CHẨN ĐOÁN BỆNH DO MYCOPLASMA HYOPNEUMONIAE DỰA VÀO BỆNH TÍCH ĐẠI THỂ, PHÂN LẬP VÀ KẾT HỢP VỚI KỸ THUẬT PCR TRÊN PHỔI HEO THỊT CÓ BỆNH TÍCH NGHI NGỜ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP CHẨN ĐỐN BỆNH DO MYCOPLASMA HYOPNEUMONIAE DỰA VÀO BỆNH TÍCH ĐẠI THỂ, PHÂN LẬP VÀ KẾT HỢP VỚI KỸ THUẬT PCR TRÊN PHỔI HEO THỊT CĨ BỆNH TÍCH NGHI NGỜ Họ tên sinh viên: NGUYỄN NGỌC HOA XUÂN Ngành: DƯỢC THÚ Y Niên khóa: 2004 – 2009 Tháng 08/2009 CHẨN ĐỐN BỆNH DO Mycoplasma hyopneumoniae DỰA VÀO BỆNH TÍCH ĐẠI THỂ, PHÂN LẬP VÀ KẾT HỢP VỚI KỸ THUẬT PCR TRÊN PHỔI HEO THỊT CĨ BỆNH TÍCH NGHI NGỜ Tác giả NGUYỄN NGỌC HOA XUÂN Khóa luận đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp Bác sĩ ngành Dược thú y Giáo viên hướng dẫn: ThS Nguyễn Thị Phước Ninh BSTY Lâm Thị Tú Anh BSTY Đỗ Tiến Duy Tháng 08 năm 2009 i LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, xin gởi lời biết ơn đến ba mẹ hết lịng chăm lo, ni dưỡng khơn lớn Xin cảm ơn Ban giám hiệu Trường Đại học Nông Lâm TP HCM, Ban chủ nhiệm khoa Chăn Nuôi Thú Y tạo điều kiện thuận lợi suốt q trình học tập nghiên cứu tơi Xin chân thành cảm ơn tất thầy cô Khoa Chăn Ni Thú Y tận tình truyền đạt cho kiến thức khoa học chuyên môn, thực tế đời sống suốt năm qua Đó kiến thức vơ quý giá, hành trang thiếu cho sinh viên trước bước vào đời Xin trân trọng biết ơn cô Nguyễn Thị Phước Ninh, thầy Đỗ Tiến Duy chị Lâm Thị Tú Anh tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho em trình thực đề tài tốt nghiệp Xin cảm ơn Ban quản lý Bệnh Viện Thú Y, Ban quản lý Viện nghiên cứu công nghệ sinh học môi trường Trường Đại học Nông Lâm, Ban quản lý Trạm Thú Y quận Bình Thạnh, Ban giám đốc xí nghiệp chế biến thực phẩm Nam Phong tạo điều kiện thuận lợi cho thực đề tài Xin cảm ơn anh chị làm việc Bệnh Viện Thú Y, anh chị làm việc nghiên cứu trung tâm thí nghiệm hóa sinh giúp đỡ nhiều thực tập Cuối cùng, xin cảm ơn bạn bè giúp đỡ, chia sẻ với vui buồn, khó khăn suốt thời gian học tập thực tập ii TĨM TẮT Đề tài “Chẩn đốn bệnh Mycoplasma hyopneumoniae dựa vào bệnh tích đại thể, phân lập kết hợp với kỹ thuật PCR phổi heo thịt có bệnh tích nghi ngờ” tiến hành xí nghiệp chế biến thực phẩm Nam Phong, Bệnh Viện Thú Y Viện nghiên cứu công nghệ sinh học môi trường Trường Đại học Nông Lâm, thời gian từ ngày 02/03/09 đến ngày 21/08/09 Nghiên cứu nhằm góp phần xây dựng phương pháp chẩn đốn Mycoplasma hyopneumoniae (MH) phịng thí nghiệm Chúng tơi tiến hành đánh giá mẫu phổi có bệnh tích chung theo cơng thức Christensen (1999) mẫu phổi có bệnh tích nghi ngờ MH theo Rice (2000) thu thập số mẫu phổi nghi ngờ nhiễm MH để phân lập môi trường Friis’ xác định có mặt MH kỹ thuật PCR Qua khảo sát 183 mẫu phổi, ghi nhận kết sau: − Tỷ lệ phổi có bệnh tích chung đánh giá 84,15 % (154/183), mức độ hư hại trung bình chung phổi đánh giá 39,37 % − Tỷ lệ phổi có bệnh tích đặc trưng MH heo thịt giết mổ 70,78 % (109/154) Điểm trung bình phổi nghi ngờ MH 1,150 điểm Trên phổi có bệnh tích nghi ngờ nhiễm MH xuất từ đến loại bệnh tích Trong đó, phổi có loại bệnh tích chiếm tỷ lệ cao (44 %) Chúng tơi thu thập 20 mẫu phổi có bệnh tích nghi ngờ, sau phân lập kiểm tra PCR, kết thu sau: − Việc phân lập MH từ mẫu phổi nghi ngờ môi trường thạch Friis’ cho kết dương tính 40 % − Kỹ thuật PCR để xác định MH phổi có bệnh tích nghi ngờ MH cho kết dương tính 15 % iii MỤC LỤC Trang tựa i Lời cảm ơn ii Tóm tắt iii Mục lục iv Danh sách chữ viết tắt vi Danh sách hình vii Danh sách bảng viii Danh sách biểu đồ, sơ đồ ix Chương MỞ ĐẦU .1 U 1.1 Đặt vấn đề .1 1.2 Mục đích yêu cầu .2 1.2.1 Mục đích .2 1.2.2 Yêu cầu Chương CƠ SỞ LÝ LUẬN 2.1 Bệnh viêm phổi địa phương truyền nhiễm 2.1.1 Lịch sử phân bố địa lý .3 2.1.2 Căn bệnh .4 2.1.3 Truyền nhiễm học 2.1.4 Triệu chứng 2.1.5 Bệnh tích 2.1.6 Chẩn đoán 10 2.1.7 Điều trị 11 2.1.8 Phòng bệnh 12 2.2 Môi trường nuôi cấy MH 12 2.3 Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) 14 2.3.1 Giới thiệu sơ lược PCR 14 2.3.2 Nguyên tắc phương pháp PCR 14 2.3.3 Thành phần phản ứng PCR 15 2.3.4 Ưu, nhược điểm kỹ thuật PCR 18 iv 2.3.5 Phương pháp điện di gel .19 2.4 Sơ lược số nghiên cứu phân lập MH ứng dụng kỹ thuật PCR chẩn đoán MH 19 Chương NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH .21 3.1 Thời gian địa điểm 21 3.1.1 Thời gian 21 3.1.2 Địa điểm .21 3.2 Đối tượng nghiên cứu 21 3.3 Dụng cụ vật liệu thí nghiệm 21 3.3.1 Dụng cụ 21 3.3.2 Vật liệu 21 3.4 Nội dung thí nghiệm 22 3.5 Phương pháp tiến hành .22 3.5.1 Đánh giá mức độ hư hại phổi 22 3.5.2 Phân lập MH từ phổi nghi ngờ bị suyễn heo .24 3.5.3 Phản ứng PCR để xác định MH 25 3.6 Phương pháp xử lý số liệu 28 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29 4.1 Kết đánh giá bệnh tích đại thể phổi 29 4.1.1 Đánh giá bệnh tích chung phổi .29 4.1.2 Đánh giá bệnh tích đại thể phổi có tính định hướng MH 33 4.2 Kết phân lập MH môi trường thạch Friis’ 39 4.3 Kết xác định MH kỹ thuật PCR từ mẫu phổi 43 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 46 5.1 Kết luận .46 5.2 Đề nghị 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO .47 PHỤ LỤC 49 v DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT APP : Actinobacillus pleuropneumoniae BHI : Brain Heat Infusion broth bp : base pair CF : complement fixation ctv : cộng tác viên DNA : deoxyribonucleic acid dNTP : deoxyribonucleic triphosphate ELISA : Enzyme Linked Immunosorbent Assay EDTA : Ethylene Diamine Tetracetic Acid IHA : Indirect hemagglutination kb : kilobase MH : Mycoplasma hyopneumoniae PRRS : Porcine reproductive and respiratory syndrome virus PBS : phosphate buffered saline PCR : Polymera Chain Reaction PPLO : Pleuro-Pneumoniae-Like-Organism SDS : Sodium Dodecyl Sulfat SPF : Specific Pathogen Free Taq : Thermus aquaticus TBE : Tris borate EDTA TE : Tris EDTA Tm : temperature melting UI : unit international UV : utral violet vi DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1: Ngun tắc phản ứng PCR (theo Phạm Hùng Vân, 2008) .15 Hình 4.1: Phổi bị nhục hóa có tính đối xứng (mũi tên) .34 Hình 4.2: Khuẩn lạc MH mọc mơi trường thạch Friis’ sau ngày nuôi cấy (mũi tên) với độ phóng đại (10 x 10) .40 Hình 4.3: Khuẩn lạc MH mọc môi trường thạch Friis’ sau ngày ni cấy với độ phóng đại (10 x 10) 40 Hình 4.4: Khuẩn lạc MH mọc mơi trường thạch Friis’ sau 10 ngày nuôi cấy với độ phóng đại (10 X 10) .41 Hình 4.5: Kết điện di để kiểm tra DNA tổng số từ khuẩn lạc 43 Hình 4.6: Kết chạy PCR mẫu phân lập thạch Friis’ 43 Hình 4.7: Kết điện di DNA tổng số mẫu ly trích từ phổi .45 Hình 4.8: Kết chạy PCR mẫu ly trích từ phổi .45 vii DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 3.1: Bố trí thí nghiệm 22 Bảng 4.1: Tỷ lệ phổi có bệnh tích đánh giá 29 Bảng 4.2: Mức độ hư hại chung phổi 30 Bảng 4.3: Các bệnh tích thường gặp phổi heo đánh giá (n = 154) 32 Bảng 4.4: Tỷ lệ phổi có bệnh tích nghi ngờ MH đánh giá 34 Bảng 4.5: Điểm trung bình phổi nghi ngờ MH 35 Bảng 4.6: Số lần xuất bệnh tích phổi nghi MH 38 Bảng 4.7: Số dạng bệnh tích xuất phổi 38 Bảng 4.8: Kết phân lập MH từ phổi nghi ngờ 39 Bảng 4.9: Kết xác định MH từ khuẩn lạc nghi ngờ kỹ thuật PCR 42 Bảng 4.10: Kết xác định MH kỹ thuật PCR từ mẫu phổi 44 viii DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ VÀ SƠ ĐỒ Biểu đồ 4.1: Mức độ hư hại trung bình thùy phổi 31 Biểu đồ 4.2: Mức độ hư hại hư hại trung bình phổi .31 Biểu đồ 4.3: Các bệnh tích thường gặp phổi heo đánh giá 33 Biểu đồ 4.4: Điểm trung bình thùy phổi nghi ngờ MH .36 Biểu đồ 4.5: Điểm trung bình phổi nghi ngờ MH .36 Sơ đồ 3.1: Sơ đồ phân lập MH 25 ix Bảng 4.5 biểu đồ 4.4 cho thấy điểm hư hại trung bình thùy phổi nghi ngờ MH có khác lớn (P < 0,001) Thùy tim phổi phải hư hại nhiều (1,761 điểm), thùy tim phổi trái (1,688 điểm), thùy hồnh cách mơi phổi trái hư hại (0,954 điểm) Ở phổi trái, điểm hư hại nghi ngờ MH giảm dần theo thứ tự: thùy tim, thùy đỉnh, thùy hồnh cách mơ Ở phổi phải, mức độ hư hại nghi ngờ MH giảm dần theo thứ tự: thùy tim, thùy đỉnh, thùy phụ, thùy hồnh cách mơ Theo Nguyễn Vĩnh Phước (1978), bệnh suyễn heo viêm phổi thùy tim lan sang thùy đỉnh, thùy hồnh cách mơ thùy phụ thùy tim thường mang bệnh tích nặng Bảng 4.5 biểu đồ 4.5 cho thấy điểm hư hại trung bình phổi phải cao phổi trái, nhiên khác biệt khơng có ý nghĩa mặt thống kê (P > 0,05) Điểm hư hại trung bình phổi nghi ngờ MH 1,150 điểm Sự hư hại MH phổi khảo sát thấp Có thể nguồn heo khảo sát chủng ngừa vaccin MH trước nuôi thịt Theo Ross ctv (1984), việc sử dụng vaccin phịng bệnh suyễn heo khơng ngăn ngừa bệnh làm giảm mức độ nghiêm trọng bệnh, ngăn ngừa phát triển bệnh tích đại thể phổi Mặt khác, người chăn ni điều trị bệnh kháng sinh làm giới hạn bệnh tích phổi Theo Nguyễn Như Pho (1999), số kháng sinh sulfamid có nhóm kháng sinh có hiệu lực Mycoplasma hyopneumoniae là: nhóm tetracycline, nhóm macrolide nhóm quinolone Khi sử dụng kháng sinh để điều trị bệnh này, hệ thống hô hấp không hoàn toàn phục hồi lúc đầu làm giảm phần tổn hại phổi 4.1.2.3 Các bệnh tích thường gặp phổi nghi ngờ MH Trên phổi nghi ngờ MH, bệnh tích mà MH gây nên (nhục hóa, hóa gan mang tính đối xứng), chúng tơi cịn phát dạng bệnh tích khác (hóa gan khơng đối xứng, xuất huyết, viêm dính, ổ mủ, tụ huyết) Số lần xuất bệnh tích 109 phổi khảo sát trình bày qua bảng 4.6, số dạng bệnh tích xuất phổi trình bày qua bảng 4.7 37 Bảng 4.6: Số lần xuất bệnh tích phổi nghi MH Bệnh tích Xuất huyết Nhục hóa Hóa gan Viêm dính Ổ mủ Tụ huyết Tổng Số lần xuất 32 109 44 39 26 251 Tỷ lệ (%) 12,75 43,43 17,53 15,54 10,36 0,40 100,00 Bảng 4.7: Số dạng bệnh tích xuất phổi Số bệnh tích phổi Số lần xuất 20 48 29 12 Tỷ lệ (%) 18 44 27 0,05 ) One-way Analysis of Variance Analysis of Variance for huhai Source DF SS MS thuyphoi 11075 1846 Error 1071 1383602 1292 Total 1077 1394677 Level DP DT HP HT PP TP TT N 154 154 154 154 154 154 154 Mean 39,92 32,26 39,99 39,29 35,04 42,12 40,25 StDev 36,66 36,37 35,54 35,81 36,02 34,16 36,97 F 1,43 P 0,200 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev + -+ -+ -+ ( -* ) ( -* ) ( -* ) ( * -) ( * -) ( * -) ( * -) 49 Pooled StDev = + -+ -+ -+ 30,0 36,0 42,0 48,0 35,94 Sự khác biệt mức độ hư hại trung bình phổi trái phổi phải bảng 4.2 khơng có ý nghĩa mặt thống kê (P > 0,05) One-way Analysis of Variance Analysis of Variance for huhai Source DF SS MS phoi 144 144 Error 306 320175 1046 Total 307 320319 Level PHP PT N 154 154 Pooled StDev = Mean 39,92 38,55 StDev 30,51 34,09 32,35 F 0,14 P 0,711 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev -+ -+ -+ -+( * ) ( * ) -+ -+ -+ -+35,0 38,5 42,0 45,5 Sự khác biệt điểm trung bình thùy phổi nghi ngờ MH bảng 4.5 có ý nghĩa mặt thống kê (P < 0,001) One-way Analysis of Variance Analysis of Variance for diem tb Source DF SS MS thuy 92,42 15,40 Error 756 1291,03 1,71 Total 762 1383,44 Level DP DT HP HT PP TP TT N 109 109 109 109 109 109 109 Pooled StDev = Mean 0,963 0,734 1,064 1,046 1,101 1,734 1,688 1,307 StDev 1,224 1,237 1,356 1,350 1,360 1,252 1,359 F 9,02 P 0,000 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev -+ -+ -+ -+ ( * ) ( * ) ( * ) ( * ) ( * ) ( * ) ( * ) -+ -+ -+ -+ 0,50 1,00 1,50 2,00 50 Sự khác biệt điểm trung bình phổi trái phổi phải nghi ngờ MH bảng 4.5 khơng có ý nghĩa mặt thống kê (P > 0,05) One-way Analysis of Variance Analysis of Variance for diem tb Source DF SS MS phoi 0,18 0,18 Error 216 286,93 1,33 Total 217 287,11 Level PHP PT N 109 109 Pooled StDev = Mean 1,160 1,103 1,153 F 0,13 P 0,714 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev StDev -+ -+ -+ -+ 1,079 ( -* ) 1,221 ( * -) -+ -+ -+ -+ 0,90 1,05 1,20 1,35 Sự khác biệt số dạng bệnh tích xuất phổi bảng 4.7 có ý nghĩa mặt thống kê (P < 0,001) Chi-Square Test Expected counts are printed below observed counts phoi co phoi kho 20 89 27,25 81,75 Total 109 48 27,25 61 81,75 109 29 27,25 80 81,75 109 12 27,25 97 81,75 109 Total 109 327 436 Chi-Sq = 1,929 15,800 0,112 8,534 DF = 3, P-Value + 0,643 + 5,267 + 0,037 + 2,845 = 0,000 + + + = 35,168 51 ...CHẨN ĐỐN BỆNH DO Mycoplasma hyopneumoniae DỰA VÀO BỆNH TÍCH ĐẠI THỂ, PHÂN LẬP VÀ KẾT HỢP VỚI KỸ THUẬT PCR TRÊN PHỔI HEO THỊT CĨ BỆNH TÍCH NGHI NGỜ Tác giả NGUYỄN NGỌC... tài ? ?Chẩn đốn bệnh Mycoplasma hyopneumoniae dựa vào bệnh tích đại thể, phân lập kết hợp với kỹ thuật PCR phổi heo thịt có bệnh tích nghi ngờ? ?? tiến hành xí nghi? ??p chế biến thực phẩm Nam Phong, Bệnh. .. phân lập kết hợp với kỹ thuật PCR phổi heo thịt có bệnh tích nghi ngờ? ?? 1.2 Mục đích yêu cầu 1.2.1 Mục đích Chẩn đoán bệnh viêm phổi địa phương cách phân lập Mycoplasma hyopneumoniae kết hợp với kỹ