Trong đề tài nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành thực hiện ly trích DNA tổng số trên 3 quy trình:
Quy trình 1: Quy trình ly trích mẫu tƣơi của Doyle và Doyle (1988) [9] Quy trình 2: Quy trình ly trích cải tiến [9]
Quy trình 3: Quy trình cải tiến từ quy trình 1 và quy trình 2
3.3.2.1. Quy trình 1 [9]
Mẫu lá đƣợc ly trích theo quy trình ly trích mẫu tƣơi của Doyle và Doyle, 1988:
o Bƣớc 1: cân 0,15 g lá đã rửa sạch. Cho 1,2 ml dịch trích EB (Extraction Buffer) vào eppendorf, nghiền lá với dung dịch này. Vortex thật kỹ. Ủ ở 650 C trong 45 phút.
o Bƣớc 2: thêm 500 l Chloroform: isoamyl alcohol (24: 1), khuấy bằng vortex 10 phút, li tâm 5 phút, 14.000 vòng/phút ở 100
C.
o Bƣớc 3: chuyển lấy dịch trong lặp lại bƣớc 2.
o Bƣớc 4: chuyển lấy dịch trong, thêm vào 2 l RNase, ủ ở 370
C trong 1 giờ.
o Bƣớc 5: thêm vào 250 l dung dịch isopropanol lạnh. Để tủa ở –200C khoảng 30 phút (Nên để qua đêm).
o Bƣớc 6: li tâm 5 phút 14.000 vòng/phút ở 100
C. Đổ bỏ dịch trong.
o Bƣớc 7: cho vào 300 l TE 1X, ủ ở 370C trong 1giờ.
o Bƣớc 8: thêm 20 l muối Sodium acetate 3 M, và 640 l Ethanol 100%, trộn đều và để -200C trong 30 phút.
o Bƣớc 9: li tâm 10 phút 14.000 vòng/phút ở 100
C, đổ bỏ dịch trong.
o Bƣớc 10: rửa cặn với 400 l Ethanol 70% bằng cách ly tâm 2 phút 14.000 vòng/phút ở 100C, đổ bỏ dịch trong.
o Bƣớc 11: lặp lại bƣớc 10. Để khô cặn, hoà tan cặn trong 100 l TE 1X, ủ ở 370C trong 30 phút.
o Bƣớc 12: bảo quản mẫu ở 40C.
3.3.2.2. Quy trình 2 [9]
Mẫu lá đƣợc ly trích theo quy trình ly trích mẫu tƣơi của Doyle và Doyle, 1988 đƣợc cải tiến bởi Lâm Vỹ Nguyên, 2006.
o Bƣớc 1: lấy 0,2 g lá non rửa sạch và lau khô, nghiền trong nitơ lỏng, cho vào eppendorf.
o Bƣớc 2: thêm 1,2 ml dịch trích EB, vortex kỹ ở tốc độ thấp (600-800 vòng/phút). Ủ qua đêm ở 550C.
o Bƣớc 3: ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút ở 40C. Thu dịch nổi.
o Bƣớc 4: thêm 500 l Chloroform: Isoamyl alcohol (24:1), đảo nhẹ. Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút ở 40C. Thu dịch nổi.
o Bƣớc 5: lập lại bƣớc 4. Thu đƣợc V l dịch nổi.
o Bƣớc 6: thêm 0,2 V Sodium acetate 3M và 0,6 V Isopropanol lạnh. Đảo trộn kỹ. Ủ -200C trong 90 phút.
o Bƣớc 7: ly tâm 10.000 vòng/phút trong 10 phút ở 40C. Đổ bỏ dịch trong, thu kết tủa.
o Bƣớc 8: rửa kết tủa bằng cách thêm 400 l ethanol 70% và ly tâm 10.000 vòng/phút trong 1 phút ở 40C. Đổ bỏ dịch trong.
o Bƣớc 9: rửa kết tủa bằng cách thêm 400 l ethanol 70% và ly tâm 10.000 vòng/phút trong 1 phút ở 40C. Đổ bỏ dịch trong.
o Bƣớc 10: phơi thật khô kết tủa ở nhiệt độ phòng.
o Bƣớc 11: hòa tan kết tủa trong 100 l TE 1X, ủ ở 370C đến khi kết tủa tan hoàn toàn (Có thể ủ qua đêm).
o Bƣớc 12: bảo quản mẫu ở -200C.
o Bƣớc 1: lấy 0,3 g lá non rửa sạch và lau khô, nghiền trong nitơ lỏng, cho vào eppendorf.
o Bƣớc 2: thêm 1 ml dịch trích EB, vortex đến khi hỗn hợp đồng nhất. Ủ 650
trong 1 giờ.
o Bƣớc 3: ly tâm 11.000 vòng/phút trong 15 phút ở 40C. Thu dịch nổi.
o Bƣớc 4: thêm 500 l Chloroform: Isoamyl alcohol (24:1), đảo nhẹ. Ly tâm 11.000 vòng/phút trong 15 phút ở 40C. Thu dịch nổi.
o Bƣớc 5: lập lại bƣớc 4. Thu dịch nổi.
o Bƣớc 6: thêm 250 µl Isopropanol lạnh, đảo trộn kỹ. Ủ -200C qua đêm
o Bƣớc 7: ly tâm 11.000 vòng/phút trong 15 phút ở 40C. Đổ bỏ dịch trong
o Bƣớc 8: cho vào 300 µl TE 1X, ủ 370 C trong 1 giờ.
o Bƣớc 9 : thêm 20 µl sodium acetate 3M và 640 µl Ethanol 100% trộn đều và ủ -200 C trong 1 giờ.
o Bƣớc 10 : ly tâm 11.000 vòng/phút trong 15 phút , đổ bỏ dịch trong.
o Bƣớc 11: rửa kết tủa bằng cách thêm 400 l ethanol 70% và ly tâm 12.000 vòng/phút trong 3 phút ở 40C. Đổ bỏ dịch trong.
o Bƣớc 12: lặp lại bƣớc 11. Phơi thật khô kết tủa ở nhiệt độ phòng.
o Bƣớc 13: hòa tan kết tủa trong 50 l TE 1X, ủ ở 370C trong 30 phút
o Bƣớc 14: bảo quản mẫu ở -200C.