4.4.1. Thí nghiệm 1
Sử dụng primer OPAC10 với thành phần hóa chất, chu kỳ nhiệt ở bảng 3.1 và bảng 3.2
Qua thí nghiệm 1, chúng tôi thu đƣợc kết quả thể hiện ở hình 4.6
Hình 4.6 Sản phẩm PCR với primer OPAC10 của 3 mẫu đƣớc thu thập ở khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ
Kết quả điện di cho thấy cả 3 mẫu đều có những đoạn DNA đƣợc khuếch đại nhƣng mờ. Nguyên nhân có thể do thành phần hóa chất hoặc số chu kỳ chƣa phù hợp. Do đó, chúng tôi thực hiện thí nghiệm 2 để tìm quy trình tối ƣu hơn.
4.4.2. Thí nghiệm 2
Sử dụng primer OPAC10 khảo sát nồng độ Mg2+
Qua thí nghiệm 2, chúng tôi thu đƣợc kết quả thể hiện ở hình 4.7
Chú thích: 1, 2, 3: số lần lặp lại của mỗi nghiệm thức
Kết quả điện di cho thấy chỉ có Mg2+ nồng độ 3 mM thì những đoạn DNA mẫu đƣợc khuếch đại. Mg2+nồng độ 2mM và 2,5 mM không cho kết quả trên gel điện di. Vì vậy chúng tôi quyết định chọn Mg2+
nồng độ 3 mM để tối ƣu các thành phần hóa chất khác.
4.4.3. Thí nghiệm 3
Sử dụng primer OPAC10 khảo sát nồng độ primer
Qua thí nghiệm 3, chúng tôi thu đƣợc kết quả thể hiện ở hình 4.8
Chú thích: 1, 2, 3, 4 : tƣơng ứng với các nghiệm thức. 1 2 3 1 2 3 1 2 3
Hình 4.7 Sản phẩm PCR khảo sát nồng độ Mg2+ ở thí nghiệm 2
1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4
Kết quả điện di cho thấy các đoạn DNA đƣợc khuếch đại ở tất cả các nồng độ primer. Các band DNA đƣợc khuếch đại ở các nghiệm thức 1, 2, 3 tuy cho band sáng nhƣng các band tách không rõ ràng. Điều này ảnh hƣởng việc xác định số band và kích thƣớc band dễ sai lệch trong nghiên cứu di truyền. Các đoạn DNA đƣợc khuếch đại ở nghiệm thức 4 không sáng nhƣng các band DNA đƣợc tách rất rõ ràng. Chúng tôi quyết định sử dụng nồng độ primer ở nghiệm thức 4 để thực hiện phản ứng RAPD.
4.4.4. Thí nghiệm 4
Thực hiện phản ứng RAPD thử nghiệm với primer OPA 10 và OPAC 10 với thành phần hóa chất, chu kỳ nhiệt ở bảng 3.6 và bảng 3.1.
Qua thí nghiệm 4, chúng tôi thu đƣợc kết quả thể hiện ở hình 4.9
Hình 4.9 Kết quả PCR khảo sát 2 primer OPAC10 VÀ OPA 10
Kết quả điện di cho thấy primer OPAC10 cho band DNA tốt, còn primer OPA10 không thấy band DNA khuếch đại. Do đó chúng tôi chỉ sử dụng primer OPAC10 nghiên cứu đa dạng di truyền cây đƣớc đôi khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ.
4.4.5. Thí nghiệm 5
Thực hiện phản ứng RAPD với 10 mẫu với primer OPAC10 theo thành phần hóa chất, chu kỳ nhiệt ở bảng 3.6 và bảng 3.1.
Qua thí nghiệm 5, chúng tôi thu đƣợc kết quả thể hiện ở hình 4.10
Chúng tôi thực hiện phản ứng RAPD với primer OPAC10 trên 10 mẫu kết quả thu đƣợc 5 band đa hình chiếm tỷ lệ 83,3% và 1 band đồng hình chiếm tỷ lệ 16,7% (kích thƣớc khoảng 170 bp), kích cỡ của các band khoảng từ 100 bp – 600 bp (hình 4.10). Band đồng hình có mặt trong tất cả các mẫu còn band đa hình có ở mẫu này nhƣng không có ở mẫu kia. Các band đa hình là cơ sở phân biệt giữa các mẫu có tính trạng khác nhau từ đó làm nền tảng để phân chia và xác định giống.
Tuy lƣợng mẫu nghiên cứu không lớn nhƣng trong tất cả các mẫu nghiên cứu, band đồng hình 170 bp luôn xuất hiện. Band này có thể là band đặc biệt dùng để phân biệt loài đƣớc (Rhizophora apiculata Blume) với các loài khác thuộc họ Rhizophorceae. Do đó nên tách band này để giải trình tự nhằm phục vụ cho công tác phân biệt và chọn giống.
A1 A4 A8 A12 A16 B1 L B4 B8 B12 B16
Hình 4.10 Kết quả PCR với pimer OPAC10 của 10 mẫu đƣớc thu thập ở khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ
Coefficient 0.46 0.60 0.73 0.87 1.00 A12 A1 A4 B4 A8 A12 A16 B1 B16 B12 B8 ( I ) ( II )
Hình 4.11 Cây phân nhóm di truyền của 10 mẫu đƣớc đôi thu thập ở khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ.
1991 1996 1978 1980 Nguồn Giống Cà Mau Nguồn Giống tại chỗ
Từ kết quả thu đƣợc trên gel điện di chúng tôi mã hóa thành dạng nhị phân 0 và 1 để phân tích mối tƣơng quan di truyền giữa các mẫu nghiên cứu bằng phần mềm NTSYS phiên bản 2.1 cho kết quả nhƣ sau:
Mƣời mẫu đƣớc đƣợc chia thành 2 nhóm. Nhóm I chủ yếu là những mẫu đƣớc có nguồn giống từ Cà Mau (Trừ B12) bao gồm các mẫu: A1, A4, A8,A12,B1, B4, B16, B12. Nhóm II chỉ có 1 mẫu đƣớc có nguồn giống tại chỗ là B8.
Các mẫu đƣớc trồng cùng năm 1978 (A1, A4, B4, A8), có hệ số đồng dạng di truyền cao từ 0,83 – 1,00. Các mẫu A1, A4, B4 có độ tƣơng đồng di truyền là nhƣ nhau. Mẫu A8 có khác biệt di truyền so với các mẫu A1, A4, B4
Các mẫu đƣớc trồng cùng năm 1980 (A12, A16, B1, B16) có hệ số đồng dạng di truyền cao từ 0,83 – đến 1,00. Mẫu B16 có khác biệt di truyền so với A12, A16, B1 nhƣng mức độ tƣơng đồng di truyền là khá cao. Điều này là hợp lý vì nguồn cây con để tái tạo rừng ngập mặn Cần Giờ từ năm 1978 đến 1983 đều lấy từ rừng ngập mặn Cà Mau.
Những cây đƣớc đôi trồng năm 1978 và năm 1980 có mức độ di truyền biến thiên trong khoảng 0,50 – 0,83. Sự khác biệt di truyền này có thể do vị trí, sự lai tạo và thụ phấn chéo giữa các cây đƣớc đôi ở Cà Mau.
Các mẫu đƣớc nguồn gốc tại chỗ đƣợc trồng năm 1991 (B12) và trồng năm 1996 (B8) có hệ số đồng dạng di truyền là 0,50. Những cây đƣớc đôi trồng từ nguồn giống tại chỗ (B12, B8) và trồng từ nguồn giống từ Năm Căn (Cà Mau) có hệ số đồng dạng di truyền khá thấp từ 0,33 đến 0,67. Đây là kết quả của quá trình lai tạo và thụ phấn chéo giữa các cây đƣớc đôi. Càng về sau thì hệ số đồng dạng di truyền giữa các cây đƣớc đôi sẽ giảm. Qua phân nhóm di truyền chúng ta có thể sử dụng các cây đƣớc đôi nhóm I lai tạo với các cây đƣớc đôi nhóm II sẽ tạo ra quần thể đa dạng về nguồn gen bởi vì các cây đƣớc có khoảng cách di truyền xa nhau thì khả năng tạo ra con lai có nhiều tính trạng càng cao.
( II )
Hầu hết quần thể đƣớc đôi ở khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ đƣợc trồng từ năm 1978 đến năm 1983 và nguồn giống trồng rừng là trái đƣớc đƣợc thu mua ở Cà Mau (Hệ số đồng dạng di truyền từ 0,5 đến 1,00). Cần gia tăng tính đa dạng di truyền của quần thể đƣớc đôi ở khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ bằng cách: trồng xen các cây có bố mẹ đƣợc trồng năm 1996 hoặc những cây đƣớc đƣợc lai tạo từ nhóm I và nhóm II vào những khu rừng đƣớc có nguồn gốc từ Cà Mau. Bên cạnh đó, chúng ta có thể tạo các cây đƣớc lai giữa các loài đƣớc (Rhizophora apiculata, Rhizophora mucronata, Rhizophora stylosa) để nâng cao tính đa dạng di truyền của quần thể đƣớc. Song song việc gia tăng tính đa dạng di truyền chúng ta cần có chiến lƣợc bảo tồn và phát triển nguồn gen của quần thể đƣớc đôi ở khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ. Chúng ta phải luôn chăm sóc rừng đƣớc phù hợp với cấp tuổi, cấp đất bằng những giải pháp kỹ thuật lâm sinh và quản lý thích hợp, cụ thể cho từng tiểu khu. Mặt khác từng bƣớc tiến hành trồng xen những cây đƣớc lai vào các khu rừng đƣớc trồng thuần để sau 10 đến 15 năm tới sẽ tạo đƣợc sự đa dạng sinh học cần thiết để xây dựng hệ sinh thái bền vững.
Chƣơng 5
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
5.1. Kết luận
Từ các kết quả thu đƣợc, chúng tôi rút ra một số kết luận nhƣ sau:
Mẫu lá đƣớc có thể bảo quản lâu trong điều kiện -200C. Tuy nhiên để ly trích cho kết quả tốt thì sau cân mẫu phải nhanh chóng cho vào nitơ lỏng. Sử dụng lá đƣớc non để ly trích sẽ thu đƣợc lƣợng DNA mẫu tốt nhất. Quy trình ly trích DNA của lá đƣớc rất ổn định. Tỷ lệ mẫu tinh sạch đạt đến 65% trên tổng số mẫu ly trích.
Primer OPAC10 có tính đa hình đối với quần thể đƣớc đôi (Rhizophora apiculata Blume) tại khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ. Với việc phân tích RAPD sử dụng primer OPAC10 thì quần thể đƣớc tại khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ có hệ số đồng dạng di truyền trên cây phát sinh chủng loại dao động trong khoảng 0,33 – 1,00
5.2. Đề nghị
Tiếp tục sử dụng primer OPAC10 để đánh giá tính đa dạng di truyền với một lƣợng mẫu lớn hơn đối với quần thể đƣớc.
Khảo sát thêm các primer khác nhằm có đƣợc kết quả đa dạng di truyền chính xác nhất.
Tách riêng band 170 bp khi thực hiện phản ứng RAPD với primer OPAC10 để giải trình tự nhằm phục vụ cho việc phân biệt giữa loài đƣớc (Rhizophora apiculata Blume) với các loài khác thuộc họ Rhizophorceae trong rừng ngập mặn.
Phải có chính sách làm giàu nguồn tài nguyên di truyền, nâng cao tính đa dạng và bảo đảm sự phát triển bền vững của khu dự trữ sinh quyển rừng
ngập mặn Cần Giờ nói chung và của quần thể đƣớc đôi (Rhizophora apiculata Blume) nói riêng.
Nghiên cứu thêm về những cây đƣớc đôi có hình thái khác lạ trong khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ. Tại khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ còn có một loài có tên địa phƣơng là đƣớc râu với những đặc điểm hình thái rất khác so với giống đƣớc (Rhizophora apiculata Blume). Do vị trí phân bố của đƣớc râu khá xa (Thuộc tiểu khu 14) nên chúng tôi chƣa có điều kiện lấy mẫu nghiên cứu. Hiện nay vẫn chƣa xác định đƣợc tên khoa học chính xác của loài này. Vì vậy chúng tôi đề nghị nghiên cứu trên cây đƣớc râu để có khả năng phát hiện ra đƣợc một loài mới tại Việt Nam.
Do đó chúng ta nên trồng xen các cây có nguồn giống tại chỗ vào khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ sẽ tạo đƣợc sự đa dạng sinh học cần thiết để xây dựng hệ sinh thái bền vững.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
1. Phạm Văn Bình, 2005. Đánh giá sơ bộ mức độ đa dạng di truyền của quần thể điều (Acanardium occidentale L.) hiện được trồng tại tỉnh Ninh Thuận bằng kỹ thuật RAPD và AFLP. Khóa luận tốt nghiệp kỹ sƣ công nghệ sinh học, Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. Việt Nam.
2. Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999. Di truyền phân tử. Nhà xuất bản nông nghiệp.
3. Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, 2002. Sinh học phân tử. Nhà xuất bản giáo dục. Trang 24-30; 122-124.
4. Phạm Thành Hổ, 1998. Di truyền học. Nhà xuất bản giáo dục TP Hồ Chí Minh. 612 trang.
5. Lê Văn Khôi và ctv, 2006. Khôi phục và phá triển hệ sinh thái rừng ngập mặn Cần Giờ Thành Phố Hồ Chí Minh. Nhà xuất bản nông nghiệp.
6. Nguyễn Thị Lang, 2002. Phương pháp cơ bản trong nghiên cứu công nghệ sinh học. Nhà xuất bản nông nghiệp.
7. Nguyễn Thị Lang và Bùi Chí Bửu, 2005. Sinh học phân tử giới thiệu phương pháp và ứng dụng. Nhà xuất bản nông nghiệp.
8. Lê Đình Lƣơng, 2001. Nguyên lý kỹ thuật di truyền. Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật.
9. Lâm Vỹ Nguyên, 2006. Nghiên cứu đa dạng di truyền của cây đƣớc đôi
Rhizophora apiculata Blume. ở Khu Dự trữ Sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ bằng kỹ thuật RAPD. Khóa luận tốt nghiệp kỹ sƣ công nghệ sinh học, Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. Việt Nam.
10.Lê Duy Thành, 2001. Cơ sở di truyền chọn giống thực vật. Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật Hà Nội. 159 trang.
11.Nguyễn Đức Thành, 2004. Một số kỹ thuật chỉ thị phân tử. Nhà xuất bản Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam – Viện Công nghệ Sinh học Hà Nội.
TÀI LIỆU TIẾNG NƢỚC NGOÀI
12. Akira Komiyama, 1998. Mortality and growth of cut pieces of viviparous mangrove (Rhizophora apiculata and R. mucronata) seedlings in the field condition. Forest Ecology and Management, 112 (1998) p 227 – 231.
13. Bo Christensen, 1978. Biomass and primary production of Rhizophora apiculata Bl. In a mangrove in Southern Thailand. Aquatic Botany, 4 (1978) p. 43 – 52.
14. Madasamy Parani, 1997. Molecular Phylogeny of mangroves III Parentage analysis of a Rhizophora hybrid using Random Amplified Polymorphic DNA and Restriction Fragment Length Polymorphism markers. Aquatic Botany 58 (1997) p 165-172.
15. Mukkamala Lakshmi, 2002. Molecular phylogeny of mangroves IX Molecular marker assisted intra-specific variation and species relationships in the Indian mangrove tribe Rhizophoreae. Aquatic Botany, 74 (2002) p. 201 – 217.
16. F James rohlf, 2000. NTSYSpc: Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System. Department of Ecology and Evolution State University of New york.
Website:
17.http://.avery.rutgers.edu/wssp/studentscholars/project/archives/onions/rapd.html 18.http://www.nea.gov.vn/html/ddsh/dulieu1/khainiem/khai_niem_da_dang_ditruyen. htm
PHỤ LỤC
Phụ lục 1 Công dụng và cách pha hóa chất trong ly trích DNA
HÓA CHẤT CÔNG DỤNG CÁCH PHA
CTAB (C19H42NBr, M=364,5 g/mol)
Phá vỡ màng tế bào, màng nhân
Hòa tan trong nƣớc cất 2 lần ở 65oC
Ethanol 100% Tủa DNA ở nồng độ muối Sodium acetate cao và nhiệt độ thấp
Dung dịch gốc
Ethanol 70% Rửa DNA Pha với tỷ lệ 7 thể tích ethanol 100% và 3 thể tích nƣớc cất 2 lần đã hấp tiệt trùng
Iso Propanol Tủa DNA ở nhiệt độ thấp, không cần muối Sodium Acetate
Dung dịch gốc
Chloroform Biến tính protein và các sắc tố có trong mẫu. Tách lớp sau khi ly tâm
Dung dịch gốc
Iso Amylalcohol Tránh tạo bọt trong quá trình vortex hay ly tâm tốc độ cao Dung dịch gốc Hỗn hợp Chloroform:Isoamyl Alcohol (24:1) Biến tính protein và các sắc tố trong mẫu. Tách lớp sau khi ly tâm, DNA đƣợc phóng thích sẽ nằm trong pha nƣớc ở lớp trên Pha với tỷ lệ 24 thể tích Chloroform và 1 thể tích Isoamyl Alcohol
EDTA 0,5M (C10H14N2Na2O3, M=372,54 g/mol)
Gắn nối các ion hóa trị II (Mg++, Ca++…) có trong dịch ly trích, ngăn chặn sự hoạt động của các enzyme phân hủy DNA. Các enzyme này hoạt động rất mạnh nếu có sự có mặt của các ion hóa trị II nhất là ion Mg++ Pha 100ml: - 18,622 g bột EDTA + 80ml nƣớc cất 2 lần. Khuấy tan. - Chỉnh pH đạt 8, thêm nƣớc cất 2 lần cho đủ 100ml. Tris-HCl 1M (C4H12ClNO3, M=157,6 g/mol) Dung dịch đệm, đảm bảo môi trƣờng ly trích ổn định ở pH8. Ở độ pH này DNA ổn định nhất Pha 100ml: - 15,7 g bột Tris-HCl + 80ml nƣớc cất 2 lần. Khuấy tan. - Chỉnh pH đạt 8, thêm nƣớc cất 2 lần cho đủ 100ml.
NaCl 5M (M=58,5 g/mol) Môi trƣờng đệm thuận lợi cho việc kết tủa DNA
Pha 100ml:
- 29,25 g NaCl + 100ml nƣớc cất 2 lần. Khuấy tan.
TE 10X Dung dịch Stock Pha 100ml:
- 10ml Tris-HCl 1M + 2ml EDTA 0,5M + 88ml nƣớc cất 2 lần.
TE 1X Hòa tan DNA Pha 100ml: 10ml TE 10X + 90ml nƣớc cất 2 lần
- 57ml nƣớc cất 2 lần + 2g CTAB (lắc nhẹ trong bồn ủ 65oC cho tan, hạn chế tạo bọt).
- Thêm vào 28ml NaCl 5M + 10ml Tris-HCl 1M + 4ml EDTA 0,5M + 1ml Mercaptro Ethanol. - Bọc giấy bạc, trữ ở 4o C, tránh ánh sáng trực tiếp. Sodium Acetate 3M (CH3COONa, M=82 g/mol) Dung dịch đệm, làm tăng lực ion trong dịch trích, tạo điều kiện thuận lợi cho DNA kết tủa với ethanol 100% trong điều kiện -20o C Pha 100ml: - 24,6g bột Sodium Acetate + 100ml nƣớc cất 2 lần. Khuấy tan. RNase (Ribonuclease) (10%, w/v)
Enzyme thủy phân RNA có trong dịch trích Pha 1ml: - 10mg bột RNase + 1ml nƣớc cất 2 lần. - Bọc giấy bạc, trữ ở 4o C, tránh ánh sáng trực tiếp.
Mercaptro Ethanol Bảo vệ DNA Dung dịch gốc
Phụ lục 2 Kết quả ly trích DNA từ cây đƣớc đôi theo quy trình 3
Phụ lục 3 Bảng mã hóa số liệu kết quả phản ứng RAPD ở thí nghiệm 5