3.3.1. Bố trí thí nghiệm
Giai đoạn 1:
Tách chiết và tinh sạch DNA từ các mẫu đƣớc đôi thu đƣợc. Định tính DNA bằng phƣơng pháp điện di.
Định lƣợng DNA bằng quang phổ kế.
Giai đoạn 2: tối ƣu hóa kỹ thuật RAPD với các mẫu DNA thu đƣợc. Khảo sát nồng độ Mg2+
Khảo sát nồng độ primer
Giai đoạn 3: thực hiện phản ứng RAPD với các mẫu đƣớc thu đƣợc
Giai đoạn 4: phƣơng pháp đánh giá đa dạng di truyền bằng phần mềm NTSYSpc.
Trong đề tài nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành thực hiện ly trích DNA tổng số trên 3 quy trình:
Quy trình 1: Quy trình ly trích mẫu tƣơi của Doyle và Doyle (1988) [9] Quy trình 2: Quy trình ly trích cải tiến [9]
Quy trình 3: Quy trình cải tiến từ quy trình 1 và quy trình 2
3.3.2.1. Quy trình 1 [9]
Mẫu lá đƣợc ly trích theo quy trình ly trích mẫu tƣơi của Doyle và Doyle, 1988:
o Bƣớc 1: cân 0,15 g lá đã rửa sạch. Cho 1,2 ml dịch trích EB (Extraction Buffer) vào eppendorf, nghiền lá với dung dịch này. Vortex thật kỹ. Ủ ở 650 C trong 45 phút.
o Bƣớc 2: thêm 500 l Chloroform: isoamyl alcohol (24: 1), khuấy bằng vortex 10 phút, li tâm 5 phút, 14.000 vòng/phút ở 100
C.
o Bƣớc 3: chuyển lấy dịch trong lặp lại bƣớc 2.
o Bƣớc 4: chuyển lấy dịch trong, thêm vào 2 l RNase, ủ ở 370
C trong 1 giờ.
o Bƣớc 5: thêm vào 250 l dung dịch isopropanol lạnh. Để tủa ở –200C khoảng 30 phút (Nên để qua đêm).
o Bƣớc 6: li tâm 5 phút 14.000 vòng/phút ở 100
C. Đổ bỏ dịch trong.
o Bƣớc 7: cho vào 300 l TE 1X, ủ ở 370C trong 1giờ.
o Bƣớc 8: thêm 20 l muối Sodium acetate 3 M, và 640 l Ethanol 100%, trộn đều và để -200C trong 30 phút.
o Bƣớc 9: li tâm 10 phút 14.000 vòng/phút ở 100
C, đổ bỏ dịch trong.
o Bƣớc 10: rửa cặn với 400 l Ethanol 70% bằng cách ly tâm 2 phút 14.000 vòng/phút ở 100C, đổ bỏ dịch trong.
o Bƣớc 11: lặp lại bƣớc 10. Để khô cặn, hoà tan cặn trong 100 l TE 1X, ủ ở 370C trong 30 phút.
o Bƣớc 12: bảo quản mẫu ở 40C.
3.3.2.2. Quy trình 2 [9]
Mẫu lá đƣợc ly trích theo quy trình ly trích mẫu tƣơi của Doyle và Doyle, 1988 đƣợc cải tiến bởi Lâm Vỹ Nguyên, 2006.
o Bƣớc 1: lấy 0,2 g lá non rửa sạch và lau khô, nghiền trong nitơ lỏng, cho vào eppendorf.
o Bƣớc 2: thêm 1,2 ml dịch trích EB, vortex kỹ ở tốc độ thấp (600-800 vòng/phút). Ủ qua đêm ở 550C.
o Bƣớc 3: ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút ở 40C. Thu dịch nổi.
o Bƣớc 4: thêm 500 l Chloroform: Isoamyl alcohol (24:1), đảo nhẹ. Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút ở 40C. Thu dịch nổi.
o Bƣớc 5: lập lại bƣớc 4. Thu đƣợc V l dịch nổi.
o Bƣớc 6: thêm 0,2 V Sodium acetate 3M và 0,6 V Isopropanol lạnh. Đảo trộn kỹ. Ủ -200C trong 90 phút.
o Bƣớc 7: ly tâm 10.000 vòng/phút trong 10 phút ở 40C. Đổ bỏ dịch trong, thu kết tủa.
o Bƣớc 8: rửa kết tủa bằng cách thêm 400 l ethanol 70% và ly tâm 10.000 vòng/phút trong 1 phút ở 40C. Đổ bỏ dịch trong.
o Bƣớc 9: rửa kết tủa bằng cách thêm 400 l ethanol 70% và ly tâm 10.000 vòng/phút trong 1 phút ở 40C. Đổ bỏ dịch trong.
o Bƣớc 10: phơi thật khô kết tủa ở nhiệt độ phòng.
o Bƣớc 11: hòa tan kết tủa trong 100 l TE 1X, ủ ở 370C đến khi kết tủa tan hoàn toàn (Có thể ủ qua đêm).
o Bƣớc 12: bảo quản mẫu ở -200C.
o Bƣớc 1: lấy 0,3 g lá non rửa sạch và lau khô, nghiền trong nitơ lỏng, cho vào eppendorf.
o Bƣớc 2: thêm 1 ml dịch trích EB, vortex đến khi hỗn hợp đồng nhất. Ủ 650
trong 1 giờ.
o Bƣớc 3: ly tâm 11.000 vòng/phút trong 15 phút ở 40C. Thu dịch nổi.
o Bƣớc 4: thêm 500 l Chloroform: Isoamyl alcohol (24:1), đảo nhẹ. Ly tâm 11.000 vòng/phút trong 15 phút ở 40C. Thu dịch nổi.
o Bƣớc 5: lập lại bƣớc 4. Thu dịch nổi.
o Bƣớc 6: thêm 250 µl Isopropanol lạnh, đảo trộn kỹ. Ủ -200C qua đêm
o Bƣớc 7: ly tâm 11.000 vòng/phút trong 15 phút ở 40C. Đổ bỏ dịch trong
o Bƣớc 8: cho vào 300 µl TE 1X, ủ 370 C trong 1 giờ.
o Bƣớc 9 : thêm 20 µl sodium acetate 3M và 640 µl Ethanol 100% trộn đều và ủ -200 C trong 1 giờ.
o Bƣớc 10 : ly tâm 11.000 vòng/phút trong 15 phút , đổ bỏ dịch trong.
o Bƣớc 11: rửa kết tủa bằng cách thêm 400 l ethanol 70% và ly tâm 12.000 vòng/phút trong 3 phút ở 40C. Đổ bỏ dịch trong.
o Bƣớc 12: lặp lại bƣớc 11. Phơi thật khô kết tủa ở nhiệt độ phòng.
o Bƣớc 13: hòa tan kết tủa trong 50 l TE 1X, ủ ở 370C trong 30 phút
o Bƣớc 14: bảo quản mẫu ở -200C.
3.3.3. Kiểm tra kết quả ly trích
3.3.3.1. Định tính DNA bằng phƣơng pháp điện di
DNA sau khi đƣợc ly trích sẽ đƣợc định tính bằng phƣơng pháp điện di trên gel agarose 1%. Dƣới tác dụng của điện trƣờng, do tích điện âm (Do tính chất của nhóm phosphate) nên DNA di chuyển từ cực âm sang cực dƣơng. Khi DNA di chuyển qua các lỗ của agarose, sự cọ xát giữa hạt agarose và phân tử DNA tạo ra lực kháng làm ngăn cản sự chuyển dịch của DNA. DNA có phân tử càng lớn thì lực
cản càng mạnh, do đó DNA có phân tử càng nhỏ di chuyển càng nhanh. Nhờ vậy ta có thể phân loại đƣợc các đoạn DNA trên gel agarose. [8]
Sau khi chạy điện di, ngâm gel trong hỗn hợp Ethidium Bromide 0,5 g/ml và TAE 0,5X trong 15 phút. Gel sau khi nhuộm đƣợc rửa nhẹ dƣới vòi nƣớc sạch và đƣa vào máy chụp ảnh DNA để quan sát.
Dƣới tia UV, Ethidium Bromide liên kết với sợi đôi DNA sẽ phát quang và tạo thành các band trên gel.
Cách tiến hành:
Pha gel agarose với nồng độ 1%: cân 0,125 g agarose cho vào 12,5 ml dung dịch TAE 0,5X. Đun sôi bằng lò Viba dƣới bƣớc sóng 650W trong 2 phút. Đổ gel, chờ 30 phút để agarose đông.
Load mẫu vào các giếng với tỷ lệ 2 μl loading dye và 4 μl DNA mẫu. Chạy điện di ở điều kiện 100 V, 400 mA, thời gian 20 phút.
Nhuộm gel bằng dung dịch ethidium bromide 100 mg/ml trong 20 phút, sau đó đƣa vào máy Geldoc đọc kết quả.
Gel sau khi nhuộm sẽ đƣợc chụp bằng tia tử ngoại UV. Nếu mẫu có DNA thì băng DNA sẽ phát sáng dƣới dạng vạch trên gel điện di. Độ tập trung và độ đậm nhạt của băng điện di thể hiện nồng độ cao hay thấp của mẫu DNA.
3.3.3.2. Định lƣợng DNA bằng quang phổ kế
Các mẫu DNA li trích sau khi đã định tính đƣợc kiểm tra độ tinh sạch và ƣớc lƣợng hàm lƣợng DNA bằng cách đo mật độ quang OD (optical density) với bƣớc sóng 260 nm và 280 nm bằng máy quang phổ kế với độ pha loãng 100 lần. Giá trị mật độ quang ở bƣớc sóng 260 nm (OD260) của các mẫu DNA cho phép xác định nồng độ DNA trong dung dịch. Đồng thời để kiểm tra độ tinh sạch của dung dịch
DNA thƣờng đo giá trị OD280. Khi giá trị OD260/OD280 = 1.8 – 2.2 thì dịch trích DNA đƣợc coi là tinh sạch. [10]
Hàm lƣợng DNA đƣợc tính theo công thức:
DNA (ng/ l) = [(62.9 * OD260 nm) – (36 * OD280 nm)] * Độ pha loãng
Cách tiến hành :
Xây dựng đƣờng chuẩn: Dùng dung dịch TE 1X để tạo đƣờng chuẩn.
Pha loãng dung dịch DNA đến nồng độ thích hợp để đo (thƣờng pha loãng 100 lần) với dung dịch TE 1X: hút 5 l dung dịch DNA hòa tan với 495 µl TE 1X. Cho vào Curvette để tiến hành đo OD.
Sản phẩm DNA tổng số sau khi tách chiết đƣợc định tính bằng phƣơng pháp điện di và đƣợc định lƣợng bằng phƣơng pháp quang phổ kế. Từ đó ta sẽ chọn ra quy trình ly trích DNA tổng số tốt nhất dựa trên độ sáng, độ rõ, không bị gãy của các băng DNA và không bị nhiễm protein.
3.3.4. Kỹ thuật RAPD 3.3.4.1. Primer
Sử dụng 2 primer: primer OPA 10 và primer 0PAC10 để chạy RAPD Trình tự của primer OPA 10: 5’ AGTGAACGCC 3’ và Tm = 30,70C Trình tự của primer OPAC 10: 5’AGCAGCGAGG 3’ và Tm = 340C
3.3.4.2. Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm 1 Sử dụng OPAC10 khảo sát quy trình RAPD
Mục đích thí nghiệm: khảo sát quy trình RAPD
Phƣơng pháp tiến hành: chọn 3 mẫu DNA chất lƣợng tốt thực hiện phản ứng RAPD với mồi OPAC10 theo bảng 3.1 và bảng 3.2.
Chỉ tiêu đánh giá: độ sáng, độ rõ của các band DNA đƣợc khuếch đại trên gel điện di.
(Đƣợc trích từ Nguyễn Thị Lang, 2002)
Bảng 3.2 Thành phần hóa chất sử dụng trong phản ứng RAPD
Hóa chất Nồng độ đầu Thể tích sử
dụng Nồng độ cuối
PCR buffer 10X 2,5 l 1X
MgCl2 25 mM 3 l 3 mM
dNTP 25 mM 0,2 l 0,2 M
Primer 100 pmol/ l 0,3 l 1,2 pmol/ l
Taq DNA polymerase 5 U 0,2 l 1 U DNA mẫu 50 ng/ l 1 l 50 ng H2O 17,8 l Tổng thể tích phản ứng 25 l
(Nguồn: Lê Hồng Phong, 2007)
Thí nghiệm 2:Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ Mg2+ đến phản ứng RAPD. Mục đích thí nghiệm: tối ƣu quy trình RAPD
Số chu kỳ Nhiệt độ (0 C) Thời gian 1 94 5 phút 45 94 30 giây 36 30 giây 72 1 phút 1 72 5 phút Giữ 40 C
Thiết kế thí nghiệm: thí nghiệm đƣợc bố trí gồm 3 nghiệm thức. Mỗi nghiệm thức đƣợc lặp lại 3 lần. Mỗi nghiệm thức gồm 1 mẫu DNA.
Phƣơng pháp tiến hành: tiến hành chọn 3 mẫu DNA có chất lƣợng tốt và primer OPAC10 để khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ Mg2+ đến sản phẩm RAPD
Chỉ tiêu đánh giá: độ sáng, độ rõ của các band DNA đƣợc khuếch đại trên gel điện di.
Bảng 3.3 Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ Mg2+
đến sản phẩm RAPD Nghiệm thức 1 Nghiệm thức 2 Nghiệm thức 3 Nồng độ Mg2+
3mM 2,5 mM 2mM
Thí nghiệm 3:Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ primer lên phản ứng RAPD Mục đích thí nghiệm: tối ƣu hóa quy trình RAPD
Thiết kế thí nghiệm: thí nghiệm đƣợc bố trí gồm 4 nghiệm thức. Mỗi nghiệm thức đƣợc lặp lại 3 lần. Mỗi nghiệm thức gồm 1 mẫu DNA.
Phƣơng pháp tiến hành: tiến hành chọn 3 mẫu DNA có chất lƣợng tốt và primer OPAC10 để khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ primer đến sản phẩm RAPD.
Bảng 3.4 Thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ primer đến sản phẩm PCR với primer OPAC10
Nghiệm thức 1 Nghiệm thức 2 Nghiệm thức 3 Nghiệm thức 4
Nồng độ
primer 1,2 pmol/ l 1 pmol/ l 0,8 pmol/ l 0,6 pmol/ l
Chỉ tiêu đánh giá: độ sáng, độ rõ của các band DNA đƣợc khuếch đại trên gel điện di.
Thí nghiệm 4: Thực hiện phản ứng RAPD thử nghiệm với primer OPA10 và
OPAC10.
Mục đích thí nghiệm: thử nghiệm primer OPA 10, OPAC10 theo quy trình RAPD tối ƣu.
Thiết kế thí nghiệm: thí nghiệm đƣợc bố trí gồm 2 nghiệm thức. Mỗi nghiệm thức đƣợc lặp lại 2 lần với 1 mẫu DNA.
Phƣơng pháp tiến hành: chọn 1 mẫu DNA và 2 primer OPAC10, OPA 10 để tiến hành thí nghiệm.
Bảng 3.5 Thực hiện phản ứng RAPD thử nghiệm với primer OPA10 và OPAC10
Chỉ tiêu đánh giá: độ sáng, độ rõ của các band DNA đƣợc khuếch đại trên gel điện di.
Thí nghiệm 5: Thực hiện phản ứng RAPD với 10 mẫu theo thành phần hóa chất (Bảng 3.6) và chu kỳ nhiệt (Bảng 3.1)
Bảng 3.6 Thành phần hóa chất sử dụng trong phản ứng RAPD
Hóa chất Nồng độ đầu Thể tích sử dụng Nồng độ cuối
PCR buffer 10X 2,5 l 1X
Nghiệm thức 1 Nghiệm thức 2
MgCl2 25 mM 3 l 3 mM
dNTP 25 mM 0,2 l 0,2 M
Primer 100 pmol/ l 0,15 l 0,6 pmol/ l
Taq DNA polymerase 5 U 0,2 l 1 U
DNA mẫu 50 ng/ l 1 l 50 ng/ l
H2O 17,95 l
Tổng thể tích phản ứng 25 l
Một số lƣu ý khi thực hiện phản ứng RAPD:
Trong thành phần của phản ứng, Taq polymerase đƣợc sử dụng với thể tích rất nhỏ (0,1 - 0,2 l) và không có pipet nào có thể hút chính xác một thể tích nhỏ nhƣ vậy. Vì vậy, để đảm bảo độ chính xác của thí nghiệm, thông thƣờng ngƣời ta trộn (mix) một lần nhiều phản ứng, sau đó đem chia ra các ống và cho DNA mẫu vào sau cùng.
Các thao tác trộn phải đƣợc thực hiện trong tủ cấy vô trùng nhằm tránh sự tạp nhiễm. Trong quá trình trộn hóa chất và DNA mẫu phải đƣợc giữ lạnh để tránh hƣ hỏng.
Các thao tác trộn mẫu phải tiến hành nhẹ nhàng, tránh tạo bọt trong quá trình trộn.
Taq polymerase phải đƣợc bỏ vào sau cùng. Các thao tác tiếp theo phải tiến hành nhanh chóng vì Taq polymerase sẽ hoạt động ngay.
3.3.5. Phƣơng pháp đánh giá mối quan hệ di truyền bằng phần mềm NTSYS
Từ kết quả phản ứng RAPD, tiến hành xác định mức độ đa hình của các mẫu đƣớc từ mẫu thu đƣợc bằng cách so sánh các phân đoạn DNA. Các phân đoạn đƣợc ghi nhận dựa trên sự có mặt hay không có mặt của chúng trên ảnh điện di. Nếu xuất hiện phân đoạn DNA thì kí hiệu là 1, không thì kí hiệu là 0. Các số liệu thu đƣợc sẽ đƣợc sử lý và phân tích trong chƣơng trình NTSYS Version 2.1 (Numercial Taxonomy System) để tìm ra mối tƣơng quan giữa các đối tƣợng nghiên cứu thông qua hệ số tƣơng đồng di truyền và biểu đồ hình cây. [16]
Số liệu này sẽ đƣợc sử dụng để xây dựng ma trận tƣơng đồng (Similarity matrix) hoặc ma trận khoảng cách (Distance matrix). Các ma trận này biểu hiện cho mối quan hệ xa gần về mặt di truyền giữa các mẫu phân tích và đƣợc xây dựng trên công thức toán học của Nei và Li (1979).
Sxy = 2 xy / x + y Xy: số băng giữa hai mẫu.
X: số băng của mẫu x. Y: Số băng của mẫu y.
Sxy: Hệ số tƣơng đồng giữa 2 mẫu x và y.
Từ Sxy ta tính đƣợc khoảng cách di truyền giữa x và y Dxy = 1 - Sxy
Từ kết quả phân nhóm dựa trên kiểu gen và nhận xét mối tƣơng quan dựa trên các đặc điểm hình thái, rút ra kết luận về sự đa dạng di truyền ở khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ.
Chƣơng 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Kết quả thu thập mẫu đƣớc tại khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ
Chúng tôi đã tiến hành thu thập đƣợc 40 mẫu lá đƣớc gồm nhiều năm tuổi khác nhau với những đặc điểm hình thái nhƣ: cây mọc bình thƣờng, cây ốm yếu, cây to khỏe, cây bị mối mọt ăn, cây có hai màu trái xanh và đỏ (Xem phụ lục 5).
Tổng số mẫu thu thập đƣợc là rất ít so với tổng diện tích hơn 75.000 ha của khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ nhƣng cũng đã đại diện đƣợc phần nào quần thể đƣớc tại đây.
4.2. Bảo quản mẫu
Mẫu lá già không thể bảo quản lâu dài ngay cả trong điều kiện -200C. Mẫu lá đƣợc bảo quản trong tủ lạnh -200C sẽ nhanh chóng bị hƣ hỏng (hóa nâu, dập) ngay khi vừa lấy ra khỏi tủ lạnh. Khoảng thời gian mẫu bị hƣ hỏng chỉ trong hơn 10 giây,
không kịp để nghiền mẫu trong dịch trích. Điều này là do khi trữ ở -200C, các tinh thể nƣớc có kích thƣớc lớn đã đƣợc tạo thành và phá vỡ vách cellulose của tế bào lá đƣớc. Ở điều kiện nhiệt độ phòng, các tinh thể nƣớc tan ra làm cho hợp chất phenol có trong tế bào lá đƣớc đƣợc phóng thích ra ngoài và làm hóa nâu mẫu lá. Những mẫu bị hóa nâu, dập nát thì việc ly trích DNA gặp rất nhiều khó khăn và không thể cho kết quả tốt.
Tuy nhiên, những mẫu lá non luôn đƣợc bao bọc bởi hai lá phụ màu đỏ thẫm và có thể bảo quản trên 4 tháng ở -200C. Hai lá phụ còn giúp lá non không bị dập nát và hóa nâu khoảng 15 phút sau khi lấy ra khỏi tủ -200
C.
Qua một số thí nghiệm bảo quản mẫu chúng tôi rút ra một số kết luận nhƣ sau: