 Komón – Zelazowska M., Bissett J., Zafari D., Hatvani L., Manczinger L., Woo S., Lorito M., Kredics L., Kubicek C.P and Druzhinina I.S., 2007 Genetically Closely Related but Phenotypically Divergent Trichoderma Species Cause Green Mold Disease in Oyster Mushroom Farms Worldwide Applied And Environmental Microbiology 73: 7415–7426 32 Kubicek C.P., Bissett J., Kullnig – Gradinger C.M., Druzhinina I.S and Szakactv, G., 2003 Genetic and metabolic diversity of Trichoderma: a case study on South – East Asian isolates Fungal Genetic and Biology 38: 310 – 319 33 Kubicek C.P., Komon-Zelazowska M and Druzinina I.S., 2008 Review: Fungal genus Hypocrea/ Trichoderma: from barcodes to biodiversity Journal of Zheijiang University Science B 9: 753 – 763 34 Kullnig – Gradinger C., Szakacs G and Kubicek C.P., 2002 Phylogeny and evolution of the genus Trichoderma: a multigene approach Mycological Research 106: 757 – 767 35 Kullnig C., Szakactv G and Kubicek C.P., 2000 Molecular identification of Trichoderma species from Russia, Siberia and the Himalaya Mycological Research, 104: 1117 – 1125 10 36 Lee S.B and Taylor J.W., 1990 Isolation of DNA from fungal mycelia and single spores, PCR protocols, a guide to methods and applications, Innis M.A., Gelfand D.H., Sninsky J.J & White T.J (Ed), Academic Press, San Diego pp 282 – 287 37 Lieckfeldt E., Cavignac Y., Fekete C and Borner T., 2000a Endochitinase gene – bases phyolgenetic analysis for Trichoderma Microbiological Research 155: – 15 38 Lieckfeldt E., Kullnig C.M., Kubicek C.P., Samuels G.J and Borner T., 2000b Trichoderma aureoviride: phylogenetic position and characterization Mycological Research 105: 312 – 322 39 Lieckfeldt E., Samuels G J., Nirenberg H I and Petrini O, 1999 A Morphological and Molecular Perspective of Trichoderma viride: Is It One or Two Species? Applied and Environmental Microbiology 65: 2418 – 2428 40 Munoz F.M., Demmler G.J., Travis W.R., Ogden A.K., Rossmann S.N and Rinaldi M.G., 1997 Trichoderma longibrachiatum Infection in a Pediatric Patient with Aplastic Anemia Journal Of Clinical Microbiology 35: 499 – 503 41 Muthumeenakshi S., Mills P.R., Brown A.E and Seaby D.A., 1994 Intraspecific molecular variation among Trichoderma harzianum isolates colonizing mushroom compost in the British Isles Microbiology 140: 769 – 777 42 Overton B.E., Stewart E.L and Geiser D.M., 2006 Taxonnomy and phylogenetic relationships of nine species of Hypocrea with anamorph assignable to Trichoderma section Hypocreanum Study in Mycology 56: 39 – 65 43 Samuels G.J., 2004 Trichoderma: A guide to identification and biology United States Dept of Agriculture – Agricultural Research Service Systemtic Botany and Mycology Lab 11 44 Samuels G.J., 2005 Trichoderma: systematictv, the sexual state and ecology Phytopathology 96: 195 – 206 45 Samuels G.J and Ismaiel A., 2009 Trichoderma evansii and T lieckfeldtiae: two new T hamatum – like species Mycologia 101: 142 – 156 46 Seidl V., Huemer B., Seiboth B and Kubicek C.P., 2005 A complete survey of Trichoderma chitinases reveals three distinct subgroups of family 18 chitinases FEB Journal 272: 5923 – 5939 47 Siddiquee S., Guan F.A.T.S and Aziz E.R., 2007 Phylogenetic Relationships of T harzianum Based on the Sequence Analysis of the Internal Transcribed Spacer Region – of the rDNA Journal of Applied Science Research 3: 896 – 903 48 Szczech M., Staniaszek M., Habdas H., Uliński Z and Szymanski J., 2008 Trichoderma spp – The Cause of Green Mold on Polish Mushroom Farms Vegetable Crops Research Bulletin 69: 105 – 114 49 Tang P., Mohan S., Sigler L., Witterick L., Summerbell R., Campbell L and Mazzulli T., 2003 Allergic Fungal Sinusitis Associated with Trichoderma longibrachiatum J Clin Microbiol 41: 5333 –5336 50 Vilgalys lab, Duke University Conserved primer sequences for PCR amplification and sequencing from nuclear ribosomal RNA 51 Viterbo B., Montero M., Ramot O., Friesem D., Monte E., Llobell A and Chet I., 2002 Expression regulation of the endochitinase chit36 from T asperellum (T harzianum T – 203) Current Genetic 42: 114 – 122 52 White T.J., Bruns T., Lee S and Tailor J., 1989 Amplication and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for Phylogenetics Genetics and Evolution (part three) pp 315 – 320 53 Wuczkowski M., Druzhinina I., Gherbawy Y., Klug B., Prillinger H.J and Kubicek C.P., 2003 Species pattern and genetic diversity of Trichoderma in a mid – European, primeval floodplain – forest Microbiological Research 158: 125 – 133 12 54 Yamamoto, Naruse H., A., Ohsak T., and Sekiguchi J., 1995 Nucleotide sequence and characterization of the large mitochondrial rRNA gene of Penicillium urticae, and its comparison with those of other filamentous fungi J Biochem 117: 888 – 896 55 Yaqub F and Shahzad S., 2005 In vitro evaluation of microbial antagonists against Sclerotium rolfsii Pak J Bot 37: 1033 – 1036 56 Zhang C., Druzhinina I.S., Kubicek C.P and Xu T., 2005 Trichoderma biodiversity in China: evidence for a North to South distribution of species in East Asia FEMS Microbiology Letter 251: 251 – 257 Từ Internet 57 http://en.wikipedia.org/wiki 58 http://en.wikipedia.org/wiki/Image:Eucaryot_rdna.png 59 http://nt.ars-grin.gov/taxadescriptions/keys/TrichodermaIndex.cfm 60 http://www.doctorfungus.org/thefungi/Trichoderma.html 61 http://www.isth.info 62 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ 63 http://www-igbmc.u-strasbg.fr/BioInfo/ClustalX/ (ClustalX) 64 http://evolution.genetics.washington.edu/phylip.html (PHYLIP) 65 http://taxonomy.zoology.gla.ac.uk/rod/treeview.html (TREEVIEW) 13 ... vùng địa lý khác phân tích dựa vào khác biệt trình tự DNA vùng ITS ech42 1.2 Mục tiêu nghiên cứu Phân tích đa dạng di truyền nấm vùng khác Việt Nam dựa vào trình tự vùng ITS ech42 hình thái học. .. bất lợi Trichoderma đến sức khỏe cộng đồng Trên sở đó, đề tài: Định danh lồi phân tích đa dạng di truyền nấm Trichoderma spp dựa vào trình tự vùng ITS ech42 thực Sự đa dạng di truyền Trichoderma. .. định danh lồi sinh vật Do đó, việc định danh tới loài nấm đồng thời phân tích đa dạng di truyền, đa dạng lồi đa dạng sinh học nấm tự nhiên phân tích dựa vùng gen đặc trưng loài Với nấm Trichoderma,