2.6.4.1. Nghiên cứu ngoài nƣớc
Năm 1997, Madasamy Parani và cộng sự đã sử dụng kỹ thuật RAPD và RFLP để nghiên cứu mối quan hệ giữa cây đƣớc đôi (Rhizophora apiculata Blume) và cây đƣng (Rhizophora mucronata). Kết quả nghiên cứu cho thấy có mối quan hệ rất gần giữa cây đƣớc đôi (Rhizophora apiculata Blume) và cây đƣng (Rhizophora mucronata). [14]
Năm 2002, Mukkamala Lakshmi và cộng sự đã sử dụng RAPD và RFLP nghiên cứu mối quan hệ giữa các cây thuộc họ đƣớc (Rhizophoreae) tại Ấn Độ. Kết quả nghiên cứu cho thấy mối quan hệ di truyền của 10 loài thuộc họ đƣớc trong rừng ngập mặn Ấn Độ. [15]
2.6.4.1. Nghiên cứu trong nƣớc
Có rất nhiều nghiên cứu về cây đƣớc tuy nhiên hầu hết liên quan đến đặc điểm hình thái, các tính trạng nông học nhƣ: tăng trƣởng đƣờng kính của Đƣớc tại huyện Cần Giờ, Thành phố Hồ Chí Minh (Viên Ngọc Nam, 1995). Nghiên cứu sinh khối và năng suất sơ cấp rừng Đƣớc trồng tại Cần Giờ, Thành phố Hồ Chí Minh, Sở Nông Nghiệp và phát triển Nông thôn (Viên Ngọc Nam và Nnk, 1996).
Về nghiên cứu đa dạng di của truyền Lâm Vỹ Nguyên (2006) đã nghiên cứu sự đa dạng di truyền của cây đƣớc đôi (Rhizophora apiculata Blume) ở khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ bằng kỹ thuật RAPD.
Chƣơng 3
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH
3.1. Thời gian và điạ điểm thực hiện 3.1.1. Thời gian thực hiện
Đề tài đƣợc thực hiện từ 08/05/2007 đến 30/08/2007.
3.1.2. Địa điểm thực hiện
Mẫu lá đƣớc đƣợc thu thập tại khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ.
Mẫu lá đƣợc ly trích DNA và thực hiện phản ứng RAPD tại Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Công nghệ Môi trƣờng.
3.2. Vật liệu thí nghiệm 3.1.2. Mẫu đƣớc đôi 3.1.2. Mẫu đƣớc đôi
Mẫu đƣớc đôi (Rhizophora apilata Blume) đƣợc lấy ở khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ.
Cách thức lấy mẫu:
Lấy mẫu đƣớc theo đƣờng chéo, cách 1500m lấy 1 mẫu.
Sử dụng xe gắn máy đối với đƣờng bộ và ghe đối với đƣờng sông để thu thập lá của cây đƣớc đôi (Lá già, lá non).
Chọn mẫu lá từ những cây có đặc điểm khác biệt nhƣ: thân cây to, cây mọc tốt, cây mọc yếu ớt, cây bị mối, cây có u, cây có hình dáng lá khác lạ. Ghi nhận nguồn gốc và xác định một số tính trạng về kiểu hình: hình dáng lá, hoa, trái của cây.
Mỗi mẫu lấy khoảng 15 - 20 lá, cho vào bịch nylon và để vào thùng lạnh để bảo quản độ tƣơi của lá . Đồng thời ghi đầy đủ những thông tin của cây đƣợc lấy mẫu theo phiếu thu thâ ̣p. (Tham khảo phụ lục 5).
Xác định đƣợc vị trí cụ thể của cây lấy mẫu trêm bản đồ thông qua hệ thống định vị toàn cầu GPS (Global Position System).
Ký hiệu tên mẫu: AXY, BXY với A là đƣờng chéo thứ nhất, B là đƣờng chéo thứ hai, XY là số thứ tự của mẫu.
Cách bảo quản mẫu đƣa về phòng thí nghiệm: Mẫu sau khi lấy đƣợc cho vào thùng lạnh để bảo quản tạm thời. Sau đó chuyển về phòng thí nghiệm trữ mẫu ở nhiệt độ -200C.
3.2.2. Hoá chất thí nghiệm
3.2.2.1 Các hoá chất dùng ly trích DNA
CTAB EDTA 0,5M
Ethanol 100% Mercaptro Ethanol Ethanol 70% Sodium Acetate 3M
Iso Propanol TE 1X
Chloroform NaCl 5M Chloroform Tris-HCl 1M Isoamyl Alcohol Polyvidon
3.2.2.2. Hóa chất dùng trong kiểm tra định lƣợng DNA
TE 1X (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3.2.2.3. Các hoá chất dùng trong phƣơng pháp RAPD
Buffer dNTP
Taq DNA polymerase MgCl2
Primer: OPAC10 và OPA10
Nƣớc cất 2 lần khử ion, hấp khử trùng và chiếu tia UV
3.2.2.4. Hóa chất dùng trong điện di và đọc kết quả
Agarose
Ladder 3000 bp TAE 0,5X
Ethidium bromide Loading dye
3.2.3. Trang thiết bị thí nghiệm
Chày và cối (Đức)
Bình và khay đựng Nitơ lỏng Cân điện tử (Ohaus - Mỹ) Bồn ủ nhiệt (Memmert-Anh) Tủ lạnh 40C và -200C
Máy Vortex (IKA - Đức)
Máy hút và tủ cấy vô trùng (Việt Nam /Anh) Máy vi ly tâm lạnh (Hettich - Đức)
Nồi hấp Autoclave (ToMy - Nhật Bản) Lò Viba (Electrolux)
Tủ sấy (Jencons-Anh) Máy điện di (Biorad)
Máy chụp ảnh DNA (Biorad - Thụy Điển) Đầu tuýp các loại (Đức)
Pipet các loại (Nichiryo – Nhật Bản) Máy đo hấp thu quang phổ (HP - Mỹ) Máy PCR (BioRad – Thụy Điển) Tủ lạnh các loại (Sanyo - Nhật Bản) Eppendorf 1,5 ml và 0,2 ml (Pháp)
3.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 3.3.1. Bố trí thí nghiệm 3.3.1. Bố trí thí nghiệm
Giai đoạn 1:
Tách chiết và tinh sạch DNA từ các mẫu đƣớc đôi thu đƣợc. Định tính DNA bằng phƣơng pháp điện di.
Định lƣợng DNA bằng quang phổ kế.
Giai đoạn 2: tối ƣu hóa kỹ thuật RAPD với các mẫu DNA thu đƣợc. Khảo sát nồng độ Mg2+
Khảo sát nồng độ primer
Giai đoạn 3: thực hiện phản ứng RAPD với các mẫu đƣớc thu đƣợc
Giai đoạn 4: phƣơng pháp đánh giá đa dạng di truyền bằng phần mềm NTSYSpc.
Trong đề tài nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành thực hiện ly trích DNA tổng số trên 3 quy trình:
Quy trình 1: Quy trình ly trích mẫu tƣơi của Doyle và Doyle (1988) [9] Quy trình 2: Quy trình ly trích cải tiến [9]
Quy trình 3: Quy trình cải tiến từ quy trình 1 và quy trình 2
3.3.2.1. Quy trình 1 [9] (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Mẫu lá đƣợc ly trích theo quy trình ly trích mẫu tƣơi của Doyle và Doyle, 1988:
o Bƣớc 1: cân 0,15 g lá đã rửa sạch. Cho 1,2 ml dịch trích EB (Extraction Buffer) vào eppendorf, nghiền lá với dung dịch này. Vortex thật kỹ. Ủ ở 650 C trong 45 phút.
o Bƣớc 2: thêm 500 l Chloroform: isoamyl alcohol (24: 1), khuấy bằng vortex 10 phút, li tâm 5 phút, 14.000 vòng/phút ở 100
C.
o Bƣớc 3: chuyển lấy dịch trong lặp lại bƣớc 2.
o Bƣớc 4: chuyển lấy dịch trong, thêm vào 2 l RNase, ủ ở 370
C trong 1 giờ.
o Bƣớc 5: thêm vào 250 l dung dịch isopropanol lạnh. Để tủa ở –200C khoảng 30 phút (Nên để qua đêm).
o Bƣớc 6: li tâm 5 phút 14.000 vòng/phút ở 100
C. Đổ bỏ dịch trong.
o Bƣớc 7: cho vào 300 l TE 1X, ủ ở 370C trong 1giờ.
o Bƣớc 8: thêm 20 l muối Sodium acetate 3 M, và 640 l Ethanol 100%, trộn đều và để -200C trong 30 phút.
o Bƣớc 9: li tâm 10 phút 14.000 vòng/phút ở 100
C, đổ bỏ dịch trong.
o Bƣớc 10: rửa cặn với 400 l Ethanol 70% bằng cách ly tâm 2 phút 14.000 vòng/phút ở 100C, đổ bỏ dịch trong.
o Bƣớc 11: lặp lại bƣớc 10. Để khô cặn, hoà tan cặn trong 100 l TE 1X, ủ ở 370C trong 30 phút.
o Bƣớc 12: bảo quản mẫu ở 40C.
3.3.2.2. Quy trình 2 [9]
Mẫu lá đƣợc ly trích theo quy trình ly trích mẫu tƣơi của Doyle và Doyle, 1988 đƣợc cải tiến bởi Lâm Vỹ Nguyên, 2006.
o Bƣớc 1: lấy 0,2 g lá non rửa sạch và lau khô, nghiền trong nitơ lỏng, cho vào eppendorf.
o Bƣớc 2: thêm 1,2 ml dịch trích EB, vortex kỹ ở tốc độ thấp (600-800 vòng/phút). Ủ qua đêm ở 550C.
o Bƣớc 3: ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút ở 40C. Thu dịch nổi.
o Bƣớc 4: thêm 500 l Chloroform: Isoamyl alcohol (24:1), đảo nhẹ. Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút ở 40C. Thu dịch nổi.
o Bƣớc 5: lập lại bƣớc 4. Thu đƣợc V l dịch nổi.
o Bƣớc 6: thêm 0,2 V Sodium acetate 3M và 0,6 V Isopropanol lạnh. Đảo trộn kỹ. Ủ -200C trong 90 phút.
o Bƣớc 7: ly tâm 10.000 vòng/phút trong 10 phút ở 40C. Đổ bỏ dịch trong, thu kết tủa.
o Bƣớc 8: rửa kết tủa bằng cách thêm 400 l ethanol 70% và ly tâm 10.000 vòng/phút trong 1 phút ở 40C. Đổ bỏ dịch trong.
o Bƣớc 9: rửa kết tủa bằng cách thêm 400 l ethanol 70% và ly tâm 10.000 vòng/phút trong 1 phút ở 40C. Đổ bỏ dịch trong.
o Bƣớc 10: phơi thật khô kết tủa ở nhiệt độ phòng.
o Bƣớc 11: hòa tan kết tủa trong 100 l TE 1X, ủ ở 370C đến khi kết tủa tan hoàn toàn (Có thể ủ qua đêm). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
o Bƣớc 12: bảo quản mẫu ở -200C.
o Bƣớc 1: lấy 0,3 g lá non rửa sạch và lau khô, nghiền trong nitơ lỏng, cho vào eppendorf.
o Bƣớc 2: thêm 1 ml dịch trích EB, vortex đến khi hỗn hợp đồng nhất. Ủ 650
trong 1 giờ.
o Bƣớc 3: ly tâm 11.000 vòng/phút trong 15 phút ở 40C. Thu dịch nổi.
o Bƣớc 4: thêm 500 l Chloroform: Isoamyl alcohol (24:1), đảo nhẹ. Ly tâm 11.000 vòng/phút trong 15 phút ở 40C. Thu dịch nổi.
o Bƣớc 5: lập lại bƣớc 4. Thu dịch nổi.
o Bƣớc 6: thêm 250 µl Isopropanol lạnh, đảo trộn kỹ. Ủ -200C qua đêm
o Bƣớc 7: ly tâm 11.000 vòng/phút trong 15 phút ở 40C. Đổ bỏ dịch trong
o Bƣớc 8: cho vào 300 µl TE 1X, ủ 370 C trong 1 giờ.
o Bƣớc 9 : thêm 20 µl sodium acetate 3M và 640 µl Ethanol 100% trộn đều và ủ -200 C trong 1 giờ.
o Bƣớc 10 : ly tâm 11.000 vòng/phút trong 15 phút , đổ bỏ dịch trong.
o Bƣớc 11: rửa kết tủa bằng cách thêm 400 l ethanol 70% và ly tâm 12.000 vòng/phút trong 3 phút ở 40C. Đổ bỏ dịch trong.
o Bƣớc 12: lặp lại bƣớc 11. Phơi thật khô kết tủa ở nhiệt độ phòng.
o Bƣớc 13: hòa tan kết tủa trong 50 l TE 1X, ủ ở 370C trong 30 phút
o Bƣớc 14: bảo quản mẫu ở -200C.
3.3.3. Kiểm tra kết quả ly trích
3.3.3.1. Định tính DNA bằng phƣơng pháp điện di
DNA sau khi đƣợc ly trích sẽ đƣợc định tính bằng phƣơng pháp điện di trên gel agarose 1%. Dƣới tác dụng của điện trƣờng, do tích điện âm (Do tính chất của nhóm phosphate) nên DNA di chuyển từ cực âm sang cực dƣơng. Khi DNA di chuyển qua các lỗ của agarose, sự cọ xát giữa hạt agarose và phân tử DNA tạo ra lực kháng làm ngăn cản sự chuyển dịch của DNA. DNA có phân tử càng lớn thì lực
cản càng mạnh, do đó DNA có phân tử càng nhỏ di chuyển càng nhanh. Nhờ vậy ta có thể phân loại đƣợc các đoạn DNA trên gel agarose. [8]
Sau khi chạy điện di, ngâm gel trong hỗn hợp Ethidium Bromide 0,5 g/ml và TAE 0,5X trong 15 phút. Gel sau khi nhuộm đƣợc rửa nhẹ dƣới vòi nƣớc sạch và đƣa vào máy chụp ảnh DNA để quan sát.
Dƣới tia UV, Ethidium Bromide liên kết với sợi đôi DNA sẽ phát quang và tạo thành các band trên gel.
Cách tiến hành:
Pha gel agarose với nồng độ 1%: cân 0,125 g agarose cho vào 12,5 ml dung dịch TAE 0,5X. Đun sôi bằng lò Viba dƣới bƣớc sóng 650W trong 2 phút. Đổ gel, chờ 30 phút để agarose đông.
Load mẫu vào các giếng với tỷ lệ 2 μl loading dye và 4 μl DNA mẫu. Chạy điện di ở điều kiện 100 V, 400 mA, thời gian 20 phút.
Nhuộm gel bằng dung dịch ethidium bromide 100 mg/ml trong 20 phút, sau đó đƣa vào máy Geldoc đọc kết quả.
Gel sau khi nhuộm sẽ đƣợc chụp bằng tia tử ngoại UV. Nếu mẫu có DNA thì băng DNA sẽ phát sáng dƣới dạng vạch trên gel điện di. Độ tập trung và độ đậm nhạt của băng điện di thể hiện nồng độ cao hay thấp của mẫu DNA.
3.3.3.2. Định lƣợng DNA bằng quang phổ kế
Các mẫu DNA li trích sau khi đã định tính đƣợc kiểm tra độ tinh sạch và ƣớc lƣợng hàm lƣợng DNA bằng cách đo mật độ quang OD (optical density) với bƣớc sóng 260 nm và 280 nm bằng máy quang phổ kế với độ pha loãng 100 lần. Giá trị mật độ quang ở bƣớc sóng 260 nm (OD260) của các mẫu DNA cho phép xác định nồng độ DNA trong dung dịch. Đồng thời để kiểm tra độ tinh sạch của dung dịch
DNA thƣờng đo giá trị OD280. Khi giá trị OD260/OD280 = 1.8 – 2.2 thì dịch trích DNA đƣợc coi là tinh sạch. [10] (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hàm lƣợng DNA đƣợc tính theo công thức:
DNA (ng/ l) = [(62.9 * OD260 nm) – (36 * OD280 nm)] * Độ pha loãng
Cách tiến hành :
Xây dựng đƣờng chuẩn: Dùng dung dịch TE 1X để tạo đƣờng chuẩn.
Pha loãng dung dịch DNA đến nồng độ thích hợp để đo (thƣờng pha loãng 100 lần) với dung dịch TE 1X: hút 5 l dung dịch DNA hòa tan với 495 µl TE 1X. Cho vào Curvette để tiến hành đo OD.
Sản phẩm DNA tổng số sau khi tách chiết đƣợc định tính bằng phƣơng pháp điện di và đƣợc định lƣợng bằng phƣơng pháp quang phổ kế. Từ đó ta sẽ chọn ra quy trình ly trích DNA tổng số tốt nhất dựa trên độ sáng, độ rõ, không bị gãy của các băng DNA và không bị nhiễm protein.
3.3.4. Kỹ thuật RAPD 3.3.4.1. Primer
Sử dụng 2 primer: primer OPA 10 và primer 0PAC10 để chạy RAPD Trình tự của primer OPA 10: 5’ AGTGAACGCC 3’ và Tm = 30,70C Trình tự của primer OPAC 10: 5’AGCAGCGAGG 3’ và Tm = 340C
3.3.4.2. Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm 1 Sử dụng OPAC10 khảo sát quy trình RAPD
Mục đích thí nghiệm: khảo sát quy trình RAPD
Phƣơng pháp tiến hành: chọn 3 mẫu DNA chất lƣợng tốt thực hiện phản ứng RAPD với mồi OPAC10 theo bảng 3.1 và bảng 3.2.
Chỉ tiêu đánh giá: độ sáng, độ rõ của các band DNA đƣợc khuếch đại trên gel điện di.
(Đƣợc trích từ Nguyễn Thị Lang, 2002)
Bảng 3.2 Thành phần hóa chất sử dụng trong phản ứng RAPD
Hóa chất Nồng độ đầu Thể tích sử
dụng Nồng độ cuối
PCR buffer 10X 2,5 l 1X
MgCl2 25 mM 3 l 3 mM
dNTP 25 mM 0,2 l 0,2 M
Primer 100 pmol/ l 0,3 l 1,2 pmol/ l
Taq DNA polymerase 5 U 0,2 l 1 U DNA mẫu 50 ng/ l 1 l 50 ng H2O 17,8 l Tổng thể tích phản ứng 25 l
(Nguồn: Lê Hồng Phong, 2007)
Thí nghiệm 2:Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ Mg2+ đến phản ứng RAPD. Mục đích thí nghiệm: tối ƣu quy trình RAPD
Số chu kỳ Nhiệt độ (0 C) Thời gian 1 94 5 phút 45 94 30 giây 36 30 giây 72 1 phút 1 72 5 phút Giữ 40 C
Thiết kế thí nghiệm: thí nghiệm đƣợc bố trí gồm 3 nghiệm thức. Mỗi nghiệm thức đƣợc lặp lại 3 lần. Mỗi nghiệm thức gồm 1 mẫu DNA.
Phƣơng pháp tiến hành: tiến hành chọn 3 mẫu DNA có chất lƣợng tốt và primer OPAC10 để khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ Mg2+ đến sản phẩm RAPD
Chỉ tiêu đánh giá: độ sáng, độ rõ của các band DNA đƣợc khuếch đại trên gel điện di.
Bảng 3.3 Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ Mg2+
đến sản phẩm RAPD Nghiệm thức 1 Nghiệm thức 2 Nghiệm thức 3 Nồng độ Mg2+ (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3mM 2,5 mM 2mM
Thí nghiệm 3:Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ primer lên phản ứng RAPD Mục đích thí nghiệm: tối ƣu hóa quy trình RAPD
Thiết kế thí nghiệm: thí nghiệm đƣợc bố trí gồm 4 nghiệm thức. Mỗi nghiệm thức đƣợc lặp lại 3 lần. Mỗi nghiệm thức gồm 1 mẫu DNA.
Phƣơng pháp tiến hành: tiến hành chọn 3 mẫu DNA có chất lƣợng tốt và primer OPAC10 để khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ primer đến sản phẩm RAPD.
Bảng 3.4 Thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ primer đến sản phẩm PCR với primer OPAC10
Nghiệm thức 1 Nghiệm thức 2 Nghiệm thức 3 Nghiệm thức 4
Nồng độ
primer 1,2 pmol/ l 1 pmol/ l 0,8 pmol/ l 0,6 pmol/ l
Chỉ tiêu đánh giá: độ sáng, độ rõ của các band DNA đƣợc khuếch đại trên gel điện di.
Thí nghiệm 4: Thực hiện phản ứng RAPD thử nghiệm với primer OPA10 và
OPAC10.
Mục đích thí nghiệm: thử nghiệm primer OPA 10, OPAC10 theo quy trình RAPD tối ƣu.
Thiết kế thí nghiệm: thí nghiệm đƣợc bố trí gồm 2 nghiệm thức. Mỗi nghiệm thức đƣợc lặp lại 2 lần với 1 mẫu DNA.
Phƣơng pháp tiến hành: chọn 1 mẫu DNA và 2 primer OPAC10, OPA 10 để tiến hành thí nghiệm.
Bảng 3.5 Thực hiện phản ứng RAPD thử nghiệm với primer OPA10 và OPAC10
Chỉ tiêu đánh giá: độ sáng, độ rõ của các band DNA đƣợc khuếch đại trên gel điện di.
Thí nghiệm 5: Thực hiện phản ứng RAPD với 10 mẫu theo thành phần hóa chất (Bảng 3.6) và chu kỳ nhiệt (Bảng 3.1)
Bảng 3.6 Thành phần hóa chất sử dụng trong phản ứng RAPD
Hóa chất Nồng độ đầu Thể tích sử dụng Nồng độ cuối
PCR buffer 10X 2,5 l 1X
Nghiệm thức 1 Nghiệm thức 2
MgCl2 25 mM 3 l 3 mM
dNTP 25 mM 0,2 l 0,2 M
Primer 100 pmol/ l 0,15 l 0,6 pmol/ l
Taq DNA polymerase 5 U 0,2 l 1 U
DNA mẫu 50 ng/ l 1 l 50 ng/ l
H2O 17,95 l
Tổng thể tích phản ứng 25 l
Một số lƣu ý khi thực hiện phản ứng RAPD:
(adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});