Là những chỉ thị phân tử DNA đƣợc tạo ra nhờ những kỹ thuật sinh học phân tử. Có thể nói rằng kể từ khi con ngƣời biết đến sự hiện diện của gene và khi Watson và Crick phát minh ra cấu trúc của chuỗi DNA năm 1955, các kỹ thuật sinh học phân tử đƣợc phát minh ngày càng nhiều và càng ngày càng tỏ ra là công cụ đắc lực cho công tác nghiên cứu khoa học do số lƣợng chỉ thị nhiều hơn hẳn so với 2 loại chỉ thị trên (Tansley và ctv, 1980), độ tin cậy cao hơn và thuận tiện hơn nhiều. Càng ngày ngƣời ta càng tìm ra đƣợc nhiều kỹ thuật đánh giá đa dạng di truyền và phát hiện chỉ thị, tuy nhiên có thể đƣợc chia ra làm 2 nhóm:
Những kỹ thuật dựa trên kỹ thuật PCR (PCR based): RAPD, STS, SSR, SSCP, AFLP,…
Kỹ thuật dựa trên kỹ thuật lai DNA – DNA (Non PCR based): điển hình là RFLP.
Phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction) là phản ứng nhân bản nhanh chóng một chuỗi DNA nào đó trong ống nghiệm, phƣơng pháp này có ba axit nucleic: một DNA dây đôi cần phải khuyếch đại, hai sợi đơn đóng vai trò mồi (primer) với kích thƣớc rất ngắn chạy theo chiều thuận và chiều nghịch trên DNA nền, thêm vào là DNA polymerase, dNTP và một muối Mg2+
.
2.5.2.1 Nguyên lý kỹ thuật PCR
Đƣợc miêu tả qua 3 giai đoạn:
Giai đoạn 1 – Biến tính (denature): Biến tính DNA mạch đôi ở nhiệt độ cao (khoảng 92oC – 96oC) tạo những khuôn DNA mạch đơn có độ dài bằng nhau và bằng DNA mạch đôi tạo ra nó.
Giai đoạn 2 – Bắt cặp (annealing): Gắn các primer vào các khuôn DNA mạch đơn (tạo ra ở giai đoạn 1), dựa trên nguyên tắc bổ sung. Primer là các oligonucleotide có khoảng 10 – 25 nucleotide, có trình tự bắt cặp bổ sung với một đoạn nào đó trên DNA khuôn. Giai đoạn này thƣờng đƣợc tiến hành ở nhiệt độ 50o
C – 56oC.
Giai đoạn 3 – Kéo dài (extension): kéo dài mạch đơn DNA bắt đầu từ nucleotide cuối cùng của primer ở đầu 3’ do tác dụng của enzyme polymerase gắn các nucleotide vào với nhau, theo nguyên tắc bắt cặp bổ sung (A – T, G – C) với những nucleotide của mạch khuôn (DNA template). Kết quả là từ một phân tử DNA ban đầu sẽ cho 2 phân tử DNA hoàn toàn giống nhau và giống với phân tử DNA ban đầu về chiều dài và trình tự các nucleotide. Giai đoạn này thƣờng đƣợc tiến hành ở 70o
C – 72oC.
Phản ứng PCR đƣợc tiến hành với sự hiện diện của: đoạn DNA khuôn (DNA template), các dNTP, enzyme polymerase, các primer, MgCl2, dung dịch đệm (buffer) và máy thermocycler – máy điều khiển chu kỳ nhiệt độ, thực hiện duy trì và luân chuyển nhiệt độ của từng giai đoạn một cách chính xác và ổn định trong một khoảng thời gian chính xác trong 30 – 45 chu kỳ.
Hình 2.3: Nguyên lý của phản ứng PCR 2.5.2.2 Quy trình chuẩn của phản ứng PCR
Tiến hành qua 25 – 35 chu kì, trong điều kiện nhiệt độ và nồng độ các chất: Nồng độ các chất trong hỗn hợp PCR:
Nguyên lý kỹ thuật PCR
Từ 30 – 45 chu kỳ Bƣớc 1: Biến tính Bƣớc 2: Bắt cặp Bƣớc 3: Nối dài Nồng độ enzyme: Thƣờng sử dụng ở nồng độ 0,1 – 0,5 U/25 μl dung dịch phản ứng. Nếu nhƣ nồng độ enzyme Taq polymerase quá cao có thể làm phát sinh những sản phẩm không đặc hiệu, còn nếu nồng độ enzyme Taq polymerase quá thấp thì phản ứng không xảy ra hoàn toàn do không có đủ enzyme.
Các dNTP: Hàm lƣợng các dNTP trong khoảng 20 – 200 μM cho kết quả ổn định và đặc hiệu. Bốn loại dNTP (A, T, G, C) phải có nồng độ gần tƣơng đƣơng nhau.
Hàm lƣợng MgCl2: Nồng độ tối ƣu của MgCl2 cho kết quả PCR tốt. Ion Mg+ có thể ảnh hƣởng đến:
- Nhiệt độ để biến tính mạch đôi thành mạch đơn.
- Quá trình bắt cặp của primer: MgCl2 làm tăng khả năng bắt cặp chính xác của primer với DNA khuôn.
- Sự đặc hiệu của sản phẩm PCR: bao gồm cả sự bắt cặp chính xác của primer với DNA khuôn và sự nối dài chính xác.
- Hoạt động của enzyme và sự trung thực của kết quả.
Thông thƣờng hàm lƣợng ion Mg+ cần thiết từ 0,5 – 2,5 mM. Chu trình nhiệt:
Ban đầu thiết lập một giai đoạn nhiệt độ khoảng 94oC trong 5 phút để hầu nhƣ tất cả các đoạn DNA khuôn mạch đôi bị biến tính tách ra thành 2 DNA khuôn mạch đơn phân biệt và không tự bắt cặp lại với nhau.
Nhiệt độ biến tính: 94o
C – 96oC trong 15 giây hay lâu hơn, các sản phẩm của chu kỳ PCR trƣớc tiếp tục bị làm biến tính để thành DNA khuôn mạch đơn cho chu kỳ PCR tiếp theo.
Nhiệt độ bắt cặp: 55oC (50oC – 56oC) trong 30 giây. Nhiệt độ bắt cặp là quan trọng nhất, bảo đảm rằng không quá thấp (do dẫn đến bắt cặp không đặc hiệu) và cũng không quá cao (dẫn đến khó bắt cặp hoàn toàn hay không bắt cặp).
Nhiệt độ nối dài: 72oC trong 90 giây. Thời gian kéo dài phải đủ để có thể kéo dài hoàn toàn một trình tự và hầu hết các đoạn DNA khuôn mạch đơn, nếu không sẽ dẫn đến những kết quả sai lầm do không đủ thời gian để nối dài.
Ba bƣớc này lặp lại khoảng 30 – 45 chu kỳ.
Chu kì cuối cùng kết thúc bằng một khoảng thời gian nối dài ở 72oC trong 5 phút. Sản phẩm PCR sau đó sẽ đƣợc bảo quản ở 4oC hay –20oC.
2.5.2.3 Tối ƣu hoá phản ứng PCR
Trong quá trình thực hiện phản ứng PCR trên DNA của nhiều loại sinh vật khác nhau các nhà khoa học cần phải tối ƣu hóa các điều kiện cho phản ứng PCR bởi mỗi loại sinh vật có một đặc trƣng riêng. Các biện pháp tối ƣu đó liên quan đến những vấn đề.
Trình tự của primer: Trình tự của primer xác định kích thƣớc, vị trí của sản phẩm PCR và nhiệt độ Tm, giúp ƣớc lƣợng đƣợc nhiệt độ bắt cặp khoảng Tm – 2 (thƣờng chỉ đúng với những primer có chiều dài nhỏ hơn 20 basepairs).
Nhiệt độ bắt cặp: Ta = Tm – 2oC, trong đó:
Tm = 2oC x (A+T) + 4oC x (G+C) (Suggs và ctv, 1981). Với A, T, G, C là số lƣợng các nucleotide tƣơng ứng có trong chuỗi primer, tuy nhiên công thức này chỉ để tham khảo hay ƣớc lƣợng.
Nồng độ MgCl2: ảnh hƣởng lớn đến kết quả phản ứng, ngƣời ta thƣờng thay đổi nồng độ của MgCl2 trƣớc tiên để phản ứng xảy ra dễ dàng hơn.
Nồng độ các dNTP: mỗi dNTP thƣờng khoảng 200 μM.
Những enzyme DNA polymerase chịu nhiệt: Nên sử dụng ở nồng độ 0,5 U/25 μl đủ để kiểm soát sự đặc hiệu của phản ứng PCR. Không nên sử dụng enzyme ở nồng độ cao hơn 2,5 nM (1,25 U/25 μl).
Chất ổn định hoạt động enzyme (enzyme stabilizer): thƣờng là gelatin ở nồng độ 0,01 % hay Triston X – 100 ở nồng độ 0,1 % trong dung dịch buffer để tồn trữ DNA.
Nồng độ các primer: pimer F (forward primer) và primer R (reverse primer) phải có nồng độ bằng nhau và không nên dƣ thừa.
Tỉ lệ primer/DNA khuôn: Nếu tỉ lệ này quá cao, hiện tƣợng dimer – primer sẽ xuất hiện do lƣợng DNA khuôn thấp và lƣợng primer quá cao. Ngƣợc lại, sản phẩm PCR không nhiều do không đủ primer cho nhân bản.
2.5.3 Kỹ Thuật RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms)
Đây là kỹ thuật sinh học phân tử nhằm phát hiện sự khác nhau về di truyền giữa các cá thể, giữa các giống trong cùng một loài dựa vào sự khác nhau về số lƣợng và kích thƣớc của những đoạn DNA đƣợc tạo ra do sử dụng những enzyme cắt giới hạn (restriction enzymes) cắt toàn bộ bộ gene của những cá thể hay giống đƣợc nghiên cứu, sau đó những đoạn DNA đƣợc cắt ra này đƣợc lai với những đoạn dò (probe) đƣợc đánh dấu huỳnh quang đã biết, kết quả đƣợc quan sát qua màu huỳnh quang phát ra. Sử dụng đoạn dò chuyên biệt với loài hay giống cần nghiên cứu. Nguyên lý của kỹ thuật này dựa vào hiện tƣợng đột biến làm mất hay xuất hiện một vị trí cắt giới hạn, vì vậy kỹ thuật RFLP có thể phát hiện đột biến mặc dù mức độ tin cậy không cao [2], [6].
2.5.4 Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)
Kỹ thuật RAPD dựa trên kỹ thuật PCR, bằng cách sử dụng những primer ngắn (khoảng 10 nucleotide) có trình tự biết trƣớc, bắt cặp và nhân bản ngẫu nhiên những đoạn DNA có trình tự bổ sung với trình tự của các primer. Theo nguyên tắc, khi 2 cá thể hoàn toàn giống nhau, sau khi thực hiện phản ứng PCR – RAPD ở điều kiện nhƣ nhau sẽ tạo ra số lƣợng các đoạn bằng nhau và chiều dài các đoạn tƣơng ứng bằng nhau. Khi có đột biến làm xuất hiện hay mất đi một vị trí bắt cặp ngẫu nhiên sẽ tạo ra số lƣợng và chiều dài các đoạn DNA khác nhau giữa các cá thể, vì vậy kỹ thuật RAPD có thể phát hiện đột biến [2], [6].
Một trong những giới hạn của PCR chuẩn đối với ALP marker là mọi thông tin về chuỗi mã di truyền đầu tiên phải đƣợc biết rõ trƣớc khi chuẩn bị các primer
tƣơng ứng. Vì thế, việc áp dụng nó để nghiên cứu DNA genome của một giống cây trồng mới sẽ gặp nhiều khó khăn.
Vào đầu thập kỷ 90, một kỹ thuật phân tử mới dựa trên nguyên tắc PCR với tên gọi là RAPD (Random amplified polymorphic DNA) đã ra đời một cách độc lập tại hai phòng thí nghiệm khác nhau (William, 1990; Welsh và ctv., 1991).
Hình 2.4: Nguyên lý chỉ thị RAPD trong nghiên cứu sự đa dạng di truyền
Kỹ thuật này cho phép phát hiện tính đa hình các đoạn DNA đƣợc nhân bản ngẫu nhiên bằng việc dùng một primer chứa một trật tự nucleotide ngẫu nhiên. Thƣờng primer này chứa từ 9 - 12 oligonucleotit, tối thiểu là 4 bp. Có hàng ngàn loại primer chứa khoảng 10 bp nhƣng số lƣợng primer dùng trong nghiên cứu này rất hạn chế. Trong phản ứng này, các primer đơn gắn vào hai điểm khác nhau ở hai mạch đơn đối diện của DNA khuôn.
Nếu các điểm gắn primer nằm trong khoảng có thể nhân bản đƣợc (thƣờng 200 - 2000 nucleotide) thì đoạn DNA sẽ đƣợc nhân lên. Sự có mặt của sản phẩm này đƣợc quan sát thông qua điện di trên gel agarose hoặc polyacrylmide đã chứng tỏ có sự tƣơng đồng hoàn toàn hay một phần giữa DNA genome với các primer oligonucleotide. Các primer dùng trong RAPD có kích thƣớc ngắn nên dễ tìm đƣợc các đoạn tƣơng đồng trên các mạch đơn DNA trong genome. Vì thế, nó là một
thể. Ví dụ, tần số tìm thấy sự đa hình RAPD là 0,3 / 1 primer ở cây Arabidopsis thaliana là 0,5 / 1 primer ở cây đậu tƣơng, 1 / 1 primer ở ngô (Lê Duy Thành, 2000).
Các ƣu điểm chính của chỉ thị RAPD không cần biết trƣớc trình tự nuleotide của đoạn DNA cần khuếch đại, quy trình tiến hành nhanh, dễ làm, ít tốn kém, cho đa hình cao, tiến hành chỉ với một lƣợng nhỏ DNA tính bằng nanogam và trên một số lƣợng mẫu thí nghiệm lớn. Đồng thời RAPD không dùng chất phóng xạ để phát hiện đa hình. Do đó RAPD thƣờng dùng trong phân tích và xác định mối quan hệ thân thuộc giữa các thứ cây trồng hay giữa các cá thể để phục vụ công tác lai tạo hoặc phân loại.
Để nghiên cứu sự đa dạng di truyền bằng chỉ thị RAPD có thể tiến hành với các bƣớc nhƣ sau:
Tách chiết DNA tổng số, nhân DNA bằng máy PCR.
Điện di trên gel agarose hoặc gel polyacrylamid.
Xác định tính đa dạng di truyền bằng các phần mềm thông dụng (NTSYS-pc, UPGMA cluster.). Các số liệu thu đƣợc cho thấy sự gần gũi hoặc cách biệt di truyền của các mẫu nghiên cứu.
Ngoài những ứng dụng trong nghiên cứu sự đa đạng sinh học và nguồn gốc di truyền của các loài động vật, thực vật và vi sinh vật, chỉ thị RAPD cũng đƣợc sử dụng cho những mục đích sau:
Lập bản đồ liên kết, xác định những gen liên kết với một tính trạng nào đó nhƣ tính trạng chất lƣợng sợi ở cây bông, tính trạng kháng virus ở cà chua (Tatieni và ctv., 1996; Winter và ctv., 1995).
Phân tích cấu trúc di truyền của quần thể.
In dấu vân tay (DNA fingerprinting).
Phát hiện sự khác biệt trong các dòng soma (Somaclonal variation). Tuy có nhiều ứng dụng trong nghiên cứu đa dạng di truyền nhƣng chỉ thị RAPD cũng có một số hạn chế nhƣ sau:
Có tính trội (dominant) do đó khó phân biệt đƣợc những gen lặn hay cá thể dị hợp tử.
Có tính chất ngẫu nhiên nên sản phẩm PCR thƣờng không thống nhất.
Cần phải có các thiết bị điện toán để xử lý số liệu.
Độ tin cậy còn tuỳ thuộc vào kỹ thuật cá nhân.
2.5.4.1 Ƣu điểm của kỹ thuật RAPD
Về mặt kỹ thuật: Kỹ thuật RAPD dễ thực hiện và dễ thành công do không cần biết trƣớc trình tự bộ gene của đối tƣợng cần nghiên cứu.
Thao tác đơn giản.
Chất lƣợng DNA khuôn không cần độ tinh sạch cao.
Thời gian thực hiện nhanh. Khả năng nhân bản cao.
Về mặt kinh tế: Chi phí thực hiện thấp.
Kỹ thuật RAPD thƣờng đƣợc sử dụng kết hợp với những kỹ thuật cao cấp khác để đánh giá đa dạng di truyền và nhận diện chỉ thị phân tử có độ tin cậy cao [1].
2.5.4.2 Nhƣợc điểm của kỹ thuật RAPD
Kỹ thuật RAPD có độ chính xác không cao.
Không ổn định (thể hiện ở mức độ lặp lại giống nhau thấp).
Khả năng nhân bản trong phản ứng PCR cao nhƣng khả năng xuất hiện đa hình thấp và độ tin cậy không cao.
Khả năng nhận diện chỉ thị phân tử thấp và có độ tin cậy không cao.
2.5.4.3 Ứng dụng của kỹ thuật RAPD
Kỹ thuật RAPD đƣợc phát minh và sử dụng ngay sau khi kỹ thuật PCR ra đời, mặc dù cho kết quả có độ tin cậy không cao nhƣng vẫn còn đƣợc sử dụng do ƣu điểm dễ thực hiện và chi phí thấp. Những ứng dụng của kỹ thuật RAPD:
Nhận diện chỉ thị phân tử: Ở Việt Nam, nghiên cứu đa dạng di truyền và mối tƣơng quan giữa kiểu gene và kiểu hình phản ánh bệnh đạo ôn của một số giống lúa ở Việt Nam (Lã Tuấn Nghĩa và ctv., 1999).
Chƣơng 3:
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH
3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện.3.1.1 Thời gian nghiên cứu.
Đề tài đƣợc nghiên cứu từ 20/04/2007 đến 30/08/2007.
3.1.3 Địa điểm thực hiện.
Mẫu lá mắm đƣợc thu thập tại khu dự trữ rừng ngập mặn Cần Giờ.
Mẫu lá đƣợc ly trích DNA và chạy RAPD tại Viện Nghiên cứu CNSH và CNMT Trƣờng Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh.
3.2 Vật liệu thí nghiệm.
Mẫu lá mắm thu thập tại 3 tiểu khu 17, tiểu khu 18 và tiểu khu 21 ở khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ.
Nguyên tắc thu thập mẫu:
Xác định đƣợc vị trí cụ thể của cây lấy mẫu trên bản đồ thông qua hệ thống định vị toàn cầu GPS (Global Position System).
Thu thập lá của cây mắm biển (lá già, lá non, lá bánh tẻ).
Lấy theo đƣờng chéo của từng tiểu khu.
Cách 400 m lấy một mẫu, mỗi mẫu lấy 6 đến 8 lá các loại ( lá non, lá bánh tẻ và lá già ).
Chọn mẫu lá từ những cây có đặc điểm khác biệt nhƣ: thân cây to, cây mọc tốt, cây mọc yếu ớt, cây bị mối, cây có u, cây có hình dáng lá khác lạ, …
3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu
3.3.1 Vật liệu dùng trong ly trích DNA a. Thiết bị và dụng cụ a. Thiết bị và dụng cụ
Chày và cối (Đức).
Cân điện tử (Ohaus - Mỹ).
Bồn ủ nhiệt (Memmert - Anh).
Tủ lạnh 4oC và -20oC.
Máy Vortex (IKA - Đức).
Máy hút và tủ cấy vô trùng (Việt Nam /Anh).
Máy vi ly tâm lạnh (Hettich - Đức).
Nồi hấp Autoclave (ToMy - Nhật Bản).
Lò Viba (Electrolux).
Tủ sấy (Jencons - Anh).
Máy điện di (Biorad).
Máy chụp ảnh DNA (Biorad - Thụy Điển).
Đầu túyp các loại (Đức).
Pipet các loại (Nichiryo – Nhật Bản).
Máy đo hấp thu quang phổ (HP - Mỹ).
Máy PCR (BioRad – Thụy Điển).
Tủ lạnh các loại (Sanyo - Nhật Bản).
Eppendorf 1,5 ml và 0,2 ml (Pháp).
b. Hóa chất ly trích.
HÓA CHẤT CÔNG DỤNG CÁCH PHA
CTAB
(C19H42NBr, M=364,5 g/mol)
Phá vỡ màng tế bào,
màng nhân
Hòa tan trong nƣớc cất 2 lần ở 65o
C
Ethanol 100% Tủa DNA ở nồng độ muối Sodium acetate cao và nhiệt độ thấp
Ethanol 70% Rửa DNA Pha với tỷ lệ 7 thể tích
