Bƣớc1 : Nghiền 0,3 g lá trong nitơ lỏng và cho vào eppendort 1,5 ml. Bƣớc 2 : Cho 1,3 ml dịch EB đã đƣợc ủ nóng ở 650
C vào eppendort rồi vortex thật kỹ.
Bƣớc 3 : Mẫu đƣợc ủ trong 1 giờ ở 650C và sau đó ly tâm 11000 vòng/phút trong 15 phút ở 100C, hút lấy dịch trong cho vào một eppendort mới.
Bƣớc 4 : Sau đó cho 500 µl Chloroform:Isoamyl alcohol (24:1) đảo nhẹ và lắc đều.
Bƣớc 5 : Ly tâm 11000 vòng/phút trong 15 phút ở 100C, hút lấy dịch trong cho vào một eppendort mới.
Bƣớc 6 : Cho tiếp 500 µl Chloroform:Isoamyl alcohol (24:1) đảo nhẹ và lắc đều ly tâm 11000 vòng/phút trong 15 phút hút lấy dịch trong cho vào một eppendort mới.
Bƣớc 7 : Cho 300 µl Isopropanol lạnh và ủ 1 giờ ở -200
C (nên để qua đêm). Bƣớc 8 : Ly tâm 11000 vòng/phút trong 15 phút ở 40C, đổ bỏ dịch trong. Bƣớc 9 : Cho 300 µl TE 1X ủ 370
C trong 1 giờ, sau đó cho tiếp 20 µl Sodium acetate và 640 µl Ethanol 100% để tủa 30 phút ở -200
C.
Bƣơc 10 : Ly tâm 11000 vòng/phút trong 15 phút ở 40C đổ bỏ dịch trong. Bƣớc 11 : Rửa tủa với 400 µl Ethanol 70%, ly tâm 11000 vòng/phút trong 5
phút ở 40C, lập lại 1 lần nữa. Phơi mẫu 370C sau đó cho 100 µl TE 1X vào ủ 370C trong 30 phút.
Bƣớc 12 : Bảo quản mẫu 40 C.
3.4.4.3. Định tính DNA bằng phƣơng pháp điện di
Để định tính DNA, điện di các mẫu DNA đã ly trích trên gel agarose. Trong điện trƣờng, DNA di chuyển từ điện cực âm sang điện cực dƣơng, vì DNA mang điện âm (do tính chất của nhóm phosphate). Khi DNA di chuyển qua các lỗ của gel agarose, sự cọ sát giữa hạt agarose và phân tử DNA tạo ra lực kháng làm ngăn cản sự chuyển dịch của DNA. DNA có phân tử càng lớn thì lực cản càng mạnh. Do đó, DNA có phân tử càng nhỏ di chuyển càng nhanh. Nhờ vậy, có thể phân loại đƣợc các đoạn DNA trên gel agarose dựa vào kích thƣớc phân tử.
Sau khi điện di trên gel, các đoạn DNA đƣợc phân ra tùy theo trọng lƣợng phân tử. Mà có thể quan sát DNA bằng mắt nhờ kỹ thuật nhuộm màu với Ethidium bromide và chụp gel bằng tia UV.
Cách tiến hành:
Pha gel agarose với nồng độ 1%: Cân 0,125 g agarose cho vào 12,5 ml dung dịch TAE 0,5X. Đun sôi bằng lò Viba cho agarose tan thật đều.
Đổ gel và chờ agarose đông.
Load mẫu vào các giếng với tỷ lệ 2 µl loading dye và 4 µl DNA mẫu. Chạy điện di ở điều kiện 100 V, 250 mA, thời gian khoảng 20 phút.
Nhuộm Ethidium bromide khoảng 15 phút, sau đó đƣa vào máy Geldoc đọc kết quả.
