Kỹ thuật RAPD dựa trên kỹ thuật PCR, bằng cách sử dụng những primer ngắn (khoảng 10 nucleotide) có trình tự biết trƣớc, bắt cặp và nhân bản ngẫu nhiên những đoạn DNA có trình tự bổ sung với trình tự của các primer. Theo nguyên tắc, khi 2 cá thể hoàn toàn giống nhau, sau khi thực hiện phản ứng PCR – RAPD ở điều kiện nhƣ nhau sẽ tạo ra số lƣợng các đoạn bằng nhau và chiều dài các đoạn tƣơng ứng bằng nhau. Khi có đột biến làm xuất hiện hay mất đi một vị trí bắt cặp ngẫu nhiên sẽ tạo ra số lƣợng và chiều dài các đoạn DNA khác nhau giữa các cá thể, vì vậy kỹ thuật RAPD có thể phát hiện đột biến [2], [6].
Một trong những giới hạn của PCR chuẩn đối với ALP marker là mọi thông tin về chuỗi mã di truyền đầu tiên phải đƣợc biết rõ trƣớc khi chuẩn bị các primer
tƣơng ứng. Vì thế, việc áp dụng nó để nghiên cứu DNA genome của một giống cây trồng mới sẽ gặp nhiều khó khăn.
Vào đầu thập kỷ 90, một kỹ thuật phân tử mới dựa trên nguyên tắc PCR với tên gọi là RAPD (Random amplified polymorphic DNA) đã ra đời một cách độc lập tại hai phòng thí nghiệm khác nhau (William, 1990; Welsh và ctv., 1991).
Hình 2.4: Nguyên lý chỉ thị RAPD trong nghiên cứu sự đa dạng di truyền
Kỹ thuật này cho phép phát hiện tính đa hình các đoạn DNA đƣợc nhân bản ngẫu nhiên bằng việc dùng một primer chứa một trật tự nucleotide ngẫu nhiên. Thƣờng primer này chứa từ 9 - 12 oligonucleotit, tối thiểu là 4 bp. Có hàng ngàn loại primer chứa khoảng 10 bp nhƣng số lƣợng primer dùng trong nghiên cứu này rất hạn chế. Trong phản ứng này, các primer đơn gắn vào hai điểm khác nhau ở hai mạch đơn đối diện của DNA khuôn.
Nếu các điểm gắn primer nằm trong khoảng có thể nhân bản đƣợc (thƣờng 200 - 2000 nucleotide) thì đoạn DNA sẽ đƣợc nhân lên. Sự có mặt của sản phẩm này đƣợc quan sát thông qua điện di trên gel agarose hoặc polyacrylmide đã chứng tỏ có sự tƣơng đồng hoàn toàn hay một phần giữa DNA genome với các primer oligonucleotide. Các primer dùng trong RAPD có kích thƣớc ngắn nên dễ tìm đƣợc các đoạn tƣơng đồng trên các mạch đơn DNA trong genome. Vì thế, nó là một
thể. Ví dụ, tần số tìm thấy sự đa hình RAPD là 0,3 / 1 primer ở cây Arabidopsis thaliana là 0,5 / 1 primer ở cây đậu tƣơng, 1 / 1 primer ở ngô (Lê Duy Thành, 2000).
Các ƣu điểm chính của chỉ thị RAPD không cần biết trƣớc trình tự nuleotide của đoạn DNA cần khuếch đại, quy trình tiến hành nhanh, dễ làm, ít tốn kém, cho đa hình cao, tiến hành chỉ với một lƣợng nhỏ DNA tính bằng nanogam và trên một số lƣợng mẫu thí nghiệm lớn. Đồng thời RAPD không dùng chất phóng xạ để phát hiện đa hình. Do đó RAPD thƣờng dùng trong phân tích và xác định mối quan hệ thân thuộc giữa các thứ cây trồng hay giữa các cá thể để phục vụ công tác lai tạo hoặc phân loại.
Để nghiên cứu sự đa dạng di truyền bằng chỉ thị RAPD có thể tiến hành với các bƣớc nhƣ sau:
Tách chiết DNA tổng số, nhân DNA bằng máy PCR.
Điện di trên gel agarose hoặc gel polyacrylamid.
Xác định tính đa dạng di truyền bằng các phần mềm thông dụng (NTSYS-pc, UPGMA cluster.). Các số liệu thu đƣợc cho thấy sự gần gũi hoặc cách biệt di truyền của các mẫu nghiên cứu.
Ngoài những ứng dụng trong nghiên cứu sự đa đạng sinh học và nguồn gốc di truyền của các loài động vật, thực vật và vi sinh vật, chỉ thị RAPD cũng đƣợc sử dụng cho những mục đích sau:
Lập bản đồ liên kết, xác định những gen liên kết với một tính trạng nào đó nhƣ tính trạng chất lƣợng sợi ở cây bông, tính trạng kháng virus ở cà chua (Tatieni và ctv., 1996; Winter và ctv., 1995).
Phân tích cấu trúc di truyền của quần thể.
In dấu vân tay (DNA fingerprinting).
Phát hiện sự khác biệt trong các dòng soma (Somaclonal variation). Tuy có nhiều ứng dụng trong nghiên cứu đa dạng di truyền nhƣng chỉ thị RAPD cũng có một số hạn chế nhƣ sau:
Có tính trội (dominant) do đó khó phân biệt đƣợc những gen lặn hay cá thể dị hợp tử.
Có tính chất ngẫu nhiên nên sản phẩm PCR thƣờng không thống nhất.
Cần phải có các thiết bị điện toán để xử lý số liệu.
Độ tin cậy còn tuỳ thuộc vào kỹ thuật cá nhân.