KHẢO SÁT BIỂU HIỆN LÂM SÀNG VÀ BỆNH TÍCH TRÊN HEO GIẾT MỔ DƯƠNG TÍNH DỊCH TẢ HEO, XÁC ĐỊNH NHÓM DI TRUYỀN CỦA VIRÚT DỊCH TẢ HEO TẠI TIỀN GIANG LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP

KHẢO SÁT BIỂU HIỆN LÂM SÀNG VÀ BỆNH TÍCH TRÊN HEO GIẾT MỔ DƯƠNG TÍNH DỊCH TẢ HEO, XÁC ĐỊNH NHÓM DI TRUYỀN CỦA VIRÚT DỊCH TẢ HEO TẠI TIỀN GIANG LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH HỒ HUỲNH MAI KHẢO SÁT BIỂU HIỆN LÂM SÀNG VÀ BỆNH TÍCH TRÊN HEO GIẾT MỔ DƯƠNG TÍNH DỊCH TẢ HEO, XÁC ĐỊNH NHÓM DI TRUYỀN CỦA VIRÚT DỊCH TẢ HEO TẠI TIỀN GIANG LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 102009 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH HỒ HUỲNH MAI KHẢO SÁT BIỂU HIỆN LÂM SÀNG VÀ BỆNH TÍCH TRÊN HEO GIẾT MỔ DƯƠNG TÍNH DỊCH TẢ HEO, XÁC ĐỊNH NHÓM DI TRUYỀN CỦA VIRÚT DỊCH TẢ HEO TẠI TIỀN GIANG Chuyên ngành: Thú y Mã số: 60.62.50 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP Hướng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. TRẦN THỊ DÂN 2. TS. HỒ THỊ KIM HOA Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 102009 i KHẢO SÁT BIỂU HIỆN LÂM SÀNG VÀ BỆNH TÍCH TRÊN HEO GIẾT MỔ DƯƠNG TÍNH DỊCH TẢ HEO, XÁC ĐỊNH NHÓM DI TRUYỀN CỦA VIRÚT DỊCH TẢ HEO TẠI TIỀN GIANG HỒ HUỲNH MAI Hội đồng chấm luận văn: 1. Chủ tịch: 2. Thư ký: 3. Phản biện 1: 4. Phản biện 2: 5. Ủy viên: ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH HIỆU TRƯỞNG ii LÝ LỊCH CÁ NHÂN Tôi tên: Hồ Huỳnh Mai, sinh ngày 15 tháng 12 năm 1974, tại huyện Cai Lậy, tỉnh Tiền Giang. Con của Ông Hồ Văn Dư và Bà Phạm Thị Loan. Tốt nghiệp Trung học phổ thông tại Trường Trung học phổ thông Mỹ Phước Tây, huyện Cai Lậy, tỉnh Tiền Giang, năm 1992. Tốt nghiệp Đại học ngành Thú y hệ tại chức tại Đại học Nông lâm, Thủ Đức, thành phố Hồ Chí Minh. Sau đó làm việc tại Chi cục Thú y tỉnh Tiền Giang. Tháng 92005 theo học Cao học ngành Thú y tại Đại học Nông Lâm, Thủ Đức, thành phố Hồ Chí Minh. Tình trạng gia đình: độc thân. Điạ chỉ liên lạc: 133 Lý Thường Kiệt, phường 5, TP. Mỹ Tho, Tiền Giang. Điện thoại: 0919213371 Email: hhmai2005gmail.com iii LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác; đồng thời trong luận văn có sử dụng một phần kết quả của đề tài nghiên cứu khoa học và công nghệ cấp Bộ (đã được Chủ nhiệm đề tài cho phép sử dụng kết quả này trong luận văn). Người cam đoan Hồ Huỳnh Mai iv LỜI CẢM TẠ Chân thành cám ơn PGS.TS TRẦN THỊ DÂN TS. HỒ THỊ KIM HOA Đã giảng dạy, hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong việc thực hiện và hoàn thành luận văn tốt nghiệp. Cảm ơn tất cả quý thầy cô Khoa Chăn nuôi Thú y, Phòng Đào tạo Sau Đại học, Ban Giám hiệu Trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi học tập và hoàn thành đề tài nghiên cứu. Chân thành cảm ơn Ban Lãnh đạo Chi cục Thú y tỉnh Tiền Giang, các bạn đồng nghiệp đã nhiệt tình hỗ trợ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành khóa học và đề tài nghiên cứu này. v TÓM TẮT Đề tài “Khảo sát biểu hiện lâm sàng và bệnh tích trên heo giết mổ dương tính dịch tả heo, xác định nhóm di truyền của virút dịch tả heo tại Tiền Giang” được thực hiện từ tháng 032007 đến tháng 022008. Khảo sát trên 3.438 heo đưa vào các lò mổ của huyện Chợ Gạo và thành phố Mỹ Tho, tỉnh Tiền Giang với phương pháp chẩn đoán lâm sàng, tổ chức lấy mẫu, xét nghiệm để chẩn đoán vi thể và cận lâm sàng bằng các kỹ thuật của phòng thí nghiệm (ELISA, cắt mẫu vi thể, RTPCR) chúng tôi có kết quả như sau: 1. Trên lâm sàng, tần suất da xuất huyết chiếm tỷ lệ cao (63,75%) ở heo nghi bệnh dịch tả. 2. Xét nghiệm mẫu lách của heo có biểu hiện nghi bệnh dịch tả bằng kỹ thuật ELISA, tỷ lệ dương tính với kháng nguyên E2 của virút DTH chiếm 29,17%. 3. Biểu hiện đặc trưng ở heo dương tính với kháng nguyên E2 của virút DTH bao gồm: da xuất huyết điểm (64,29%), viêm kết mạc mắt (52,86%); van hồi manh tràng loét hình cúc áo (77,14%), hạch màng treo ruột xuất huyết (61,43%), thận xuất huyết (60%), lách nhồi huyết (42,86%). Các bệnh tích vi thể hiện diện với tần suất cao là hạch màng treo ruột xuất huyết rìa (77,5%), thận xuất huyết vùng tuỷ (77,5%), xuất huyết tiểu thể Malpighi (75%), hư hại vỏ bao thận (72,5%) và lách hư hại mô bạch huyết (67,5%) cùng với nhồi huyết và xuất huyết (62,5%). 4. Các chủng virút DTH thực địa ở Tiền Giang thuộc nhóm 2 với phân nhóm 2.1 và 2.2, có mối quan hệ gần với các chủng virút DTH đang lưu hành ở Việt Nam (mức độ tương đồng từ 92,62% đến 99,47%). Trong khi đó, chủng virút DTH trong vắcxin (GenBank) lại thuộc nhóm 1 với phân nhóm 1.1. vi SUMMARY Title: “Surveying clinical signs and lesions in slaughtered pigs positive to Classical Swine Fever virus (CSFV), and defining genetic groups of CSF virus in Tien Giang province” The aim of this study was to observe the clinical signs and lesions in pigs at some slaughterhouses in Tien Giang province, which were positive to ELISA test for the classical swine fever virus. In addition, phylogenetic analysis of the E2gene fragment isolated from the samples by RTPCR was conducted. The observation was carried out in 3,438 pigs slaughtered at four slaughterhouses in Tien Giang province since March 2007 to February 2008. The results of clinical diagnosis and laboratory examination (ELISA, microscopic section, RTPCR) were summarized as followed. 1. Pigs of suspectedCSF signs showed skin haemorrhage at high rate (63.75%). 2. Only 29.17% pigs of suspectedCSF were positive to E2 antigen of CSF virus by ELISA. 3. The typical lesions of the positive pigs included skin haemorrhage (64.29%), conjunctivitis (52.86%), ulcers in the large intestine (77.14%), haemorrhage in the mesentery lymph nodes (61.43%), haemorrhage in kidneys (60%), infarcts in the spleen (42.86%), haemorrhage in the kidney inner (77.5%), haemorrhage in Malpighi (75%), degeneration of kidney envelope (72.5%), and damage of lymph tissue of spleen (67.5%). 4. All CSF virus strains detected in Tien Giang in this study belonged to genogroup 2 (subgroup 2.1 and 2.2), which had close relation to the strains detected in other provinces in Viet Nam (homology levels of 92.62% to 99.47%), and were distantly clustered from the vaccine strains (which belong to subgroup 1.1). vii MỤC LỤC Trang tựa Trang chuẩn y ........................................................................................................... i Lý lịch cá nhân ........................................................................................................ ii Lời cam đoan ........................................................................................................... iii Cảm tạ ..................................................................................................................... iv Tóm tắt .................................................................................................................... v Summary .................................................................................................................. vi Mục lục .................................................................................................................... vii Danh sách các chữ viết tắt ....................................................................................... x Danh sách các hình và sơ đồ .................................................................................... xi Danh sách các bảng ................................................................................................. xii Chương 1. MỞ ĐẦU ............................................................................................. 1 1.1 Đặt vấn đề ..................................................................................................... 1 1.2. Mục tiêu ....................................................................................................... 2 1.3 Yêu cầu .......................................................................................................... 2 Chương 2. TỔNG QUAN ...................................................................................... 3 2.1 Đặc điểm sinh học của virút DTH ............................................................... 3 2.1.1 Lịch sử phát hiện ................................................................................... 3 2.1.2 Phân loại ................................................................................................ 3 2.1.3 Đặc điểm cấu tạo và phân bố nhóm virút DTH ................................... 5 2.1.3.1 Đặc điểm hình thái ......................................................................... 5 2.1.3.2 Cấu tạo và chức năng các protein của virút DTH ......................... 5 2.1.3.3 Phân bố .......................................................................................... 7 2.1.4 Độc lực của virút DTH .......................................................................... 10 2.2 Đường xâm nhập và cơ chế sinh bệnh của virút DTH trong cơ thể vật chủ 10 2.3 Dấu hiệu lâm sàng bệnh DTH ...................................................................... 11 2.3.1 Nhiễm sau khi sinh ................................................................................ 11 Trang viii 2.3.2 Nhiễm trước khi sinh và phát bệnh muộn ............................................. 12 2.4 Bệnh tích ....................................................................................................... 13 2.4.1 Bệnh tích đại thể .................................................................................... 13 2.4.2 Bệnh tích vi thể ..................................................................................... 14 2.5 Một số phương pháp chẩn đoán bệnh DTH trong phòng thí nghiệm ........... 14 2.5.1 Phân lập virút DTH trên tế bào nuôi cấy ............................................. 15 2.5.2 Kỹ thuật kháng thể huỳnh quang (FAT fluorescent antibody test) ...... 16 2.5.3 Kỹ thuật miễn dịch peroxidase (Imunoperoxidase) .............................. 16 2.5.4 Kỹ thuật ELISA (Enzyme linked imunosorbent assay) ........................ 16 2.5.4.1 Kỹ thuật ELISA phát hiện kháng nguyên ...................................... 16 2.5.4.2 Kỹ thuật ELISA phát hiện kháng thể ............................................. 17 2.5.5 Kỹ thuật trung hòa virút (Virus neutralization test) ............................. 17 2.5.6 Kỹ thuật RT PCR ................................................................................ 18 2.6 Vắcxin phòng chống bệnh DTH .................................................................. 21 Chương 3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH ............................ 22 3.1 Thời gian và địa điểm ................................................................................... 22 3.2 Nội dung và phương pháp thực hiện ............................................................. 22 3.2.1 Đối tượng khảo sát và trình tự nội dung thực hiện ................................ 22 3.2.2 Chỉ tiêu khảo sát .................................................................................... 23 3.2.3 Cách tiến hành ....................................................................................... 23 3.3 Xử lý số liệu .................................................................................................. 28 Chương 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................... 29 4.1 Biểu hiện lâm sàng trên heo nghi bệnh DTH ................................................ 29 4.2 Sự hiện diện của kháng nguyên E2 trong lách heo nghi bệnh ....................... 30 4.3 Biểu hiện lâm sàng và bệnh tích trên heo dương tính E2 ............................. 30 4.3.1 Biểu hiện lâm sàng trên heo dương tính E2 ............................................ 31 4.3.2 Bệnh tích đại thể trên heo dương tính E2 ............................................... 34 4.3.3 Các dạng bệnh tích vi thể trên heo dương tính E2 .................................. 38 4.3.3.1 Các dạng bệnh tích vi thể trên thận ................................................. 39 ix 4.3.3.2 Các dạng bệnh tích vi thể trên lách ................................................. 40 4.3.3.3 Các dạng bệnh tích vi thể trên hạch màng treo ruột ....................... 41 4.4 Định trình tự chuỗi nucleotide từ gien E2 của virút DTH .......................... 42 Chương 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................ 48 5.1 Kết luận .......................................................................................................... 48 5.2 Đề nghị........................................................................................................... 49 Tài liệu tham khảo ................................................................................................... 50 Phụ lục ..................................................................................................................... 57 x DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt BVDV Bovine viral diarrhoea virus Virút gây bệnh tiêu chảy bò BDV Border disease virus Virút gây bệnh Border ở cừu CPE Cytopathic effect Bệnh tích tế bào CSFV Classical swine fever virus Virút gây bệnh dịch tả heo cổ điển DTH Dịch tả heo ELISA Enzyme linked immunosorbent assay Kỹ thuật hấp phụ miễn dịch gắn kết với enzym FAT Flourescent antibody test Kỹ thuật kháng thể huỳnh quang kDa Kilo Dalton NCBI National Center for Biotechnology Information Trung tâm Quốc gia Thông tin Công nghệ Sinh học (Hoa Kỳ) nt Nucleotide OD Optical density Mật độ quang học ORF Open reading frame Khung đọc mở PK15 Pig kidney Tế bào thận heo RNA Ribonucleic acid Axít nhân RNA RTPCR Reverse transcriptase polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi khuếch đại gen phiên mã ngược TCID50 Tissue culture infectious doses 50 Liều gây nhiễm 50% tế bào nuôi cấy NTR Nontranslated region Vùng không mã hoá xi DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ SƠ ĐỒ Hình 2.1: Mối quan hệ di truyền giữa các loài trong giống Pestivirus dựa trên chuỗi trình tự của gien Npro....................................................................... 4 Hình 2.2: Cấu trúc bộ gien và hình thái của virút DTH ......................................... 5 Hình 2.3: Cây di truyền thể hiện mối quan hệ giữa 3 nhóm chính của virút DTH và các nhóm phụ của chúng dựa trên gien E2 ...................... 8 Hình 2.4: Cây di truyền của một số chủng virút DTH ở Việt Nam và khu vực khi phân tích đoạn gien E2 của chúng ...................................................... 9 Hình 2.5: ELISA “kẹp chả” .................................................................................... 17 Hình 2.6: Qui trình RT PCR ................................................................................. 19 Hình 4.1: Viêm kết mạc mắt (heo dương tính E2) ................................................. 32 Hình 4.2: Xuất huyết da (vùng tai) ......................................................................... 32 Hình 4.3: Lách nhồi huyết ...................................................................................... 37 Hình 4.4: Thận xuất huyết (vùng vỏ và vùng tuỷ) .................................................. 37 Hình 4.5: Hạch màng treo ruột xuất huyết ............................................................. 38 Hình 4.6: Nốt loét ở van hồi manh tràng, ruột loét hình cúc áo ............................. 38 Hình 4.7: Thận xuất huyết với nhiều hồng cầu trong tiểu thể Malpighi ................. 40 Hình 4.8: Lách nhồi huyết, hồng cầu tụ thành đám lớn dưới vỏ bao lách ............. 41 Hình 4.9: Hạch xuất huyết ở rìa, nốt bạch huyết suy giảm .................................... 42 Hình 4.10: Cây di truyền vùng biến động (190 nt) của gien E2 ............................ 45 Sơ đồ 3.1: Trình tự nội dung khảo sát và phân tích mẫu ......................................... 23 xii DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 2.1: Các kỹ thuật thường sử dụng để chẩn đoán bệnh DTH ......................... 15 Bảng 2.2: So sánh các đặc tính của các kỹ thuật chẩn đoán dùng để phát hiện virút và các thành phần của virút DTH .................................. 19 Bảng 2.3: Các loại vắcxin DTH được phép lưu hành ở Việt Nam ...................... 21 Bảng 3.1: Phân bố mẫu thu thập ............................................................................. 22 Bảng 3.2: Các chủng virút DTH tham chiếu từ Việt Nam ................................... 26 Bảng 3.3: Các chủng virút DTH tham khảo trên thế giới ....................................... 27 Bảng 4.1: Tần suất các biểu hiện lâm sàng trên heo nghi bệnh DTH ..................... 29 Bảng 4.2: Tần suất các biểu hiện lâm sàng ở heo dương tính E2 ........................... 31 Bảng 4.3: Phân bố của biểu hiện lâm sàng ghép trên heo dương tính E2 ............... 34 Bảng 4.4: Tần suất ghép 2 biểu hiện lâm sàng của heo dương tính E2 ................... 34 Bảng 4.5: Tỷ lệ của các bệnh tích đại thể ở các cơ quan nội tạng trên heo dương tính E2 ........................................................................... 35 Bảng 4.6: Tỷ lệ các dạng bệnh tích vi thể trên thận ................................................ 39 Bảng 4.7: Tỷ lệ các dạng bệnh tích vi thể trên lách ................................................ 41 Bảng 4.8: Tỷ lệ các dạng bệnh tích vi thể trên hạch màng treo ruột ...................... 42 Bảng 4.9: Các chủng virút trong bệnh phẩm được giải trình tự vùng gien E2....... 42 1 Chương 1 MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Hơn 100 năm được biết đến, bệnh dịch tả heo (DTH) đã gây tổn thất nặng nề cho ngành chăn nuôi của nhiều quốc gia trên thế giới, kể cả Việt Nam. Nếu trước những năm 60 của thế kỷ XX, bệnh DTH thường nổ ra ồ ạt, mãnh liệt thì hiện nay bệnh lại có tính chất âm ỉ, thầm lặng bởi các chủng virút độc lực thấp (Nguyễn Tiến Dũng và ctv, 2002). Đây cũng là nguyên nhân chính để giải thích sự thất bại của các chương trình kiểm soát bệnh DTH tại một số quốc gia (Terpstra, 1991). Kết quả chẩn đoán bệnh DTH của Chi cục Thú y tỉnh Tiền Giang bằng phương pháp ELISA cho thấy các mẫu bệnh phẩm từ heo có dấu hiệu đặc trưng của bệnh DTH vẫn có thể âm tính với bệnh này (Nguyễn Việt Nga và ctv, 2005). Chính vì thế, chẩn đoán dựa vào dịch tễ và lâm sàng bệnh DTH chỉ có giá trị khi kèm theo kết quả cận lâm sàng. Ngoài ra, sự phù hợp giữa kết quả cận lâm sàng và dấu hiệu lâm sàng cần được đánh giá lại sau một thời gian diễn biến thay đổi của bệnh. Bên cạnh đó, việc xác định chủng virút gây bệnh DTH có vai trò quyết định trong chương trình kiểm soát bởi lẽ chủng virút của vắcxin và chủng virút gây bệnh thực địa không phù hợp thì chiến lược tiêm phòng sẽ thất bại. Một số tác giả (Kim Văn Phúc và ctv, 2004; Hồ Thu Hương và ctv, 2004; Bùi Nghĩa Vượng và ctv, 2006; Nguyễn Thế Vinh và ctv, 2007) đã khảo sát về chủng virút DTH trên các mẫu từ Hà Tây, Nghệ An, Hưng Yên, Vĩnh Phúc, Thái Nguyên, TP. Cần Thơ, TP. Hải Phòng và TP. Hồ Chí Minh. Tuy nhiên, cho đến nay ở Tiền Giang vẫn chưa có nghiên cứu nào về vấn đề này. 2 Xuất phát từ thực tế trên, được sự đồng ý của Chi cục Thú y tỉnh Tiền Giang, dưới sự hướng dẫn của PSG.TS. Trần Thị Dân và TS. Hồ Thị Kim Hoa, chúng tôi thực hiện đề tài: “Khảo sát biểu hiện lâm sàng và bệnh tích trên heo giết mổ dương tính dịch tả heo, xác định nhóm di truyền của virút dịch tả heo tại Tiền Giang”. 1.2. Mục tiêu Xác định tần suất của triệu chứng và bệnh tích trên heo có kết quả ELISA dương tính với virút DTH để định hướng cho việc chẩn đoán lâm sàng. Xác định sự phân bố của các chủng virút DTH thực địa tại một số địa bàn tỉnh Tiền Giang. 1.3 Yêu cầu Ghi nhận triệu chứng và bệnh tích đại thể trên heo nghi ngờ bệnh DTH. Xét nghiệm kháng nguyên E2 bằng kỹ thuật ELISA từ mẫu lách của heo nghi ngờ bệnh dịch tả. Đánh giá bệnh tích vi thể trên lách, hạch màng treo ruột và thận của những heo có mẫu lách dương tính với kháng nguyên E2. Thực hiện RT PCR trên các mẫu lách dương tính với kháng nguyên E2 nhằm xác định trình tự chuỗi nucleotide của đoạn gien E2, từ đó định nhóm di truyền của virút DTH dựa trên GenBank. 3 Chương 2 TỔNG QUAN 2.1 Đặc điểm sinh học của virút DTH 2.1.1 Lịch sử phát hiện Ở Hoa kỳ, năm 1810 có một bệnh giống như bệnh DTH được mô tả tại bang Tennesee. Đến năm 1833, bệnh DTH mới được báo cáo chính thức tại bang Ohio. Năm 1885, Salmon và Smith xác định căn bệnh này là do vi trùng. Mãi đến năm 1903, Dorset và Schweinitz đã khẳng định bệnh DTH là do virút với chứng minh huyễn dịch bệnh phẩm không có vi trùng nhưng vẫn gây bệnh DTH. Từ năm 1822 – 1862, có nhiều quốc gia ở Châu Âu xuất hiện bệnh DTH như Pháp (1822), Đức (1833), Anh (1862). Ngoài ra, bệnh DTH cũng được báo cáo ở Nam Mỹ (1899) và Nam Phi (1900) (dẫn liệu van Oirschot, 1999). Năm 1921, sau khi phát hiện bệnh DTH Châu Phi do một loại virút khác gây ra, các nhà khoa học đã sử dụng thuật ngữ “dịch tả heo cổ điển” (classical swine fever CSF) cho bệnh DTH của thế kỷ XIX nhằm phân biệt với DTH Châu Phi, cho đến nay thuật ngữ này vẫn còn được sử dụng (Lê Hồng Phong, 1999). 2.1.2 Phân loại Virút DTH (Classical swine fever virus – CSFV) thuộc giống Pestivirus, họ Flaviviridae. Họ Flaviviridae có 3 giống (Flavivirus, Hepacivirus và Pestivirus). Ngoài CSFV, giống Pestivirus có 2 loài khác là virút gây bệnh tiêu chảy bò (Bovine viral diarrhoea virus, BVDV type 1 và type 2) và virút gây bệnh Border ở cừu (Border disease virus – BDV) (Wengler và ctv, 1995; Becher và ctv, 2003) (Hình 2.1). 4 Hình 2.1: Mối quan hệ di truyền giữa các loài trong giống Pestivirus dựa trên chuỗi trình tự của gien Npro (Becher và ctv, 2003) 4 5 2.1.3 Đặc điểm cấu tạo và phân bố nhóm virút DTH 2.1.3.1 Đặc điểm hình thái Virút DTH có hệ gien RNA chuỗi đơn, mạch dương, dài khoảng 12,3 kb; có vỏ bọc bên ngoài, đường kính 4050 nm, dạng hình cầu, đối xứng khối 20 mặt, có một nucleocapside đường kính 29 nm. Khối lượng phân tử khoảng 60 x 106 Da (Trần Đình Từ, 1999). 2.1.3.2 Cấu tạo và chức năng các protein của virút DTH Cấu tạo Phân tử RNA của virút DTH gồm vùng 5’ không mã hoá (5’ nontranslated region, 5’NTR), một khung đọc mở (open reading frame – ORF) và vùng 3’ không mã hóa (3’NTR). ORF mã hóa 1 polyprotein chứa khoảng 3.900 axít amin gồm 4 protein cấu trúc (C, protein của nucleocapsid; Erns (E0), E1 và E2, các glycoprotein vỏ) và 8 protein không cấu trúc (Npro, p7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B) (Dong và Chen, 2007). Hình 2.2: Cấu trúc bộ gien và hình thái của virút DTH (Beer và ctv, 2007) protein cấu trúc Kháng thể lõi protein C võ võ mặt cắt siêu mỏng nhuộm bản âm 6 Các protein của virút DTH Erns, E1, E2 (vùng A1,2,3, B, C và D) là các glycoprotein của vỏ virút, mục tiêu của kháng thể trung hòa. Erns hay E0 (trước đây được gọi là gp4448) và E2 (trước đây được gọi là gp55) phân bố ở bề mặt ngoài virion tham gia vào việc kết dính và xâm nhập vào tế bào cảm nhiễm. E0 có hoạt tính ribonuclease đối với uridine và có thể bị ức chế bởi ion kẽm (Dong và Cheng, 2007). Glycoprotein màng (transmembrane glycoprotein) E1 (gp33) tạo phức hợp với E2 (E1–E2 heterodimer) bằng cầu nối disulfide. Các nhánh kỵ nước của E1 vươn ra, đóng vai trò truyền các tín hiệu khởi đầu hay ngừng lại (stopbegintransfer signals) cho quá trình di chuyển E0, E1, E2 trong hệ thống võng nội chất (endoplasmic reticulum ER) của tế bào (Dong và Cheng, 2007). Glycoprotein E2 có thể được dùng phân biệt dịch tả heo và BVDV với BDV (van Oirschot, 1999). Npro (Nternimal protease) (còn gọi là p23) là một autoprotease duy nhất, chỉ có trong giống Pestivirus. Npro nhanh chóng tự cắt khỏi nucleocapsid protein C (p14). Protein p7 có kích thước nhỏ hiện diện ở hai dạng E2p7 và p7, được tìm thấy trong tế bào nhiễm virút, nhưng không thấy ở virion trưởng thành (Dong và Cheng, 2007). NS3 (p80) có 3 hoạt tính: serine proteinase (đầu N), RNA helicase và nucleoside triphosphatase (RNAstimulated NTPase) (đầu C) (Brown và ctv, 2002; Zhang và ctv, 2003). NS4A là một phosphoprotein, đồng yếu tố (cofactor) của serine proteinase NS3, cần cho sự phân tách NS4B5A và NS5A5B để phóng thích NS4A, NS4B, NS5A và NS5B. Cả hai, NS4B và NS5A, được cho rằng là những thành viên của nhóm replicase và protein NS5B là một RNA polymerase (RNAdependent RNA polymerase) (Dong và Cheng, 2007). Trong số các protein virút, E0 và E2 là hai kháng nguyên chủ yếu được dùng để sản xuất vắcxin (Dong và Cheng, 2007). Nghiên cứu của Konig và ctv (1995) cho thấy sau khi nhiễm virút, kháng thể kháng virút DTH được hình thành chống lại 2 protein cấu trúc Erns, E2 và protein không cấu trúc P80 (NS3). E2 có tính sinh miễn dịch cao nhất trong số các protein của CSFV. Hầu hết các kháng thể 7 trung hòa được sinh ra trong cơ thể vật chủ nhằm vào glycoprotein này. E2 còn là một yếu tố xác định độc lực (virulence determinant) của virút. Glycoprotein Erns (E0) là mục tiêu kế tiếp của các kháng thể trung hòa. Các nghiên cứu cho thấy Erns cũng góp phần xác định độc lực virút (Dong và Cheng, 2007). Uttenthal và ctv (2001) đã chứng minh, heo sau khi tiêm chủng vắcxin E2 hoặc Erns có thể được bảo hộ sau khi công cường độc virút DTH. Điều này không xảy ra ở vắcxin E1. Tác giả còn cho biết, kháng thể kháng Erns chỉ được phát hiện khi dùng kháng nguyên Erns tái tổ hợp. Do vậy, kỹ thuật ELISA được thiết kế không thể phát hiện kháng thể ở heo được tiêm chủng vắcxin Erns mà chỉ phát hiện kháng thể của heo nhiễm DTH tự nhiên hoặc heo đã chủng vắcxin thông dụng. 2.1.3.3 Phân bố Paton và ctv (2000a) đã vẽ các cây di truyền (phylogenetic tree) dựa trên phân tích các đoạn nucleotide của các gien mã hóa E2 (190 nt), NS5B (490 nt) và 5’ NTR (150 nt) từ nhiều chủng virút DTH. Kết quả cho thấy sự phân bố các chủng virút này trên cả 3 cây di truyền tương tự nhau. Cây di truyền được vẽ dựa vào phân tích đoạn nucleotide của gien mã hóa E2 (190 nt) từ 100 chủng virút DTH phân lập khắp nơi trên thế giới cho thấy các chủng virút này phân bố thành 3 nhóm chính, mỗi nhóm có 3 4 nhóm phụ (Hình 2.3). Các chủng virút phân lập từ Châu Âu vào những thập niên 19201970 thuộc nhóm 1, chủ yếu là nhóm phụ 1.1. Trong khi đó, các chủng ở Châu Âu phân lập trong những thập niên 19801990 thuộc nhóm 2. Tất cả những chủng vắcxin phân tích (Thái Lan, Hàn Quốc, Đức) đều thuốc nhóm phụ 1.1. Virút phân lập ở các quốc gia châu Á phân bố vào các nhóm khác nhau, tùy theo thời gian phân lập. Ví dụ, các chủng phân lập ở Thái Lan vào thập niên 1980 phân bố chủ yếu vào nhóm phụ 1.2, trong khi các chủng phân lập vào thập niên 1990 phân bố vào nhóm phụ 2.2 và 3.3. Tương tự, các chủng ở Maylaysia phân lập vào thập niên 1960 thuộc nhóm phụ 1.2, và phần lớn các chủng phân lập vào thập 8 niên 19801990 thuộc nhóm phụ 2.1. Nhóm 3 chủ yếu gồm các chủng virút phân lập ở Châu Á (Hàn Quốc, Thái Lan, Nhật và Đài Loan). Hình 2.3: Cây di truyền thể hiện mối quan hệ giữa 3 nhóm chính của virút DTH và các nhóm phụ của chúng dựa trên gien E2 (Paton và ctv, 2000a) Nhóm phụ 2.2: Nhóm phụ 1.2: Chủng vắc xin Nhóm phụ 2.1: Nhóm phụ 1.3: Nhóm phụ 1.1: Chủng vắc xin Nhóm phụ 3.3: Nhóm phụ 3.4: Nhóm phụ 3.2: Nhóm phụ 3.1: Nhóm phụ 2.3: 9 Hình 2.4: Cây di truyền của một số chủng virút DTH ở Việt Nam và khu vực khi phân tích đoạn gien E2 của chúng (Nguyễn Thế Vinh và ctv, 2007) Kiểu gien 10 Kết quả phân tích của Nguyễn Thế Vinh và ctv (2007) cho thấy các chủng virút DHT phân lập ở Việt Nam, từ những heo có triệu chứng bệnh tích của bệnh thuộc nhóm phụ 2.1 và 2.2. Trong khi đó, phần lớn các chủng phân lập từ Thái Lan sử dụng trong nghiên cứu này thuộc nhóm 1 và 3. Đặc biệt, virút vắcxin chủng C và chủng GPE phân bố trong nhóm phụ 1.1. 2.1.4 Độc lực của virút DTH Nguyễn Tiến Dũng (2002) cho biết đến nay virút DTH chỉ có một loại kháng nguyên mặc dù các nhà nghiên cứu đã tìm ra sự khác biệt của một số chủng virút và phân chia chúng thành các nhóm khác nhau với độc lực khác nhau. Dựa vào độc lực của virút DTH, SzentIvanyi (1984) đã chia các chủng virút DTH thành hai nhóm. Nhóm 1 là các chủng cường độc như chủng Alfort, chủng Rovac, chủng ALD, chủng C. Nhóm 2 là các chủng độc lực thấp, chủ yếu gây rối loạn sinh sản như chủng 331 và nhiều chủng khác phân lập được từ những heo bị bệnh mãn tính. Sự khác nhau về độc lực của hai nhóm là yếu tố chính gây ra những dấu hiệu lâm sàng khác nhau trên các ca bệnh (Cheville và Mengeling, 1989; dẫn liệu của Too và Seneque, 2002). Bằng kỹ thuật huỳnh quang trực tiếp với một cặp kháng thể đơn dòng, có thể phân biệt được kháng nguyên virút DTH tự nhiên và virút DTH trong vắcxin ở heo sau 2 tuần tiêm phòng vắcxin DTH chủng C nhược độc (van Oirschot, 1999). Tốc độ lây lan của bệnh DTH sẽ thay đổi theo độc lực của virút. Tuy nhiên, vấn đề này còn chịu ảnh hưởng bởi các yếu tố như giống, tuổi, sự cạnh tranh miễn dịch và điều kiện dinh dưỡng (van Oirschot, 1999). 2.2 Đường xâm nhập và cơ chế sinh bệnh của virút DTH trong cơ thể vật chủ Virút DTH vào cơ thể chủ yếu qua đường tiêu hóa. Ngoài ra, virút còn có thể xâm nhập qua đường hô hấp, niêm mạc mắt, đường sinh dục. Các vết thương ở da cũng là đường xâm nhập của virút. Hạch amiđan là một trong những vị trí đầu tiên nơi virút nhân lên sau khi xâm nhập vào vật chủ. Trong điều kiện tự nhiên, 7 giờ sau khi xâm nhập vào cơ thể heo, virút vào hạch amiđan, hạch vùng hầu họng (đây là vị trí nhân lên đầu tiên). Mười sáu giờ 11 sau, virút vào hệ thống lâm ba rồi vào máu (trong các đại thực bào) gây ra hiện tượng máu nhiễm virút lần thứ nhất (dẫn liệu Trần Đình Từ, 1999). Theo hệ tuần hoàn, virút đến định vị, sinh sản và phá hủy những tế bào nội mạc mao mạch, những mảnh vỡ sẽ tụ lại thành vật tắc mạch, dẫn đến nhồi huyết ở lách, xuất huyết và hoại tử ở ruột. Năm đến sáu ngày sau khi nhiễm, máu nhiễm virút lần thứ hai xảy ra, lúc này xuất hiện những triệu chứng, số lượng virút trong máu sẽ đạt tối đa vào ngày thứ 7. Đa số heo bệnh cấp tính thường bị chết do rối loạn tuần hoàn nghiêm trọng. Sự suy giảm miễn dịch đã tạo điều kiện thuận lợi cho sự phụ nhiễm vi sinh vật khác (Trần Thanh Phong, 1996). Như vậy, virút DTH có độc lực sẽ có mặt ở khắp các tổ chức, biểu mô sau khi xâm nhập vào cơ thể vật chủ 5 6 ngày (van Oirschot, 1999). Ngoài ra, virút còn có thể tồn tại trong bạch cầu và đại thực bào gây ra sự lưu nhiễm dai dẳng. Trường hợp nhiễm trùng qua phôi thai trong tử cung, có thể không dẫn đến chết phôi nhưng dẫn đến hiện tượng dung nạp miễn dịch (Trần Thanh Phong, 1996). Một số chủng virút có độc lực yếu không gây bệnh lâm sàng cho heo trưởng thành mà chỉ gây bệnh cho bào thai heo, gây ra rối loạn sinh sản như hấp thụ phôi (phải phối lại), chết thai (thai gỗ, thai chết lưu), hoặc chết yểu, dạng này còn được gọi là DTH bẩm sinh (congential CSF) hay DTH phát muộn (late onset CSF) (Nguyễn Tiến Dũng, 2002). 2.3 Dấu hiệu lâm sàng bệnh DTH Tùy thuộc vào độc lực của virút và phản ứng của cơ thể heo mà bệnh DTH có các thể bệnh khác nhau. 2.3.1 Nhiễm sau khi sinh (1) Thể quá cấp Xuất hiện đột ngột không có triệu chứng ban đầu, heo đột nhiên sốt cao 41 42oC, phần da mỏng ửng đỏ, chết nhanh trong 24 đến 48 giờ (Trần Thanh Phong, 1996). 12 (2) Thể cấp tính Thường bắt đầu với vài heo có biểu hiện lờ đờ và kém ăn. Heo sốt 4142oC, táo bón, bỏ ăn, mệt mỏi, ủ rũ, ít vận động, nằm chồng chất lên nhau, số lượng bạch cầu giảm mạnh ( 72 giờ 8 giờ Giá thành Thấp Thấp Cao Trung bình Bước 1: biến tính Bước 2: bắt cặp Bước 3: kéo dài 20 Một số phương pháp chẩn đoán phân biệt giữa các loài thuộc giống Pestivirus Phản ứng trung hòa có thể dùng để phân biệt virút DTH và BVDV nhưng không thể phân biệt BVDV và BDV. Khi nuôi cấy tế bào, virút DTH không gây bệnh tích tế bào (CPE); trong khi đó, BDV có 1 nhóm gây CPE và nhóm còn lại không gây CPE. BDV thuộc nhóm CPE có cả protein P80 và P125, còn virút không gây CPE chỉ có P125 (Thiel và ctv, 1991). Để phân biệt trường hợp nhiễm virút DTH và BVDV trong máu, có thể dùng kỹ thuật ELISA cạnh tranh với kháng thể đơn dòng (Moennig, 1990). Chẩn đoán phát hiện bệnh do virút DTH ở Việt Nam Bùi Quang Anh và ctv (2000) thăm dò phát hiện kháng nguyên virút DTH trong đàn heo giết mổ và chăn nuôi tại một số tỉnh vùng Bắc Trung Bộ bằng phương pháp miễn dịch huỳnh quang (IF), phản ứng ELISA và phản ứng trung hòa trên thỏ. Kết quả dương tính đối với IF là 35% và ELISA là 33,5%, trung hòa trên thỏ 28%. Trần Thị Dân và ctv (2003) sử dụng xét nghiệm ELISA và ghi nhận heo âm tính P125 có dấu hiệu lâm sàng và bệnh tích gần giống heo dương tính P125. Lê Văn Hùng và ctv (2003) ứng dụng RTPCR để chẩn đoán DTH tại năm tỉnh thành phố ở phía Nam; kết quả cho thấy, nếu lấy mẫu trên những heo còn sống nghi DTH thì khi xét nghiệm chỉ có 361 mẫu dương tính chiếm 4,9%, trong khi mẫu được lấy từ những heo chết nghi DTH thì dương tính khá cao (57 mẫu dương tính chiếm 71,4%). Từ năm 20022003, Kamakawa và ctv đã tiến hành khảo sát bệnh DTH ở các đàn heo và các trại heo tại Cần Thơ bằng kỹ thuật RTPCR khuếch đại đoạn gien 5’NTR. Kết quả cho thấy bệnh DTH hiện diện ở tất cả các trại khảo sát. Phạm Hồng Sơn (2004) sử dụng phản ứng ngăn trở hồng cầu gián tiếp trong việc phát hiện kháng nguyên dịch tả heo. Hồ Thu Hương và ctv (2004) so sánh 4 phương pháp chẩn đoán virút DTH (phân lập virút, phản ứng huỳnh quang kháng thể, phản ứng ELISA và RTPCR) từ mẫu được bảo quản ở các điều kiện khác nhau. Theo các tác giả, việc lựa chọn phương pháp chẩn đoán phải dựa vào chất lượng mẫu. Bùi Nghĩa Vượng và ctv 21 (2006) chẩn đoán bệnh DTH bằng phương pháp RTPCR với mẫu máu lấy bằng giấy thấm, tác giả chứng tỏ rằng có thể phát hiện được virút DTH từ các mẫu giấy thấm máu khô giữ ở 370C trong 10 tháng. Nguyễn Thế Vinh và ctv (2007) nghiên cứu phân tích di truyền virút DTH phân lập ở Việt Nam bằng cách phân tích đoạn gien E2 của 20 mẫu virút DTH và so sánh chúng với một số chủng đã được giới thiệu trên thế giới. Kết quả đưa ra là các chủng virút DTH thuộc nhóm 2 đang là tác nhân chính gây bệnh DTH ở Việt Nam. 2.6 Vắcxin phòng chống bệnh DTH Thông tin được ghi nhận từ thú y cơ sở cập nhật trong thời gian gần đây (2006 – 2007) cho thấy ở Tiền Giang vắcxin DTH được sử dụng phổ biến là vắcxin chủng C của Công ty Navetco (72,5%), kế đến là vắcxin của Công ty Merial, Pháp (17,5%), Công ty Fort Dodge Animal Health của Brazil (7,5%). Các loại vắcxin khác chỉ chiếm tỷ lệ 2,5%. Theo khảo sát của Tổ chức Dịch tễ thế giới (OIE, 2003), virút DTH chủng C được sử dụng làm vắcxin nhiều nhất. Chủng này không phát hiện trong cơ thể heo sau khi tiêm vắcxin 2 – 3 tuần. Bảng 2.3: Các loại vắcxin DTH được phép lưu hành ở Việt Nam STT Tên vắcxin Chủng virút Nhà sản xuất 1 Dịch tả lợn C Xí nghiệp thuốc thú y Trung ương 2 Dịch tả lợn C Phân viện Thú y miền Trung 3 Dịch tả heo C Công ty thuốc thú y Trung ương II 4 Porcillis Pesti C Công ty Intervet Hà Lan 5 Porcillis CSF live GPE Công ty Intervet Ấn Độ 6 HC Vac (Hog cholera vaccin) C Công ty Korea Microbiological Lab. Hàn Quốc 7 Pest – Vac C Công ty Fort Dodge Animal Health – Brazil 8 Cholera Vac® C Công ty Pfizer – Croatia 9 Live Hog Cholera Vaccine C Công ty Katasato Institute Nhật 10 Pestiffa C Công ty Merial – Pháp 11 Coglapest Thiverval Công ty Cevasante Animale – Pháp 12 Suigen Swine Fever C Công ty Virbac – Pháp 13 BSLHC GPE Công ty Bestar Laboratories – Singapore (Theo Quyết định số 042006QĐBNN ngày 12012006 của Bộ Nông nghiệpPTNT) 22 Chương 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 3.1 Thời gian và địa điểm Thời gian khảo sát từ tháng 32007 đến 22008. Khảo sát được thực hiện tại 4 cơ sở giết mổ heo (lò mổ) thuộc địa bàn thành phố Mỹ Tho và huyện Chợ Gạo, tỉnh Tiền Giang. Việc phân tích mẫu được thực hiện tại Phòng Xét nghiệm của Chi cục Thú y tỉnh Tiền Giang, Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường và Bệnh xá Thú y, Trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. Các mẫu cần được giải trình tự nucleotide được gửi đến Công ty Nam Khoa, TP. Hồ Chí Minh. 3.2 Nội dung và phương pháp thực hiện 3.2.1 Đối tượng khảo sát và trình tự nội dung thực hiện Tất cả những heo được đưa đến lò mổ để hạ thịt, tập trung khảo sát heo có một trong các biểu hiện lâm sàng nghi ngờ bệnh dịch tả. Heo nghi ngờ bệnh DTH (heo bệnh) có một trong các biểu hiện lâm sàng: da xuất huyết, viêm kết mạc mắt, gầy ốm, đi đứng xiêu vẹo. Một số heo nghi ngờ bệnh tại các lò mổ được lấy mẫu (lách, hạch màng treo ruột và thận). Phân bố mẫu thu thập được trình bày ở Bảng 3.1. Bảng 3.1: Phân bố mẫu thu thập Địa điểm Lò mổ gia súc Số bộ mẫu Thành phố Mỹ Tho Xã Tân Mỹ Chánh 60 Phường 10 60 Huyện Chợ Gạo Thị trấn Chợ Gạo 60 Xã Long Bình Điền 60 Tổng số bộ mẫu 240 23 Sơ đồ 3.1: Trình tự nội dung khảo sát và phân tích mẫu Ghi chú: (): chỉ xét nghiệm vi thể các mẫu hạch ruột, thận khi mẫu lách dương tính với ELISA. 3.2.2 Chỉ tiêu khảo sát Các chỉ tiêu khảo sát gồm có: (1) tần suất heo dương tính với kháng nguyên E2 của virút DTH (gọi tắt là dương tính E2) bằng kỹ thuật ELISA (2) tần suất heo dương tính E2 phân tích theo triệu chứng và bệnh tích (đại thể và vi thể) (3) sự thay đổi trình tự nucleotide của sản phẩm RTPCR thuộc gien E2 (190 nt) 3.2.3 Cách tiến hành 3.2.3.1 Ghi nhận triệu chứng và bệnh tích đại thể trên heo nghi ngờ bệnh DTH Thu thập thông tin Khảo sát thực hiện tập trung ở heo có trọng lượng bình quân từ 10 – 50kg. Heo có biểu hiện nghi ngờ bệnh DTH (heo bệnh) Mẫu lách Mẫu dương tính RT PCR Vi thể Định trình tự chuỗi gien E2 Đối chiếu Phát hiện E2 bằng kỹ thuật ELISA Mẫu hạch ruột, thận () 24 Heo bệnh được quan sát kỹ lưỡng và ghi nhận vào phiếu điều tra (phụ lục kèm theo) tất cả các biểu hiện lâm sàng trước khi giết mổ. Bệnh tích trên các cơ quan: thanh quản, phổi, gan, lách, thận, hạch màng treo ruột, túi mật, bàng quang, van hồi manh tràng được ghi nhận. Cách lấy mẫu và bảo quản mẫu Mỗi heo bệnh được lấy một bộ mẫu (lách, hạch màng treo ruột và thận) tại vùng có bệnh tích sau khi giết mổ. Mỗi loại lấy khoảng 5gram cho vào túi nylon vô trùng. Bảo quản trong thùng bảo ôn có đá vận chuyển về phòng thí nghiệm. Mẫu lách được chia ra làm 2 phần, một phần mẫu lách bảo quản ở 20oC, một phần mẫu lách cùng với mẫu thận, hạch màng treo ruột được cố định trong dung dịch formol 10%. 3.2.3.2 Xét nghiệm kháng nguyên E2 bằng kỹ thuật ELISA từ mẫu lách của heo nghi ngờ bệnh dịch tả Mẫu lách heo nghi bệnh được xét nghiệm bằng kỹ thuật ELISA để phát hiện heo dương tính với kháng nguyên E2 tại Phòng Xét nghiệm Chi cục Thú y Tiền Giang. Các mẫu có kết quả dương tính được gọi là “heo dương tính E2” trong luận văn. Bộ kit CSFV Antigen Test của hãng IDEXX theo phương pháp ELISA được dùng để phát hiện kháng nguyên E2 của virút DTH. Đây là phản ứng ELISA kẹp chả, phát hiện nhanh và đặc hiệu tình trạng nhiễm DTH bởi kháng thể đơn dòng kháng lại những epitope của E2. Xử lý mẫu: Một phần mẫu lách được cắt ra từng mãnh nhỏ, nghiền nhuyễn, cho dung dịch PBS vào để thu huyền dịch tế bào (tỷ lệ mẫu so với dịch PBS là 20%), ly tâm 5.000 vòng10 phút, thu dịch tế bào, bỏ cặn. Phản ứng ELISA được thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Đọc kết quả bằng máy ELISA với chương trình Xchek. Điều kiện để kết quả được chấp nhận: 25 ODPC (giá trị OD đối chứng dương) > 0,3 ODNC (giá trị OD đối chứng âm) < 70% ODPC Cách đọc kết quả: ODthực = ODmẫu (hoặc ODđối chứng dương) ODđối chứng âm Nếu ODthực ≥ 0,3 → mẫu dương Nếu ODthực < 0,2 → mẫu âm Nếu 0,2 < ODthực ≤ 0,3 → mẫu nghi ngờ 3.2.3.3 Đánh giá bệnh tích vi thể trên lách, hạch màng treo ruột và thận của những heo có mẫu lách dương tính với E2 Thận, lách, hạch màng treo ruột từ heo dương tính kháng nguyên E2 của virút DTH được gửi làm tiêu bản để đánh giá bệnh tích vi thể (40 mẫu cho mỗi loại cơ quan; Bệnh xá Thú y, Trường Đại học Nông lâm TP. Hồ Chí Minh). Quan sát mẫu tiêu bản dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 100 và 400 lần. 3.2.3.4 Thực hiện RT PCR trên các mẫu lách dương tính với E2 nhằm xác định trình tự chuỗi nucleotide của đoạn gien E2 để định chủng virút DTH Lách từ heo dương tính với kháng nguyên E2 bằng kỹ thuật ELISA được ly trích RNA và thực hiện phản ứng RTPCR khuếch đại gien E2 tại Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nông lâm TP. Hồ Chí Minh. Việc thực hiện phản ứng RTPCR khuếch đại gien E2 nhằm sử dụng sản phẩm PCR để giải trình tự nucleotide của đoạn được nhân lên. Quy trình RTPCR khuếch đại 671 nucleotide của gien E2 dựa theo tài liệu của Paton và ctv (2000) được điều chỉnh cho phù hợp với các hóa chất sẵn có ở Việt Nam. Trình tự cặp mồi phản ứng (Paton và ctv, 2000): Mồi xuôi: 5′ AGR CCA GAC TGG TGG CCN TAY GA3′ Mồi ngược: 5′TTY ACC ACT TCT GTT CTC A 3′ 26 Chu trình nhiệt: Giai đoạn 1: 50oC trong 30 phút Giai đoạn 2: 94oC trong 3 phút Giai đoạn 3: Bước 1: 94oC trong 1 phút Bước 2: 54oC trong 1 phút Bước 3: 72oC trong 1 phút Giai đoạn 4: 72oC trong 10 phút. Sản phẩm RTPCR đoạn gien E2 có 671 bp. Giải trình tự nucleotide và vẽ cây di truyền (phylogenetic tree) Các sản phẩm PCR dương tính được tinh sạch và gửi giải trình tự nucleotide (11 mẫu) tại Công ty Nam Khoa TP. Hồ Chí Minh. Mối liên quan kiểu gien của các chuỗi nucleotide này cùng một số chuỗi nucleotide tham khảo từ các nghiên cứu trên thế giới cũng như từ các nghiên cứu khác ở Việt Nam được phân tích và biểu diễn qua cây di truyền (phylogenetic tree) (Bảng 3.2 và 3.3). Bảng 3.2: Các chủng virút DTH tham chiếu từ Việt Nam Chủng virút Vùng Năm phân lập Phân nhóm Vùng gien được giải trình tự nucleotide DNVN Đồng Nai 2004 2.1 E2 QNVN Quảng Ngãi 2004 2.2 E2 (Phạm Phong Vũ – Cơ quan Thú y Vùng VI) 35 chu kỳ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH HỒ HUỲNH MAI KHẢO SÁT BIỂU HIỆN LÂM SÀNG VÀ BỆNH TÍCH TRÊN HEO GIẾT MỔ DƯƠNG TÍNH DỊCH TẢ HEO, XÁC ĐỊNH NHĨM DI TRUYỀN CỦA VI-RÚT DỊCH TẢ HEO TẠI TIỀN GIANG LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NƠNG NGHIỆP Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 10/2009 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NƠNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH HỒ HUỲNH MAI KHẢO SÁT BIỂU HIỆN LÂM SÀNG VÀ BỆNH TÍCH TRÊN HEO GIẾT MỔ DƯƠNG TÍNH DỊCH TẢ HEO, XÁC ĐỊNH NHÓM DI TRUYỀN CỦA VI-RÚT DỊCH TẢ HEO TẠI TIỀN GIANG Chuyên ngành: Thú y Mã số: 60.62.50 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP Hướng dẫn khoa học: PGS.TS TRẦN THỊ DÂN TS HỒ THỊ KIM HOA Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 10/2009 KHẢO SÁT BIỂU HIỆN LÂM SÀNG VÀ BỆNH TÍCH TRÊN HEO GIẾT MỔ DƯƠNG TÍNH DỊCH TẢ HEO, XÁC ĐỊNH NHĨM DI TRUYỀN CỦA VI-RÚT DỊCH TẢ HEO TẠI TIỀN GIANG HỒ HUỲNH MAI Hội đồng chấm luận văn: Chủ tịch: Thư ký: Phản biện 1: Phản biện 2: Ủy viên: ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH HIỆU TRƯỞNG i LÝ LỊCH CÁ NHÂN Tơi tên: Hồ Huỳnh Mai, sinh ngày 15 tháng 12 năm 1974, huyện Cai Lậy, tỉnh Tiền Giang Con Ông Hồ Văn Dư Bà Phạm Thị Loan Tốt nghiệp Trung học phổ thông Trường Trung học phổ thông Mỹ Phước Tây, huyện Cai Lậy, tỉnh Tiền Giang, năm 1992 Tốt nghiệp Đại học ngành Thú y hệ chức Đại học Nông lâm, Thủ Đức, thành phố Hồ Chí Minh Sau làm việc Chi cục Thú y tỉnh Tiền Giang Tháng 9/2005 theo học Cao học ngành Thú y Đại học Nông Lâm, Thủ Đức, thành phố Hồ Chí Minh Tình trạng gia đình: độc thân Điạ liên lạc: 133 Lý Thường Kiệt, phường 5, TP Mỹ Tho, Tiền Giang Điện thoại: 0919213371 Email: hhmai2005@gmail.com ii LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa công bố công trình khác; đồng thời luận văn có sử dụng phần kết đề tài nghiên cứu khoa học công nghệ cấp Bộ (đã Chủ nhiệm đề tài cho phép sử dụng kết luận văn) Người cam đoan Hồ Huỳnh Mai iii LỜI CẢM TẠ Chân thành cám ơn PGS.TS TRẦN THỊ DÂN TS HỒ THỊ KIM HOA Đã giảng dạy, hướng dẫn giúp đỡ việc thực hoàn thành luận văn tốt nghiệp Cảm ơn tất q thầy Khoa Chăn ni Thú y, Phòng Đào tạo Sau Đại học, Ban Giám hiệu Trường Đại học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho học tập hoàn thành đề tài nghiên cứu Chân thành cảm ơn Ban Lãnh đạo Chi cục Thú y tỉnh Tiền Giang, bạn đồng nghiệp nhiệt tình hỗ trợ tạo điều kiện thuận lợi cho tơi hồn thành khóa học đề tài nghiên cứu iv TÓM TẮT Đề tài “Khảo sát biểu lâm sàng bệnh tích heo giết mổ dương tính dịch tả heo, xác định nhóm di truyền vi-rút dịch tả heo Tiền Giang” thực từ tháng 03/2007 đến tháng 02/2008 Khảo sát 3.438 heo đưa vào lò mổ huyện Chợ Gạo thành phố Mỹ Tho, tỉnh Tiền Giang với phương pháp chẩn đoán lâm sàng, tổ chức lấy mẫu, xét nghiệm để chẩn đoán vi thể cận lâm sàng kỹ thuật phòng thí nghiệm (ELISA, cắt mẫu vi thể, RT-PCR) chúng tơi có kết sau: Trên lâm sàng, tần suất da xuất huyết chiếm tỷ lệ cao (63,75%) heo nghi bệnh dịch tả Xét nghiệm mẫu lách heo có biểu nghi bệnh dịch tả kỹ thuật ELISA, tỷ lệ dương tính với kháng nguyên E2 vi-rút DTH chiếm 29,17% Biểu đặc trưng heo dương tính với kháng nguyên E2 vi-rút DTH bao gồm: da xuất huyết điểm (64,29%), viêm kết mạc mắt (52,86%); van hồi manh tràng loét hình cúc áo (77,14%), hạch màng treo ruột xuất huyết (61,43%), thận xuất huyết (60%), lách nhồi huyết (42,86%) Các bệnh tích vi thể diện với tần suất cao hạch màng treo ruột xuất huyết rìa (77,5%), thận xuất huyết vùng tuỷ (77,5%), xuất huyết tiểu thể Malpighi (75%), hư hại vỏ bao thận (72,5%) lách hư hại mô bạch huyết (67,5%) với nhồi huyết xuất huyết (62,5%) Các chủng vi-rút DTH thực địa Tiền Giang thuộc nhóm với phân nhóm 2.1 2.2, có mối quan hệ gần với chủng vi-rút DTH lưu hành Việt Nam (mức độ tương đồng từ 92,62% đến 99,47%) Trong đó, chủng vi-rút DTH vắc-xin (GenBank) lại thuộc nhóm với phân nhóm 1.1 v SUMMARY Title: “Surveying clinical signs and lesions in slaughtered pigs positive to Classical Swine Fever virus (CSFV), and defining genetic groups of CSF virus in Tien Giang province” The aim of this study was to observe the clinical signs and lesions in pigs at some slaughterhouses in Tien Giang province, which were positive to ELISA test for the classical swine fever virus In addition, phylogenetic analysis of the E2-gene fragment isolated from the samples by RT-PCR was conducted The observation was carried out in 3,438 pigs slaughtered at four slaughterhouses in Tien Giang province since March 2007 to February 2008 The results of clinical diagnosis and laboratory examination (ELISA, microscopic section, RT-PCR) were summarized as followed Pigs of suspected-CSF signs showed skin haemorrhage at high rate (63.75%) Only 29.17% pigs of suspected-CSF were positive to E2 antigen of CSF virus by ELISA The typical lesions of the positive pigs included skin haemorrhage (64.29%), conjunctivitis (52.86%), ulcers in the large intestine (77.14%), haemorrhage in the mesentery lymph nodes (61.43%), haemorrhage in kidneys (60%), infarcts in the spleen (42.86%), haemorrhage in the kidney inner (77.5%), haemorrhage in Malpighi (75%), degeneration of kidney envelope (72.5%), and damage of lymph tissue of spleen (67.5%) All CSF virus strains detected in Tien Giang in this study belonged to genogroup (subgroup 2.1 and 2.2), which had close relation to the strains detected in other provinces in Viet Nam (homology levels of 92.62% to 99.47%), and were distantly clustered from the vaccine strains (which belong to subgroup 1.1) vi MỤC LỤC Trang Trang tựa Trang chuẩn y i Lý lịch cá nhân ii Lời cam đoan iii Cảm tạ iv Tóm tắt v Summary vi Mục lục vii Danh sách chữ viết tắt x Danh sách hình sơ đồ xi Danh sách bảng xii Chương MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu 1.3 Yêu cầu Chương TỔNG QUAN 2.1 Đặc điểm sinh học vi-rút DTH 2.1.1 Lịch sử phát 2.1.2 Phân loại 2.1.3 Đặc điểm cấu tạo phân bố nhóm vi-rút DTH 2.1.3.1 Đặc điểm hình thái 2.1.3.2 Cấu tạo chức protein vi-rút DTH 2.1.3.3 Phân bố 2.1.4 Độc lực vi-rút DTH 10 2.2 Đường xâm nhập chế sinh bệnh vi-rút DTH thể vật chủ 10 2.3 Dấu hiệu lâm sàng bệnh DTH 11 2.3.1 Nhiễm sau sinh 11 vii 2.3.2 Nhiễm trước sinh phát bệnh muộn 12 2.4 Bệnh tích 13 2.4.1 Bệnh tích đại thể 13 2.4.2 Bệnh tích vi thể 14 2.5 Một số phương pháp chẩn đốn bệnh DTH phòng thí nghiệm 14 2.5.1 Phân lập vi-rút DTH tế bào nuôi cấy 15 2.5.2 Kỹ thuật kháng thể huỳnh quang (FAT- fluorescent antibody test) 16 2.5.3 Kỹ thuật miễn dịch peroxidase (Imunoperoxidase) 16 2.5.4 Kỹ thuật ELISA (Enzyme linked imunosorbent assay) 16 2.5.4.1 Kỹ thuật ELISA phát kháng nguyên 16 2.5.4.2 Kỹ thuật ELISA phát kháng thể 17 2.5.5 Kỹ thuật trung hòa vi-rút (Virus neutralization test) 17 2.5.6 Kỹ thuật RT- PCR 18 2.6 Vắc-xin phòng chống bệnh DTH 21 Chương NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 22 3.1 Thời gian địa điểm 22 3.2 Nội dung phương pháp thực 22 3.2.1 Đối tượng khảo sát trình tự nội dung thực 22 3.2.2 Chỉ tiêu khảo sát 23 3.2.3 Cách tiến hành 23 3.3 Xử lý số liệu 28 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29 4.1 Biểu lâm sàng heo nghi bệnh DTH 29 4.2 Sự diện kháng nguyên E2 lách heo nghi bệnh 30 4.3 Biểu lâm sàng bệnh tích heo dương tính E2 30 4.3.1 Biểu lâm sàng heo dương tính E2 31 4.3.2 Bệnh tích đại thể heo dương tính E2 34 4.3.3 Các dạng bệnh tích vi thể heo dương tính E2 38 4.3.3.1 Các dạng bệnh tích vi thể thận 39 viii 11 Nguyễn Thị Phương Duyên, Đỗ Văn Khiêm, Trần Thị Hạnh Dư Đình Qn, 1999 Xác định vai trò virus dịch tả lợn hội chứng sốt, bỏ ăn, táo bón lợn số tỉnh miền trung Tạp chí KHKT Thú y, tập VI(2) Tr – 12 12 Nguyễn Thị Phương Duyên, Võ Thành Thìn Dư Đình Qn, 2000 Thăm dò phát kháng ngun kháng thể dịch tả lợn phương pháp ELISA Tạp chí KHKT Thú y, tập VII(1) Tr – 10 13 Bùi Trần Anh Đào Nguyễn Hữu Nam, 2009 Một số đặc điểm bệnh lý lợn mắc bệnh dịch tả Tạp chí Khoa học phát triển, tập VII(2) Tr 166-171 Trường ĐH Nông nghiệp Hà Nội 14 Đào Trọng Đạt Trần Thị Tố Liên, 1989 Một số nét đặc trưng dịch tễ học bệnh lý lâm sàng dịch tả lợn Việt Nam Kết nghiên cứu KHKT Thú y 1985 – 1989 Tr 14-15 15 Lê Văn Hùng, Nguyễn Ngọc Hải, Đường Chi Mai, Bùi Lưu Ly Nguyễn Tiến Dũng, 2003 Ứng dụng kỹ thuật RT-PCR chẩn đoán bệnh dịch tả heo Hội nghị toàn quốc bệnh dịch tả lợn 2003 16 Hunter A., 2001 Sổ tay dịch bệnh động vật (Phạm Gia Ninh Nguyễn Đức Tâm dịch) NXB Bản đồ 17 Hồ Thu Hương, Ken Inui, Bùi Trọng Nghĩa, Đào Thanh Vân, Nguyễn Thuý Duyên, Kenji Kawashima Nguyễn Tiến Dũng, 2004 So sánh phương pháp chuẩn đoán virut dịch tả heo từ mẫu bảo quản điều kiện khác Báo cáo khoa học CNTY, Bộ NN-PTNT, Tr.13-16 18 Nguyễn Lương, 1997 Dịch tễ học thú y tập II - Phần chuyên bệnh Tủ sách Đại học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh Tr 46-52 19 Nguyễn Việt Nga, Thái Quốc Hiếu, Trần Thị Dân, Nguyễn Ngọc Tuân, Đồng Mạnh Hòa, 2005 Điều tra, xây dựng đồ dịch tễ bốn bệnh heo (dịch tả, lở mồm long móng, phó thương hàn, tụ huyết trùng), hai bệnh trâu bò (lở mồm long móng, tụ huyết trùng) đề xuất phương án khống chế dịch bệnh đàn gia súc tỉnh Tiền Giang Báo cáo đề tài nghiên cứu, Sở KHCN tỉnh Tiền Giang 51 20 Trần Thanh Phong, 1996 Bệnh truyền nhiễm virus heo Tủ sách Đại học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh Tr 1-28 21 Lê Hồng Phong, 1999 Bệnh dịch tả heo Bài giảng bệnh truyền nhiễm lớp Cao học Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh Tr 16-23 22 Kim Văn Phúc, Đặng Hùng, Phạm Thị Vui, Chris Morrissy, Nguyễn Thị Lam Hương, Nguyễn Thị Thu Hồng, Trần Đình Từ, 2004 Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật RT-PCR để phát virus dịch tả heo Báo cáo khoa học Chăn nuôi Thú y, Bộ NN - PTNT, 360-367 23 Phạm Hồng Sơn, 2004 Sử dụng phản ứng ngăn trở hồng cầu gián tiếp việc phát kháng nguyên dịch tả heo Tạp chí KHKT Thú y, tập XI(1) Tr 87-89 24 Hồ Thị Việt Thu, 2002 Một số ghi nhận bệnh dịch tả lợn đồng sông Cửu Long Lớp tập huấn hội thảo phương pháp khống chế, chẩn đoán bệnh dịch tả lợn Việt Nam Tr 33-42 25 Too H Seneque S., 2002 Bệnh dịch tả heo (Nguyễn Như Pho, Lâm Thị Thu Hương Lê Minh Hồng Anh dịch) Tài liệu hội thảo Công ty Merial Asia Private Limited 26 Trung tâm chẩn đoán Thú y Trung ương, 2003 Kết chẩn đoán bệnh dịch tả lợn Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương Hội nghị toàn quốc Bệnh dịch tả lợn 27 Nguyễn Ngọc Tuân, 2002 Vệ sinh thịt NXB Nông nghiệp Tr 202 – 204 28 Nguyễn Cẩm Tuyền, 2003 Khảo sát đặc điểm dịch tễ bước đầu xây dựng đồ dịch tễ bệnh dịch tả heo tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp - Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh 29 Trần Đình Từ, 1999 Bệnh dịch tả heo Bài giảng bệnh truyền nhiễm lớp Cao học Đại học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh 30 Trần Đình Từ, 2005 Vi rút học Bài giảng bệnh truyền nhiễm lớp Cao học Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh 52 31 Nguyễn Thế Vinh, Ken Inui, Hồ Thu Hương, Nguyễn Tiến Dũng, 2007 Phân tích di truyền vi rút dịch tả lợn Việt Nam Tạp chí KHKT Thú y, tập XIV(1) Tr 32-35 32 Phạm Phong Vũ – Cơ quan Thú y Vùng VI Trao đổi thông tin 33 Bùi Nghĩa Vượng, Ken Inui, Hồ Thu Hương, Nguyễn Tiến Dũng, 2006 Chẩn đoán bệnh dịch tả lợn phương pháp RT-PCR với mẫu máu lấy giấy thấm Tạp chí KHKT Thú y, tập XIII(5) Tr 24-26 TIẾNG NƯỚC NGOÀI 34 Becher P., Avalos-Ramirez R., Orlich M., Cedillo Rosales S., Konig M., Schweizer M., Stalder H., Schirrmeier H and Thiel H.J., 2003 Genetic and antigenic characterization of novel pestivirus genotypes: implications for classification Virology 311(1): 96-104 35 Beer M., Reimann I., Hoffmann B and Depner K., 2007 Novel marker vaccines against classical swine fever Vaccine 25(30): 5665-5670 36 Blacksell S D., Khounsy S., Boyle D B., Greiser-Wilke I., Gleeson L J., Westbury H A., Mackenzie J S., 2004 Phylogenetic analysis of the E2 gene of classical swine fever viruses from Lao PDR Virus Research 104:87–92 37 Brown L.M., Papa R.A., Frost M.J., Mackintosh S.G., Gu X., Dixon R.J and Shannon A.D., 2002 A single amino acid is critical for the expression of Bcell epitopes on the helicase domain of the pestivirus NS3 protein Virus Research 84(1-2): 111-124 38 CEC (Commission of the European Communities), 2003 Diagnostic Techniques and Vaccines for Foot-and- Mouth Disease, Classical Swine Fever, Avian Influenza and some other important OIE List A Diseases Report of the Scientific Committee on Animal Health and Animal Welfare 24- 25th April 2003, pp 59-74 39 Chen N., Hu H., Zhang Z., Shuai J., Jiang L., Fang W., 2008 Genetic diversity of the envelope glycoprotein E2 of classical swine fever virus: Recent isolates branched away from historical and vaccine strains Veterinary Microbiology 127: 286–299 53 40 Deng M C., Huang C C., Huang T S., Chang C Y., Lin Y J., Chien M S., Jong M H., 2005 Phylogenetic analysis of classical swine fever virus isolated from Taiwan Veterinary Microbiology 106:187-193 41 Dewulf J., Koenen F., Mintiens K., Denis P., Ribbens S., deKruif A., 2004 Analytical performance of several classical swine fever laboratory diagnostic techniques on live animals for detection of infection Journal of Virological Methods 119:137-143 42 Dong X.N and Chen Y.H., 2007 Marker vaccine strategies and candidate CSFV marker vaccines Vaccine 25(2): 205-230 43 Elbers A.R W., Vos J H., Bouma A., Stegeman J A., 2004 Ability of veterinary pathologists to diagnose Classical Swine Fever from clinical signs Preventive Veterinary Medicine 66: 239-246 44 Harding M., 1994 Reverse transcriptase-PCR assay for detection of hog cholera virus Jounal of Clinical Biology 32(10): 2600-2602 45 Kamakawa A., Ho Thi Viet Thu, Yamada S., Kubo M., Yamasaki S and Taniguchi T., 2003 Classical swine fever among pig herds and its control in Cantho province, Mekong delta Department of Veterinary Medicine, Faculty of Agriculture, Can Tho University 46 Kennedy and Palmer, 2006 Pathology of domestic animals Fith edition Volume pp 79-85 47 Konig M., Lengsfeld T., Pauly T., Stark R., Thiel H.J., 1995 Classical swine fever virus: independent induction of protective immunity by two structural glycoproteins Journal of Virology 69(10): 6479–6486 48 Laevens H., Koenen F., Deluyker H., 1999 Experimental infection of slaughter pigs with Classical Swine Fever virus deversity and evolution Journal of General Virology 77:1311–1321 49 Liu L., Widen F., Baule C., Belak S., 2007 A one-step, gel-based RT-PCR assay with comparable performance to real-time RT-PCR for detection of classical swine fever virus Journal of Virological Methods 139: 203–207 50 Mengeling W.L and Packer R.A., 1969 Pathogenesis of chronic hog cholera: host response American Journal of Veterinary Research 30: 409–417 51 Moennig V., 1990 Pestivirus: a review Veterinary Microbiology 23: 35-54 54 52 Moennig V., Floegel-Niesmann G and Greiser-Wilke I., 2003 Clinical signs and epidemiology of classical swine fever: a review of new knowledge Veterinary Journal 165(1): 11-20 53 OIE, 2003 Diagnostic techniques and vaccines for Foot and Mouth Disease, Classical Swine Fever, Avian Influenza and some other important OIE list A Disease pp 59 –74 54 Paton D J., McGoldrick, A., Greiser-Wilke, I., Parchariyanon, S., Song, J., Liou, P P., Stadejek, T., Lowings, J P., Bjorklund, H., and Belak, S., 2000a Genetic typing of classical swine fever virus Veterinary Microbiology 73: 137157 55 Paton D J, McGoldrick A., Belak S., Mittelholzer C., Koenen F., Biagetti H., De Mia G M., Stadejek T., Hofmann M.A., Thuer B., 2000b Classical swine fever virus: a ring test to evaluate RT-PCR detection methods Veterinary Microbiology 73 (2000) 159-174 56 Pereda J A., 2005 Phylogenetic analysis of classical swine fever virus (CSFV) field isolates from outbreaks in South and Central America Virus Research 110: 111-118 1.2.1 57 Risatti G.R., Callahan J.D., Nelson W.M and Borca M.V., 2003 Rapid Detection of Classical Swine Fever Virus by a Portable Real-Time Reverse Transcriptase PCR Assay Journal of Clinical Microbiology 41(1): 500-505 58 Ruggli N., Tratschin J.D., Mittelholzer C., Hofmann M.A., 1996 Nucleotide sequence of classical swine fever virus strain Alfort/187 and transcription of infectious RNA from stably cloned full-length cDNA Journal of Virology 70: 3478-3487 59 Stuart D B., Khounsy S., Boyle B.D., Irene Greiser-Wilke, Laurence J G., Harvey A W., Mackenzie S.J., 2004 Phylogenetic analysis of the E2 gene of classical swine fevervirutes from Lao PDR Virus Research 104: 87–92 60 Szent-Ivanyi T., 1984 The history of classical swine fever control in Hungary and experiences with procduction and use of C-strain vaccine Report FAD/CEC seminar on African swine fever and hog cholera, Rome, pp 22-25 55 61 Terpstra C., 1991 Hog cholera: an update of present knowledge The British Veterinary Jounnal 147:397-406 62 Tu et al., Tu C., Lu Z., Li H., Yu X., Liu X., Li Y., Zhang H and Yin Z., 2001 Phylogenetic comparison of classical swine fever virus in China, Virus Research 81, pp 29–37 63 Uttenthal A., Le potier M., Romero L., De Mia G.M and Floegel-Niesmann G., 2001 Classical swine fever (CSF) marker vaccine, trial I, chalenge studies in weaner pigs Veterinary Microbiology 83:85-106 64 Van Oirschot, 1992 Hog cholera Disease of swine 7th edition – IOWA USA pp 274 – 285 65 Van Oirschot and Terpstra C., 1997 A congenital persistant Classical Swine Fever Clinical and virogical observation veterinary microboil 66 Van Oirschot, 1998 Description of the virus infection Classical Swine Fever and related viral infection Mantinus Nijhoft Publishing Pp -19 67 Van Oirschot, 1999 Classical Swine Ferver (Hog cholera) In Disease of Swine (B E Straw, S D’Allair, W L Mengeling and D J Taylor) 8th edition Iowa State University Press, Ames, Iowa, USA 68 Wengler G., Bradley D.W., Colett M.S., Heinz F.X., Schlesinger R.W., Strauss H.J., 1995 Flaviviridae Virus Taxonomy (Murphy F.A., Fauquet C.M., Bishop D.H.L., Ghabrial S.A., Jarbis A.W., Martelli G.P., Mayo M.A., Summers M.D.) Sixth report of the international committee on taxonomy of viruses Springer-Verlag, Wien, NY, pp 415– 427 69 Wirz B., Tratschin J.D., Müller H.K and Mitchell D.B., 1993 Detection of hog cholera virus and differentiation from other pestiviruses by polymerase chain reaction Jounal of Clinical Microbiology 31(5): 1148-1154 70 Wise D.J., Carter G.R., Flores E.F., 2005 Laboratory Diagnosis of Viral Infections A Concise Review of Veterinary Virology (G.R Carter, D.J Wise and E.F Flores) International Veterinary Information Service, Ithaca, New York, USA, pp 38-44 71 Zhang G., Flick-Smith H and Mc Cauley J.W., 2003 Differences in membrane association and sub-cellular distribution between NS2-3 and NS3 of bovine viral diarrhoea virus Virus Research 97: 89-102 56 72 www.activemotif.com/ /products/nr_sandwich.jpg www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi www.idexx.com/production/swine/6209101m.pdf http://users.ugent.be/~avierstr/principles/pcrsteps.gif 57 PHỤ LỤC PHIẾU KHẢO SÁT BỆNH DỊCH TẢ HEO TẠI LÒ MỔ Số phiếu……/…… Ngày /tháng/ năm khảo sát:………/…… /……… Tổng số heo nhập lò/đêm:…… Số heo nghi ngờ bệnh dịch tả /đêm……… Nguồn gốc thú : xã: ………………… huyện:…………………… Trọng lượng lúc giết mổ (khoảng):…… kg Giống heo khảo sát : I- Heo nội Heo lai Triệu chứng lâm sàng: Da xuất huyết: điểm Viêm niêm mạc mắt: có đốm khơng khơng Thể trạng gầy ốm: II- Khó thở chảy mũi Co giật đứng xiêu vẹo Bệnh tích: Hạch: sưng Thanh quản: xuất huyết xuất huyết Phổi: tụ huyết xuất huyết Gan: sưng Lách: Sưng xuất huyết hoại tử xơ nhồi huyết xuất huyết Van hồi manh tràng: xuất huyết Thận: sưng xuất huyết Bàng quang: xuất huyết Túi mật xuất huyết III- tụ máu Lấy bệnh phẩm - Xét nghiệm: lách - Vi thể: lách, hạch màng treo ruột, thận 58 loét hình cúc áo loét tràn lan vàng sung huyết So sánh thống kê biểu lâm sàng heo nghi bệnh DTH Chi-Square Test: xhdiem, xhdom Expected counts are printed below observed counts xhdiem 89 76.50 xhdom 64 76.50 Total 153 151 163.50 176 163.50 327 Total 240 240 480 Chi-Sq = 2.042 + 2.042 + 0.956 + 0.956 = 5.996 DF = 1, P-Value = 0.014 Chi-Square Test: xhdiem, gayom Expected counts are printed below observed counts xhdiem 89 71.50 gayom 54 71.50 Total 143 151 168.50 186 168.50 337 Total 240 240 480 Chi-Sq = 4.283 + 4.283 + 1.818 + 1.818 = 12.201 DF = 1, P-Value = 0.000 Chi-Square Test: xhdiem, ddxieuveo Expected counts are printed below observed counts xhdiem ddxieuve 89 27 58.00 58.00 Total 116 151 182.00 213 182.00 364 Total 240 240 480 Chi-Sq = 16.569 + 16.569 + 5.280 + 5.280 = 43.698 DF = 1, P-Value = 0.000 59 Chi-Square Test: xhdiem, vkmac Expected counts are printed below observed counts xhdiem 89 83.50 vkmac 78 83.50 Total 167 151 156.50 162 156.50 313 Total 240 240 480 Chi-Sq = 0.362 + 0.362 + 0.193 + 0.193 = 1.111 DF = 1, P-Value = 0.292 So sánh thống kê biểu lâm sàng heo dương tính E2 Chi-Square Test: xhdiem, xhdom Expected counts are printed below observed counts xhdiem 45 27.00 xhdom 27.00 Total 54 25 43.00 61 43.00 86 Total 70 70 140 Chi-Sq = 12.000 + 12.000 + 7.535 + 7.535 = 39.070 DF = 1, P-Value = 0.000 Chi-Square Test: xhdiem, gayom Expected counts are printed below observed counts xhdiem 45 35.00 gayom 25 35.00 Total 70 25 35.00 45 35.00 70 Total 70 70 140 Chi-Sq = 2.857 + 2.857 + 2.857 + 2.857 = 11.429 DF = 1, P-Value = 0.001 60 Chi-Square Test: xhdiem, ddxieuveo Expected counts are printed below observed counts xhdiem ddxieuve 45 15 30.00 30.00 Total 60 25 40.00 55 40.00 80 Total 70 70 140 Chi-Sq = 7.500 + 7.500 + 5.625 + 5.625 = 26.250 DF = 1, P-Value = 0.000 Chi-Square Test: xhdiem, vkmac Expected counts are printed below observed counts xhdiem 45 41.00 vkmac 37 41.00 Total 82 25 29.00 33 29.00 58 Total 70 70 140 Chi-Sq = 0.390 + 0.390 + 0.552 + 0.552 = 1.884 DF = 1, P-Value = 0.170 So sánh thống kê số biểu lâm sàng ghép heo dương tính E2 Chi-Square Test: 1bieuhien, 2bieuhien Expected counts are printed below observed counts 1bieuhie 2bieuhie 22 36 29.00 29.00 Total 58 48 41.00 34 41.00 82 Total 70 70 140 Chi-Sq = 1.690 + 1.690 + 1.195 + 1.195 = 5.770 DF = 1, P-Value = 0.016 Chi-Square Test: 1bieuhien, 3bieuhien Expected counts are printed below observed counts 1bieuhie 3bieuhie 22 11 16.50 16.50 Total 33 61 48 53.50 59 53.50 107 Total 70 70 140 Chi-Sq = 1.833 + 1.833 + 0.565 + 0.565 = 4.798 DF = 1, P-Value = 0.029 Chi-Square Test: 1bieuhien, 4bieuhien Expected counts are printed below observed counts 1bieuhie 4bieuhie 22 11.50 11.50 Total 23 48 58.50 69 58.50 117 Total 70 70 140 Chi-Sq = 9.587 + 9.587 + 1.885 + 1.885 = 22.943 DF = 1, P-Value = 0.000 Chi-Square Test: 2bieuhien, 3bieuhien Expected counts are printed below observed counts 2bieuhie 3bieuhie 36 11 23.50 23.50 Total 47 34 46.50 59 46.50 93 Total 70 70 140 Chi-Sq = 6.649 + 6.649 + 3.360 + 3.360 = 20.018 DF = 1, P-Value = 0.000 Chi-Square Test: 2bieuhien, 4bieuhien Expected counts are printed below observed counts 2bieuhie 4bieuhie 36 18.50 18.50 Total 37 34 51.50 69 51.50 103 Total 70 70 140 Chi-Sq = 16.554 + 16.554 + 5.947 + 5.947 = 45.001 DF = 1, P-Value = 0.000 62 Chi-Square Test: 3bieuhien, 4bieuhien Expected counts are printed below observed counts 3bieuhie 4bieuhie 11 6.00 6.00 Total 12 59 64.00 69 64.00 128 Total 70 70 140 Chi-Sq = 4.167 + 4.167 + 0.391 + 0.391 = 9.115 DF = 1, P-Value = 0.003 So sánh thống kê cặp có biểu lâm sàng ghép heo dương tính E2 Chi-Square Test: xhd+vkm, xhd+gayom Expected counts are printed below observed counts xhd+vkm xhd+gayo 21 14.50 14.50 Total 29 15 21.50 28 21.50 43 Total 36 36 72 Chi-Sq = 2.914 + 2.914 + 1.965 + 1.965 = 9.758 DF = 1, P-Value = 0.002 Chi-Square Test: xhd+vkm, xhdom+vkm Expected counts are printed below observed counts xhd+vkm xhdom+vk 21 11.00 11.00 Total 22 15 25.00 35 25.00 50 Total 36 36 72 Chi-Sq = 9.091 + 9.091 + 4.000 + 4.000 = 26.182 DF = 1, P-Value = 0.000 Chi-Square Test: xhd+vkm, g/om+vkm Expected counts are printed below observed counts xhd+vkm g/om+vkm 21 12.00 12.00 15 24.00 33 24.00 Total 24 48 63 Total 36 36 72 Chi-Sq = 6.750 + 6.750 + 3.375 + 3.375 = 20.250 DF = 1, P-Value = 0.000 Chi-Square Test: xhd+vkm, g/om+ddxv Expected counts are printed below observed counts xhd+vkm g/om+ddx 21 12.00 12.00 Total 24 15 24.00 33 24.00 48 Total 36 36 72 Chi-Sq = 6.750 + 6.750 + 3.375 + 3.375 = 20.250 DF = 1, P-Value = 0.000 So sánh thống kê số bệnh tích đại thể heo dương tính E2 Chi-Square Test: lach/nhh, vhmt/loet Expected counts are printed below observed counts lach/nhh vhmt/loe 30 54 42.00 42.00 Total 84 40 28.00 16 28.00 56 Total 70 70 140 Chi-Sq = 3.429 + 3.429 + 5.143 + 5.143 = 17.143 DF = 1, P-Value = 0.000 Chi-Square Test: lach/nhh, hmtr/xh Expected counts are printed below observed counts lach/nhh 30 36.50 hmtr/xh 43 36.50 Total 73 40 33.50 27 33.50 67 Total 70 70 140 Chi-Sq = 1.158 + 1.158 + 1.261 + 1.261 = 4.837 DF = 1, P-Value = 0.028 64 Chi-Square Test: lach/nhh, than/xh Expected counts are printed below observed counts lach/nhh 30 36.00 than/xh 42 36.00 Total 72 40 34.00 28 34.00 68 Total 70 70 140 Chi-Sq = 1.000 + 1.000 + 1.059 + 1.059 = 4.118 DF = 1, P-Value = 0.042 Chi-Square Test: vhmt/loet, hmtr/xh Expected counts are printed below observed counts vhmt/loe 54 48.50 hmtr/xh 43 48.50 Total 97 16 21.50 27 21.50 43 Total 70 70 140 Chi-Sq = 0.624 + 0.624 + 1.407 + 1.407 = 4.061 DF = 1, P-Value = 0.044 Chi-Square Test: vhmt/loet, than/xh Expected counts are printed below observed counts vhmt/loe 54 48.00 than/xh 42 48.00 Total 96 16 22.00 28 22.00 44 Total 70 70 140 Chi-Sq = 0.750 + 0.750 + 1.636 + 1.636 = 4.773 DF = 1, P-Value = 0.029 65 ... DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH HỒ HUỲNH MAI KHẢO SÁT BIỂU HIỆN LÂM SÀNG VÀ BỆNH TÍCH TRÊN HEO GIẾT MỔ DƯƠNG TÍNH DỊCH TẢ HEO, XÁC ĐỊNH NHĨM DI TRUYỀN CỦA VI-RÚT DỊCH TẢ HEO TẠI TIỀN... KHẢO SÁT BIỂU HIỆN LÂM SÀNG VÀ BỆNH TÍCH TRÊN HEO GIẾT MỔ DƯƠNG TÍNH DỊCH TẢ HEO, XÁC ĐỊNH NHÓM DI TRUYỀN CỦA VI-RÚT DỊCH TẢ HEO TẠI TIỀN GIANG HỒ HUỲNH MAI Hội đồng chấm luận văn: Chủ tịch: Thư... sàng bệnh tích heo giết mổ dương tính dịch tả heo, xác định nhóm di truyền vi-rút dịch tả heo Tiền Giang 1.2 Mục tiêu - Xác định tần suất triệu chứng bệnh tích heo có kết ELISA dương tính với