SỬ DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ MICROSATELLITE ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÁC DÕNG KEO LÁ TRÀM (Acacia auriculiformis)

Ngày nay cùng với sự phát triển của đời sống, kinh tế, xã hội, nhiều sản phẩm làm từ các chất liệu nhƣ nhựa, nhôm, hợp kim,…,đã ra đời với nhiều công dụng tiện lợi phục vụ cho đời sống tất bật của xã hội loài ngƣời trong giai đoạn phát triển vũ bão. Tuy nhiên các sản phẩm này vẫn không thể nào thay thế đƣợc hoàn toàn sự hiện diện của các sản phẩm đƣợc làm từ gỗ nhƣ: bàn ghế, cửa, kệ, tủ, hàng thủ công mỹ nghệ, tập sách vở…trong các gia đình, công sở, nhà hàng, khách sạn, phòng triển lãm, khu trƣng bày, trƣờng học,…Do các sản phẩm làm từ gỗ mang lại sang trọng, ấm cúng, gần gũi với thiên nhiên cho không gian sử dụng, và chúng còn có thể tái chế. Vậy mà thực tế cho thấy nguồn nguyên liệu gỗ ngày càng suy kiệt, giảm chất lƣợng do sự khai thác bừa bãi, nạn phá rừng của con ngƣời, thiên tai lũ lụt, hạn hán, cháy rừng, sự ô nhiễm môi trƣờng... Keo lá tràm hay còn gọi Keo bông vàng, là loại cây mọc nhanh có xuất xứ từ Australia, Papua, New Guinea và Indonesia,…(Turnbull,1986). Đƣợc du nhập vào Việt Nam từ thập niên 60 của thế kỉ XX, với mục đích chủ yếu là cung cấp nguồn nguyên liệu cho sản xuất giấy, làm đồ trang trí nội thất, làm than củi,... (http://snnptnt.thanhhoa.gov.vn). Tại Việt Nam hiện nay, Keo lá tràm đƣợc trồng phổ biến ở nhiều địa phƣơng, tập trung chủ yếu ở các tỉnh miền Trung và vùng Đông Nam Bộ. Keo lá tràm đóng góp một cách có ý nghĩa trong ngành công nghiệp sản xuất giấy, nghề chế tác hàng thủ công mỹ nghệ và cũng nhƣ đời sống của nông dân trồng rừng (Bùi Việt Hải,1998). Vì vậy việc chọn và tạo giống Keo lá tràm chất

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ******  ****** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP SỬ DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ MICROSATELLITE ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÁC DÕNG KEO LÁ TRÀM (Acacia auriculiformis) Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2007 Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học Niên khóa: 2003-2007 Sinh viên:Trần Thị Thanh Hƣơng BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ******  ****** SỬ DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ MICROSATELLITE ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÁC DÕNG KEO LÁ TRÀM (Acacia auriculiformis) Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS. VƢƠNG ĐÌNH TUẤN TRẦN THỊ THANH HƢƠNG Niên khóa: 2003-2007 Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2007 1 LỜI CẢM ƠN Con xin cảm ơn Ba Má cùng các anh chị trong gia đình đã nuôi dạy con đến ngày khôn lớn và cho con ăn học thành tài.  Chân thành cảm ơn! Trƣờng Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học Trƣờng Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. Phân viện nghiên cứu khoa học kĩ thuật lâm nghiệp Nam bộ Trung Tâm Công nghệ sinh học TP. Hồ Chí Minh. Đã tạo mọi điều kiện cho tôi học tập và hoàn thành luận án tốt nghiệp đúng tiến độ.  Chân thành cảm ơn! Tất cả các Thầy Cô đã tận tình chỉ bảo, truyền đạt kiến thức cho lớp chúng tôi trong thời gian học tập tại trƣờng Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh.  Chân thành cảm ơn! TS.Vƣơng Đình Tuấn TS. Nguyễn Quốc Bình Đã luôn tận tình giúp đỡ, hƣớng dẫn, động viên và tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt quá trình làm đề tài.  Chân thành cảm ơn! Chị Ngô Huỳnh Phƣơng Thảo và tất cả các anh, chị và các bạn lớp Công nghệ sinh học 29, đã không ngừng động viên giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiên đề tài. Xin chân thành tri ân! Sv: TRẦN THỊ THANH HƢƠNG 2 TÓM TẮT TRẦN THỊ THANH HƢƠNG, Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. Tháng 8/2007. “SỬ DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ MICROSATELLITE ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÁC DÕNG KEO LÁ TRÀM (Acacia auriculiformis)”. Hƣớng dẫn khoa học: TS.Vƣơng Đình Tuấn  Thời gian nghiên cứu Từ tháng 3/2007 đến 8/2007.  Địa điểm nghiên cứu Phân viện nghiên cứu khoa học kĩ thuật lâm nghiệp Nam Bộ . Trung tâm Công nghệ sinh học TP Hồ Chí Minh.  Mục đích nghiên cứu -Xác định đƣợc chỉ thị ADN phù hợp cho nghiên cứu đa đạng di truyền Keo lá tràm (Acacia auriculiformis). Từ đó xác định đƣợc mối quan hệ di truyền giữa các cá thể thu thập từ những xuất xứ khác nhau, có liên hệ đến tính trạng sinh trƣởng nhanh của các cá thể, góp phần phục vụ công tác chọn giống theo hƣớng chất lƣợng cao.  Yêu cầu - Xác định các cặp mồi để đánh giá đa dạng di truyền các dòng Keo lá tràm. - Tìm hiểu mối quan hệ di truyền của các dòng cây Keo lá tràm ở Việt Nam.  Phƣơng pháp nghiên cứu - Sử dụng kĩ thuật PCR để khuếch đại DNA ly trích từ mẫu lá của 100dòng Keo lá tràm thu đƣợc với 9cặp mồi.  Kết quả - Bƣớc đầu thanh lọc đƣợc một số cặp mồi SSR đƣợc sử dụng cho phân tích đa dạng di truyền. Và có sự khác nhau về trọng lƣợng các bands của các cá thể phân tích và có sự biến động di truyền giữa các cá thể.  Kết luận 3 - Thí nghiệm đã thanh lọc đƣợc một số cặp mồi (Am 341, Am 326 và Am 770) có thể cho hiệu quả phân tích đa dạng di truyền Keo lá tràm khá tốt. 4 MỤC LỤC ĐỀ MỤC TRANG TRANG TỰA . ii LỜI CẢM ƠN . iii TÓM TẮT . iv MỤC LỤC v DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT viii DANH SÁCH CÁC HÌNH . ix DANH SÁCH CÁC BẢNG VÀ SƠ ĐỒ . x Phần 1. MỞ ĐẦU . 1 1.1 Đặt vấn đề 1 1.2 Yêu cầu và mục đích nghiên cứu của đề tài . 2 1.4 Giới hạn của đề tài . 2 Phần 2. TỔNG QUAN . 4 2.1 Giới thiệu về đa dạng sinh học . 4 2.1.1 Định nghĩa . 4 2.1.2 Ý nghĩa của đa dạng sinh học . 4 2.1.3 Các phân mức về đa dạng sinh học . 4 2.1.3.1 Sự đa dạng về hệ sinh thái 4 2.1.3.2 Đa dạng loài . 5 2.1.3.3 Đa dạng về di truyền 6 2.2 Một số DNA marker sử dụng nghiên cứu sự đa dạng di truyền 7 2.2.1 Phân loại 7 2.2.2 Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) . 8 2.2.3 Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP) . 9 2.2.4 Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphism DNA) 10 2.2.5 SSR (Microsatellite) 10 5 2.3 Kỹ thuật Microsatellite . 11 2.3.1 Khái niệm về Microsatellite 11 2.3.2 Tính chất 12 2.3.3 Sự phát triển của primer Microsatellite . 13 2.3.4 Giới hạn của Microsatellite . 14 2.3.5 Các loại Microsatellite 15 2.3.6 Cơ chế hình thành và vai trò của Microsatellite . 15 2.3.6.1 Cơ chế hình thành Microsatellite 15 2.3.6.2 Vai trò của Microsatellite . 17 2.3.7 Các phƣơng pháp phát hiện Microsatellite . 18 2.3.7.1 Phƣơng pháp lai . 18 2.3.7.2 Phƣơng pháp PCR 19 2.4 Polymerase Chain Reaction (PCR) 19 2.4.1 Khái niệm 19 2.4.2 Thành phần và vai trò của các chất trong phản ứng PCR . 20 2.4.4 Ứng dụng của kỹ thuật PCR 23 2.4.5 Ƣu và nhƣợc điểm của kỹ thuật PCR 23 2.5 Quy trình ly trích DNA thực vật 23 2.5.1 Định lƣợng DNA bằng phƣơng pháp quang phổ 25 2.5.2 Định tính DNA ly trích bằng phƣơng pháp điện di 26 2.6 Tổng quan về cây Keo lá tràm (Acacia auriculiformis) 28 2.6.1 Vài nét về chi Keo (Acacia) 28 2.6.1.1 Đặc điểm sinh học của các loài Keo 28 2.6.1.2 Công dụng của các loài Keo (Acacia) 30 2.6.2 Vài nét về cây Keo lá tràm (Acacia auriculiformis A. Cunn ex Benth) 32 2.6.2.1 Các đặc điểm sinh học và sinh thái 33 2.6.2.2 Công dụng và tiềm năng gây trồng 35 Phần 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP . 36 6 3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện . 36 3.1.1 Thời gian thực hiện . 36 3.1.2 Địa điểm thực hiện . 36 3.2 Vật liệu thí nghiệm . 36 3.3 Phƣơng pháp thí nghiệm 36 3.4 Thiết bị và dụng cụ . 37 3.5 Ly trích DNA . 37 3.5.1 Hóa chất . 37 3.5.2 Quy trình ly trích DNA . 38 3.5.3 Kiểm tra sản phẩm DNA ly trích . 40 3.6.1 Qui trình phản ứng PCR 40 3.6.2 Điện di sản phẩm PCR 42 Phần 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 44 4.1 Quá trình ly trích . 44 4.2 Phản ứng PCR 44 Phần 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ . 48 5.1 Kết luận 48 5.2 Đề nghị . 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 PHỤ LỤC 7 DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT  µg: microgram  µM: micromol/lite  Al: Allele  bp: base pair  M:mét  cm: centimét  CTAB: Cetyltrimethylammonium bromide  DNA: Deoxyribonucleic acid  dNTP: Deoxynucleotide triphosphate  EDTA: Ethylene diaminetetra acetic acid  EtBt: Ethidium bromide  Kb: kilobases  mM: milimolar (milimol/lite).  PCR: Polymerase chain reaction  RNA: Ribonucleic acid  RNase: Ribonuclease  SSR: Single sequence repeat  Ta : Annealing temperature (nhiệt độ bắt cặp)  TAE: Tris-glacial acetic acid- ethylenne diamine tetra acetic acid  TE: Tris-EDTA (ethylenne diamine tetra acetic acid)  Tm: Melting temperature (nhiệt độ nóng chảy)  U: Đơn vị hoạt tính của Taq  UV: Ultra Violet 8 DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1: Cơ chế bắt chéo lỗi trong giảm phân . 16 Hình 2.2: Cơ chế trƣợt lỗi trong quá trình sao mã . 16 Hình 2.3:Nguyên tắc cơ bản của phản ứng PCR . 20 Hình 2.4: Hình thái lá các loài Keo(Acacia) 29 Hình2.5:Hình thái một số loài Keo 30 Hình 2.6. Keo lá tràm . 33 . trình thực hiên đề tài. Xin chân thành tri ân! Sv: TRẦN THỊ THANH HƢƠNG 2 TÓM TẮT TRẦN THỊ THANH HƢƠNG, Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. Tháng 8/2007 TRANG TRANG TỰA .