Áp dụng chỉ thị phân tử để đánh giá đa dạng di truyền một số dòng cẩm chướng sau xử lý đột biến tia gamma và kết hợp EMS

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC ÁP DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ ĐỂ ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN MỘT SỐ DÒNG CẨM CHƯỚNG SAU XỬ LÝ ĐỘT BIẾN TIA GAMMA VÀ KẾT HỢP EMS CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM LÊ HẢI HÀ HÀ NỘI - Năm 2010 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu tôi, Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa sử dụng công bố luận văn, luận án công trình khoa học trước Tôi xin cam đoan thông tin trích dẫn sử dụng luận văn rõ nguồn gốc, đảm bảo trích dẫn theo quy định Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm lời cam đoan ! Hà Nội, ngày 30 tháng 10 năm 2010 Giáo viên hướng dẫn Tác giả Lê Hải Hà LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, nỗ lực thân nhận giúp đỡ mặt thầy cô giáo, tập thể cá nhân Trước hết xin gửi lời cảm ơn tới toàn thể thầy cô giáo, cán bộ thuộc Viện Sinh học nông nghiệp - Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội Đặc biệt xin chân thành cảm ơn cô PGS.TS Nguyễn Thị Lý Anh, thầy GS.TS Nguyễn Quang Thạch người tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện thuận lợi cho mặt suốt thời gian thực đề tài Bên cạnh xin cảm ơn thầy cô giáo thuộc Viện Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm trường Đại học Bách Khoa Hà Nội dạy dỗ giúp đỡ trình học tập Cũng qua cho gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, bạn bè đồng nghiệp tạo điều kiện giúp đỡ, động viên, giúp đỡ hoàn thành luận văn Hà Nội, ngày 20 tháng 10 năm 2010 Tác giả Lê Hải Hà DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT aNAA Naphthyl acetic acid 2,4D 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid AP- PCR Arbitrarily Primer Polymerase Chain Reaction BAP 6-Benzyladenopurine bp Base pair CN Công nguyên CTAB Cetyl trimethylammonium bromide DNA Deoxyribonucleic acid dNTP Deoxynucleotide Triphosphates 10 EDTA Ethylen Diamine Tetra Acetic acid 11 EtBr Ethidium Bromide 12 Gy Gray 13 M1V4 Mutant 1- Vegetative 14 Krad Kilorad 15 Kb Kilobase 16 mRNA Messenger Ribonucleic acid 17 M1V8 Mutant 1- Vegetative 18 PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp) 19 PVP Polyvinyl pyrrolidone 20 RNAi Ribonucleic acid interference 21 RT- PCR Reverse transcription PCR 22 SDS Sodium Dodecyl Sulphate 23 TBE Tris – boric acid – EDTA MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN Error! Bookmark not defined LỜI CẢM ƠN Error! Bookmark not defined DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT iii I MỞ ĐẦU Error! Bookmark not defined 1.1 Đặt vấn đề Error! Bookmark not defined 1.2 Mục đích yêu cầu đề tài 1.3 Giới hạn đề tài Error! Bookmark not defined 1.4 Ý nghĩa khoa học thực tiến đề tài Error! Bookmark not defined II TỔNG QUAN TÀI LIỆU Error! Bookmark not defined 2.1 Giới thiệu cẩm chướng Error! Bookmark not defined 2.2 Tạo giống đột biến xử lý gamma EMS 2.3 Giới thiệu tia gamma, hoá chất Ethyl methane sulfonate (EMS) Error! Bookmark not d 2.4 Tạo giống đột biến thực nghiệm 14 2.5 Ứng dụng tạo đột biến thực nghiệm nuôi cấy in vitro tạo giống hoa cẩm chướng 23 2.6 Ứng dụng thị phân tử ADN chọn giống trồng 26 III ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, ĐỊA ĐIỂM VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33 3.1 Đối tượng nghiên cứu 33 3.2 Vật liệu nuôi cấy 33 3.3 Nội dung nghiên cứu 33 3.4 Phương pháp nghiên cứu 35 3.5 Các tiêu theo dõi 40 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 35 4.1 Nghiên cứu ảnh hưởng liều lượng chiếu xạ tia gamma đến khả sống, sinh trưởng biến dị chồi cẩm chướng in vitro 42 4.2.Nghiên cứu ảnh hưởng xử lý EMS đến khả sống, sinh trưởng biến dị chồi cẩm chướng in vitro 4.3 Ảnh hưởng xử lý kết hợp tia gamma EMS 45 48 4.4 Nghiên cứu chọn lọc biến dị sau xử lý đột biến điều kiện tự nhiên 56 4.5 Đánh giá sai khác ADN số dạng biến dị màu sắc hoa thị SSR 60 4.6 Đánh giá ổn định di truyền dòng cẩm chướng đột biến 78 KẾT QUẢ VÀ ĐỀ NGHỊ 80 5.1 Kết luận 80 5.2 Đề nghị 80 TÀI LIỆU THAM KHẢO 81 Luận văn Thạc sĩ khoa học Lê Hải Hà I MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Trong chiến lược phát triển nông nghiệp Việt Nam, chuyển đổi cấu trồng để nâng cao hiệu kinh tế đơn vị diện tích đất đai yêu cầu thiết sản xuất Thực tế năm qua hầu hết địa phương nước xuất nhiều mô hình chuyển đổi cấu trồng, phải kể đến mô hình chuyển đổi từ trồng lúa sang trồng hoa thâm canh có hiệu kinh tế cao Trong loài hoa cắt trồng, cẩm chướng dần trở thành trồng phổ biến Với ưu điểm: mầu sắc đẹp, đa dạng phong phú (khoảng 300 loài nhiều giống lai khác [26], sản lượng cao, dễ vận chuyển bảo quản, cẩm chướng ngày người tiêu dùng biết đến, trở thành bốn loài hoa cắt cành trồng phổ biến giới (chiếm 17% tổng sản lượng hoa cắt) [6] Ở nước ta, trước hoa cẩm chướng trồng làm cảnh trang trí, năm 1975 bắt đầu sản xuất hoa cẩm chướng cắt cành với giống nhập nội từ nước Từ năm 1995 có nhiều giống hoa cẩm chướng nhập nội có nguồn gốc từ Hà Lan, Trung Quốc với màu sắc đa dạng phong phú [48] Cho đến nay, cẩm chướng trở thành loài hoa trồng phổ biến góp phần không nhỏ vào phát triển ngành rau hoa nước ta Theo số liệu sơ Tổng cục Hải quan, kim ngạch xuất hoa loại tháng 8/09 đạt 1,7 triệu USD, tăng 111,9% so với kỳ 2008 Trong đó, xuất cẩm chướng đạt 8,4 triệu cành, thị trường chủ yếu Nhật Bản, Úc Đài Loan [54] Đa số giống hoa cẩm chướng trồng nước ta phải nhập từ nước ngoài, phí sản xuất cao, không chủ động sản xuất, suất, chất lượng sản phẩm chưa đáp ứng yêu cầu, thị hiếu người tiêu dùng Đặc biệt, Luận văn Thạc sĩ khoa học Lê Hải Hà giống chưa thích ứng với điều kiện sinh thái nước ta Vì vậy, việc phát triển hoa có giá trị không việc nhân nhanh giống nhập nội hay tìm biện pháp kỹ thuật nhằm nâng cao suất chất lượng mà phải tạo giống hoa cẩm chướng đáp ứng nhu cầu thị trường phù hợp với điều kiện sinh thái Việt Nam Hiện nay, với phát triển công nghệ tế bào thực vật, công nghệ xử lý đột biến in vitro trở thành công cụ hữu hiệu chọn tạo giống trồng Kỹ thuật gây đột biến in vitro gây tạo làm tăng tần số xuất đột biến, rút ngắn thời gian chọn tạo với tính trạng có giá trị kinh tế loài thực vật nói chung hoa nói riêng, góp phần không nhỏ cho việc cải tiến giống trồng Phương pháp đánh giá thành tựu kỷ 20 Ở nước ta việc nghiên cứu gây đột biến in vitro hạn chế Đối với cẩm chướng có công bố ban đầu xử lý riêng rẽ EMS tia gamma in vitro[9] Trong kỷ này, việc sử dụng thị phân tử để đánh giá đa dạng phát đột biến áp dụng rộng rãi Để gia tăng tần xuất xuất đột biến nhằm tạo nguồn nguyên liệu phong phú cho chọn tạo giống hoa cẩm chướng mới, tiến hành đề tài “Áp dụng thị phân tử để đánh giá đa dạng di truyền số dòng cẩm chướng sau xử lý đột biến tia gamma kết hợp EMS ” 1.2 Mục đích yêu cầu đề tài 1.2.1 Mục đích Áp dụng phương pháp đột biến phóng xạ, hoá chất với công nghệ tế bào sinh học phân tử để tạo đánh giá thể đột biến phục vụ cho công tác chọn tạo giống cẩm chướng 1.2.2 Yêu cầu - Tạo đột biến tia gamma EMS Luận văn Thạc sĩ khoa học Lê Hải Hà - Đánh giá sinh trưởng, phát triển sau xử lý điều kiện in vitro điều kiện tự nhiên để chọn lọc đột biến - Đánh giá đa dạng di truyền dòng cẩm chướng đột biến giống gốc thị SSR - Đánh giá độ ổn định di truyền dòng đột biến chọn lọc 1.3 Giới hạn đề tài Các thí nghiệm xử lý đột biến tiến hành phòng thí nghiệm Viện sinh học Nông nghiệp - Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội với điều kiện hoàn toàn nhân tạo Thí nghiệm tự nhiên tiến hành điều kiện khí hậu vùng đồng sông Hồng vụ Đông Xuân 2009 - 2010 1.4 Ý nghĩa khoa học thực tiến đề tài Đây đề tài tiến hành nghiên cứu xử lý kết hợp tác nhân gây đột biến phóng xạ (tia γ) tác nhân đột biến hoá học (EMS) cho cẩm chướng điều kiện in vitro Các kết nghiên cứu đề tài minh chứng gia tăng tỷ lệ biến dị xử lý kết hợp hai nhân tố so với xử lý riêng rẽ nhân tố Đồng thời đề tài xác định thay đổi tỷ lệ dạnh biến dị in vitro qua lần cấy chuyển mẫu làm rõ sai khác mức độ ADN dạng biến dị Trên sở tìm phương pháp xử lý EMS tia gamma in vitro hiệu cho cẩm chướng Các kết nghiên cứu đề tài tư liệu giảng dạy có giá trị lĩnh vực công nghệ Sinh học chọn tạo giống trồng Đồng thời dòng cẩm chướng thu đuợc sau xử lý kết hợp EMS tia gamma in vitro nguồn nguyên liệu di truyền quý cho việc chọn tạo giống hoa cẩm chướng Luận văn Thạc sĩ khoa học Lê Hải Hà 4.5.4Kết phân tích mối quan hệ di truyền 16 dòng, giống cẩm chướng nghiên cứu Số liệu thu từ tiêu điện di sản phẩm PCR 20 cặp mồi SSR với 16 dòng, giống cẩm chướng thống kê phân tích phân mềm NTSYSpc 2.1 Qua thiết lập bảng hệ số tương đồng di truyền xây dựng sơ đồ mối quan hệ di truyền 16 dòng, giống cẩm chướng nghiên cứu Kết cho thấy hệ số tương đồng di truyền 16 dòng, giống cẩm chướng nghiên cứu tương đối cao dao động từ 0,41 - 0,94 Dựa vào sơ đồ mối quan hệ di truyền (hình 4.14) chia 16 dòng, giống nghiên cứu thành nhóm lấy hệ tương đồng 64% Nhóm I: gồm dòng cẩm chướng đột biến E1 E7 giống nhập nội mầu Tím Các dòng, giống có mối quan hệ di truyền xa với giống lại hệ số tương đồng di truyền thấp 0,34 đến 0,77 Trong nhóm chia làm nhóm nhỏ nhóm I.1 bao gồm dòng đột biến E1, E7 nhóm I.2 có giống nhập nội màu tím Nhóm phụ I.1 gồm E1 E7, hai dòng có hệ số tương đồng với cao 0,94 nên gần mặt di truyền Điều hoàn toàn phù hợp hai dòng đột biến E1 E7 tạo từ giống gốc ban đầu giống số xử lý EMS tia gamma Hai dòng E1, E7 có hệ số tương đồng so với giống gốc số 0,48 0,51 chúng tương đối xa mặt di truyền Vì dòng E1 E7 bị đột biến tác nhân EMS tia gamma từ giống gốc số Nhóm phụ I.2 có giống nhập nội mầu tím, hệ số tương đồng giống với dòng mầu tím đột biến (SP2;SP4;SP6) (0,58; 0,56; 0,68) Hệ số tương đồng giống tím nhập nội với dòng đột biến E7 mầu tím tạo nhờ xử lý tia gamma 0,77 Các dòng mầu tím đột biến (SP2;SP4;SP6) có hệ số tương đồng so với giống mầu tím nhập nội chênh lệch không đáng kể Điều phù hợp giống tạo nhở xử lý EMS cho giống gốc số 73 Luận văn Thạc sĩ khoa học Lê Hải Hà Nhóm II bao gồm giống gốc số dòng đột biến SP6, hệ số tương đồng chúng tương đối cao 0,71 Vì chúng gần mặt di truyền dòng SP6 tạo từ giống gốc số nhờ xử lý EMS Hệ số tương đồng dòng đột biến (SP2, SP4) với giống gốc số (0,68; 0,71) chênh lệch không đáng kể ( 3%) dòng bị đột biến tác nhân EMS Hệ số tương đồng giống gốc số với dòng đột biến E7 tao nhờ xử lý tia gamma 0,51 thấp so với hệ số tương đồng dòng đột biến (SP2, SP4) với giống gốc số Như tác nhân khác (EMS, tia gamma) tạo đột biến khác giống gốc ban đầu Nhóm III bao gồm dòng, giống lại đựơc chia thành nhóm phụ nhỏ Hệ số tương đồng dao động từ 0,36 dòng đột biến E2 với giống Vàng nhập nội đến 0,88 dòng SP4 với dòng (CC10) (CC8) Nhóm phụ III.1 có dòng đột biến SP1, hệ số tương đồng dòng với giống tím nhập nội thấp 0,4 cao 0,74 dòng đột biến SP5, SP7 Dòng SP3 tạo nhờ xử lý đột biến giống gốc số nên có mối quan hệ di truyền xa với giống tím nhập nội Hệ số tương đồng dòng đột biến SP1 với giống gốc số 0,51 nên tương đối xa mặt di truyền Hệ số tương đồng dòng SP1 so với dòng đột biến SP3, SP5 mầu sắc với tạo từ giống gốc số 0,74 nên chúng gần mặt di truyền Hệ số tương đồng dòng SP1 dòng đột biến SP7 có mầu vàng tạo từ giống gốc số 0,51 chúng xa mặt di truyền Nhóm phụ III.2 có dòng đột biến SP8, hệ số tương đồng di truyền với giống vàng nhập nội thấp 0,43 cao 0,76 với dòng đột biến SP5 Dòng đột biến SP8 tạo từ giống gốc số nên khoảng cách di truyền xa so với giống vàng nhập nội Hệ số tương đồng dòng đột biến SP8 với giống gốc số 0,6 nên xa mặt di truyền Hệ số tương đồng dòng đột biếnứp8 với dòng SP1 tạo từ giống gốc số 0,59 xa mặt di truyền Nhưng hệ số tương đồng dòng đột biến SP8 với dòng (SP3, SP5) 0,67 74 Luận văn Thạc sĩ khoa học Lê Hải Hà 0,76 nên chúng gần mặt di truyền Nhóm phụ III.3 có giống gốc số có hệ số tương đồng với dòng E1 thấp 0,41 cao 0,7 dòng (CC4, CC5, CC7, CC10) Các dòng CC5, CC7 có mầu gạch tạo từ giống gốc số nên chúng gần mặt di truyền Nhóm phụ III.4 bao gồm dòng đột biến SP5 giống nhập nội mầu gạch, hệ số tương đồng di truyền dòng SP5 với giống vàng nhập nội thấp 0,39 cao 0,88 dòng SP5 với giống gạch nhập nội Hệ số tương đồng dòng đột biến SP5 giống gốc số 0,6 xa mặt di truyền Nhóm phụ III.5 có dòng đột biến SP7, hệ số tương đồng di truyền với giống vàng nhập nội thấp 0,51 cao 0,84 với dòng SP3 Dòng SP7 SP3cùng tạo từ giống gốc số nên chúng có mối quan hệ di truyền gần Hệ số tương đồng di truyền dòng SP7 giống gạch nhập nội 0,69 nên chúng tương đối gần mặt di truyền Hệ số tương đồng di truyền giống vàng nhập nội với giống gốc số 0,43, mà dòng CC7 tạo từ giống số nên dòng có mối quan hệ di truyền xa với giống vàng nhập nội mạc dù có mầu sắc hoa Nhóm phụ III.6 có dòng đột biến E2 có hệ số tương đồng cao 0,88 với dòng SP2 thấp 0,36 với giống vàng nhập nội Hệ số tương đồng dòng E2 với giống gốc số (0,63) dòng E1 (0,51) nên xa mặt di truyền Nhóm phụ III.7 có dòng đột biến SP3, hệ số tương đồng di truyền thấp 0,43 với giống vàng nhập nội cao 0,86 với dòng SP2 Dòng SP3và dòng SP2 khác mầu sắc tạo từ giống gốc số nên hệ số tương đồng chúng tương đối cao Hệ số tương đồng di truyền giống số với giống vàng nhập nội 0,5 nên dòng SP3 giống vàng nhập nội có mối quan hệ xa mặt di truyền 75 Luận văn Thạc sĩ khoa học Lê Hải Hà Nhóm phụ III.8 bao gồm dòng đột biến SP2 SP6, có hệ số tương đồng di truyền cao 0,88 dòng thấp 0,43 dòng CC4 vớigiống vàng nhập nội Hai dòng SP2 SP6có mầu sắc giống (tím) đựoc tạo từ giống gốc số nên hệ số tương đồng di truyền cao Hệ số tương đồng dòng (SP2,SP6) với giống tím nhập nội (0,58; 0,68) giống số giống tím nhập nội 0,68 nên dòng SP2 SP6 có mối quan hệ xa mặt di truyền với giống tím nhập nội E1 E7 Tim Vang SP1 SP2 SP6 SP3 Gach E2 SP7 SP5 Gach so6 SP8 SP4 so4 0.52 0.63 0.73 0.84 Coefficient Hình 4.14 Sơ đồ mối quan hệ di truyền 16 dòng, giống cẩm chướng 76 0.94 Luận văn Thạc sĩ khoa học Lê Hải Hà Bảng 4.14 hệ số tương đồng di truyền 16 dòng, giống cẩm chướng nghiên cứu R/C CC1 CC2 CC3 CC4 CC5 CC6 CC7 CC8 CC9 CC10 CC11 CC12 CC13 CC14 CC15 CC16 CC1 1,0 CC2 0.94 1,0 CC3 0.56 0.53 1,0 CC4 0.59 0.63 0.69 1,0 CC5 0.59 0.55 0.74 0.86 1,0 CC6 0.41 0.45 0.49 0.67 0.65 1,0 CC7 0.51 0.55 0.74 0.81 0.81 0.65 1,0 CC8 0.65 0.69 0.62 0.88 0.83 0.67 0.83 1,0 CC9 0.56 0.53 0.66 0.79 0.84 0.62 0.79 0.8 1,0 CC10 0.51 0.55 0.59 0.88 0.81 0.65 0.77 0.83 0.74 1,0 CC11 0.48 0.51 0.51 0.68 0.68 0.71 0.73 0.69 0.7 0.63 1,0 CC12 0.47 0.51 0.59 0.67 0.67 0.6 0.76 0.73 0.59 0.67 0.63 1,0 CC13 0.41 0.45 0.61 0.7 0.7 0.53 0.7 0.67 0.72 0.7 0.61 0.6 1,0 CC14 0.59 0.63 0.64 0.71 0.71 0.56 0.88 0.73 0.69 0.67 0.63 0.67 0.6 1,0 CC15 0.72 0.77 0.4 0.58 0.54 0.56 0.59 0.68 0.59 0.54 0.68 0.62 0.51 0.67 1,0 CC16 0.69 0.64 0.51 0.43 0.43 0.34 0.39 0.49 0.51 0.36 0.5 0.43 0.43 0.46 0.63 1,0 Ghi chú: giống viết theo bảng 4.11 Kết đánh giá đa dạng SSR cho dòng, giống nghiên cứu bước đầu đánh giá dòng đột biến tạo nghiên cứu đột biến di truyền Qua khắng định thành công phương pháp tạo đột biến in vitro tia gamma EMS cẩm chướng 77 Luận văn Thạc sĩ khoa học Lê Hải Hà 4.6 Đánh giá ổn định di truyền dòng cẩm chướng đột biến Các mẫu hoa đột biến mầu sắc theo hướng có lợi giống hoa mầu vàng, tím, tím hồng, gạch đưa vào nuôi cấy in vitro trở lại Sau lần nhân giống liên tiếp cho đủ số lượng 2000 cây/dòng tiến hành cho rễ môi trường tạo rễ MS + 0,5ppm α NAA + 0,5g than hoạt tính Sau đem trồng giá thể vườn ươm thời gian tuần để thích nghi dần với điều kiện tự nhiên Tiến hành theo dõi đánh giá sinh trưởng phát triển tỷ lệ phân ly tính trạng dạng đột biến ( mầu sắc hoa ) ruộng sản xuất, kết thu sau: Bảng 4.15 Tỷ lệ phân ly kiểu hình dòng cẩm chướng đột biến hệ M1V8 STT Tên dòng, giống Tỷ lệ phân ly (%) kiểu phân ly Giống gốc số - Giống gốc số - Dòng đột biến SP7 - Các dòng đột Gạch mầu - Dòng đột biến E7 mầu tím 1,05 Mầu nhạt hoa trắng gần giống đối chứng Dòng đột biến E1 (Tím hồng) 2,13 nhạt mầu hồng cánh hoa, trở đối chứng biến Ghi chú: ( - ) Không phân ly Kết thu vế phân ly tính trạng hệ M1V8 có phân ly kiểu hình giống đột biến so với đối chứng Giống đối chứng không thấy có phân ly kiểu hình xuất phân ly dòng đột Ở dòng đối chứng không xuất phân ly kiểu hình giống chọn tạo ổn định di truyền Trong dạng hoa đột biến màu sắc có hai dạng có mầu gạch mầu vàng phân ly kiểu hình Hai dạng hoa mầu tím mầu tím hồng xuất phân ly hoa mầu tím tỷ lệ phân ly 1,05%, 78 Luận văn Thạc sĩ khoa học Lê Hải Hà hoa mầu tím hồng tỷ lệ phân ly 2,13% theo xu hướng quay trở với giống đối chứng ban đầu Trong số dòng đột biến có dòng hai dòng màu vàng gạch ổn định di truyền hệ M1V8 Các dạng đột biến tiếp tục đưa trở lại vào nuôi cấy in vitro để đánh giá độ ổn định di truyền hệ M1V12 Hình 4.15 Vườn trồng dòng đột biến hệ M1V8 79 Luận văn Thạc sĩ khoa học Lê Hải Hà PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1.KẾT LUẬN Trong liều chiếu xạ tia gamma nghiên cứu, liều chiếu xạ 3Krad có hiệu việc tạo đột biến cho giống nghiên cứu số số Tỷ lệ biến dị, nuôi cấy in vitro (M1V1) giống số 38,68% 32,65% giống số Trong dải nồng độ nghiên cứu, nồng độ EMS phù hợp 0,3% thời gian xử lý 1h giống số số Tỷ lệ biến dị, nuôi cấy in vitro (M1V1) giống số 53,14% 54,33% giống số Xử lý kép tác nhân tia gamma (3Krad) EMS (0,3% 1h) cho tỷ lệ biến dị cao nhất, nhiên dạng biến dị tạo lợi cho công tác chọn tạo giống Chọn lọc số dòng biến dị mầu sắc hoa có triển vọng hệ M1V4 (mầu tím, tím hồng từ giống sô giống gạch, mầu vàng từ giống số 6) Bước đầu khẳng định dạng biến dị chọn lọc đuợc dòng đột biến di truyền thị SSR Đánh giá độ ổn định di truyền dòng đột biến hệ M1V8: Dòng đột biến màu gạch vàng phân ly; Dòng đột biến mầu tím, tím hồng có tỷ lệ phân ly màu sắc 1,05% 2,13 5.2 ĐỀ NGHỊ - Tiến hành việc giải trình tự gen cho dòng đột biến để khẳng định xác đột biến phục vụ cho việc công nhận quyền giống - Hoàn thiện qui trình sản xuất giống cẩm chướng đột biến để áp dụng vào sản xuất 80 Luận văn Thạc sĩ khoa học Lê Hải Hà TÀI LIỆU THAM KHẢO I Tài liệu nước Đào Thanh Bằng, Nguyễn Hữu Đống, Mai Ngọc Toàn, Khuất Hữu Trung, Nguyễn Mỹ Giang, Ngô Hữu Tình (1997), “Nghiên cứu hiệu việc xử lý Ethylmethanesulphonate (EMS) ngô giống hệ M1 M2”, Kết nghiên cứu khoa học 1997-1998, viện Di truyền nông nghiệp, NXB Nông nghiệp, Hà Nội Đào Thanh Bằng, Nguyễn Thị Hồng Nhung, Nguyễn Thị phương Đoài “ nghiên cứu tạo cúc đột biến xử lý tia gamma” Hội nghị hạt nhân toàn quốc, Nha Trang tháng 08/2009 Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang (2007), Chọn giống trồng phương pháp truyền thống phân tử, NXB Nông nghiệp, Hà Nội Phạm Văn Duệ (2005), Giáo trình di truyền chọn giống trồng, NXB Nông nghiệp, Hà Nội Lê Sỹ Dũng (2001), “Kỹ thuật trồng hoa Cẩm chướng”, Báo cáo khoa học 1999 – 2000, Viện Di truyền Nông nghiệp, NXB Nông nghiêp, Hà Nội Đặng Văn Đông, Đinh Thế Lộc (2005), Công nghệ trồng hoa cho thu nhập cao, NXB Lao động – Xã hội, Hà Nội Nguyễn Hữu Đống, Phan Đức Trực, Nguyễn Văn Cương, Đào Thanh Bằng “Kết xử lý đột biến tia gamma kết hợp với xử lý hoá chất Diethylssulphat (DES) ngô nếp”, Kết nghiên cứu khoa học 1997-1998, viện Di truyền nông nghiệp, NXB Nông nghiệp, Hà Nội Nguyễn Văn Hiển ( 2000), Chọn giống trồng, NXB Giáo dục, Hà Nội Vũ Hoàng Hiệp (2008), Nghiên cứu nuôi cấy in vitro ảnh hưởng Ethyl Methane Sulfonate đến cẩm chướng nuôi cấy mô, Luận văn thạc sỹ nông nghiệp, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội 81 Luận văn Thạc sĩ khoa học Lê Hải Hà 10 Trần Hợp (1993), Cây cảnh, hoa Việt Nam NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội 11 Phạm Thành Hổ (2001), Di truyền học, NXB Giáo dục, Hà Nội 12 Kỷ hiếu hiệp hội hoa đa lạt trang 14,15 nhà xuất văn hoá dân tộc 12/2007 13 Nguyễn Xuân Linh CTV ‘‘Điều tra khả phát triển hoa khu vực miền Bắc Việt Nam’’, Tạp chí Nông nghiệp – Công nghiệp thực phẩm, số 2/1998 14 Nguyễn Thị Kim Lý, Nguyễn Xuân Linh (2005), Ứng dụng công nghệ sản xuất hoa, NXB Lao động, Hà Nội 15 Hoàng Quang Minh, Nguyễn Như Toản ‘‘Hiệu ứng chiếu xạ tia gamma (nguồn Co60) lên hạt lúa biến đổi di truyền M1, M2”, Di truyền học ứng dụng, số 1/2005 16 Vũ Như Ngọc (2005), Ứng dụng kỹ thuật hạt nhân sinh học nông nghiệp NXB Nông nghịêp, Hà Nội 17 Trần Duy Quý (1997), Các phương pháp chọn tạo giống trồng, NXB Nông nghiệp, Hà Nội 18 Lê Duy Thành (2001), Cơ sở di truyền chọn giống thực vật NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội 19 Trần Thượng Tuấn (2005), Giáo trình chọn tạo công tác giống trồng, Đại học Huế 20 Mai Quang Vinh, Trần Văn Lài cs ‘‘Kết chọn tạo giống đậu tương DT95’’, Nông nghiệp Công nghiệp thực phẩm, số 2/1998, trang 74-75 II Tài liệu nước 21 Aijaz A Wani, “Mutagenic Effectiveness and Efficiency of Gamma Rays, Ethyl Methane Sulphonate and their Combination Treatments in Chickpea (Cicer arietinum L.)”, Asian Journal of Plant Sciences, Year: 2009, Volume: 8, Issue: 4, Page No.: 318-321 82 Luận văn Thạc sĩ khoa học 22 Lê Hải Hà Botstein D, White RL, Skolnick M, Davis RW (1980) Contruction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms.Am.J.Hum.Genet.32,pp.314331 23 Caetano-Anolles G, Bassam BJ, Greshoff PM (1993) Enhanced detection of polymorphic ADN by mutiple arbitrary ampicón profoling of endonuclease digested ADN: identification of markers linked to the supernodulation locus in soybean Mol General Genet.241:57-64 24 Chontira Sangsiri,a Worawit Sorajjapinun,b and Peerasak Srinives “Gamma Radiation Induced Mutations in Mungbean” ScienceAsia 31 (2005): 251-255 25 Cox RJ (1987), “Carnation production in Kenya’’, Acta- Horticulture, No.216,p.43 26 Department of Health and Office of the Gene Technology Regulator (2005), The Biology and Ecology of Dianthus caryophyllus L (Canation) 27 Donnan RS (1998), ‘‘Carnation cropping in rockwool’’, International Society for Soilless Culture, Netherlands, 1998, p 117-134 28 D.M.U.B Dhanasekera (1998), Cut flower production in Srilankan, FAO, Bangkok, Thailand 29 Eldon John Gardner, Michael J.Simmons, D.Peter Snustad (1984), ‘‘Principles of Genetics’’, Inc Published simultaneously, Canada, No.I, pp 288-319 30 Grodzicker T, Williams J, Shap P, Sambrook J (1975) Physical mapping of temperature sensitive mutans of adenovirus Cold Spring Harbor Symp Quant Biol 39:439-446 31 Helentjaris T, Slocum M, Wright S, Schaefer A, (1986).Construction of genetic linkage maps in maize and tomato using restriction fragment length polymorphisms Theor Appl Genet 83 Nienhuis J Luận văn Thạc sĩ khoa học Lê Hải Hà 32 K Semagn, A Bjornstad, M.N Ndjondjop., 2006 An overview of molecular maker methos for plant African Journal of Biotechnology (25) 2540-2568 33 S.Y Lee, B.W Yae, K.S Kim, Segregation patterns of several morphological characters and RAPD markers in interspecific hybrids between Dianthus giganteus and D carthusianorum, , Department of Horticulture, Seoul National University, Seoul 151-742 34 Lynch M, Walsh B (1998) Genetics and analysis of quantitative traits Sinauer Associates, Sunderland, MA 35 M J M Smulders, Y Noordijk, W Rus Kortekaas, G M M Bredemeijer, B Vosman Microsatellite genotyping of carnation varieties TAG Theoretical and Applied Genetics, Vol 106, No (1 May 2003), pp 1191-1195 36 M S MKUYA1,2, SI Hua-min 1, LIU Wen-zhen 1, SUN Zong-xiu “Effect of 137Cs Gamma Rays to Panicles on Rice Anther Culture” Rice Science, 2005, 12(4): 299-302 299 37 M Okamura, N Yasuno, M Ohtsuka, A Tanaka, N Shikazono, Y Hase “Wide variety of flower-color and -shape mutants regenerated from leaf cultures irradiated with ion beams” Nuclear Instruments and Methods in Physics Research Section B: Beam Interactions with Materials and Atoms Volume 206, May 2003, Pages 574-578 38 Masafumi Yagi, Takashi Onozaki, Mitsuyasu Taneya, Hideki Watanabe, Tadahisa Yoshimura, Tsutomu Yoshinari, Yukiaki Ochiai and Michio Shibata (2006), ‘‘Construction of a Genetic Linkage Map for the Carnation by Using RAPD and SSR’’, J Japan Soc Hort Sci 75 (2): pp 166–172 39 Menguc A (1987), ‘‘Carnation growing and its problem in Turkey’’, Acta Horticulturae, No.216, p.23-28 40 Muhammad Rashid1*, Liu Ren-hu4, Jin Wei5, Xu Yong-han6, Wang Fu-lin7, Tao Yue-zhi8, Wang Jun-mei9, Akbar Ali Cheema2, Chen Jin-qing3** and 84 Luận văn Thạc sĩ khoa học Lê Hải Hà Guangyuan He10 “Genomic diversity among Basmati rice (Oryza sativa L) mutants obtained through 60Co gamma radiations using AFLP markers” African Journal of Biotechnology Vol (24), pp 6777-6783, 15 December 2009 41 Obara Okeyo P & S.Kako (1998), ‘‘Gennetic diversity and identification of cymbidium cultivars as measured by random amplìied polymorphic ADN (RAPD) marker’’, Euphytica, 99, pp.95-101 42 Pizano M (1987), ‘‘Carnation culture in Colombia : state in the art’’, Acta – Horticulturae, No.216, pp 29-34 43 Rohlf F.J., (2000), NTSYS – PC :Numerical Taxonomy anh Multivariate Analysis System, Exeter Sofware, New York 44 Singht K P.,Singh.B,Raghava “Induced flower colour mutations in carnation through in vitro application of chemical mutagen”The Indian Journal of Genetics and Plant Breeding,Year : 2000, Volume : 60, Issue : 45 Teresita L.(1998), Cut flower production in the Philippin, FAO, Bangkok, Thailand 46 Tetsuya Kimura1*, Masafumi Yagi2, Chikako Nishitani3, Takashi Onozaki2, Yoshiyuki Ban1 and Toshiya Yamamoto3 “Development of SSR Markers in Carnation (Dianthus caryophyllus)” J Japan Soc Hort Sci 78 (1): 115–123 2009 47 Tulmann Neto, Augusto “In vitro Mutation of Chrysanthemum (Dendranthema grandiflora Tzvelev) with Ethylmethanesulphonate (EMS) in Immature Floral Pedicels” Plant Cell, Tissue and Organ Culture, Volume 77, Number 1, April 2004 , pp 103-106(4) 48 Yang X., G Liu, L Zhu (1998), Cut flower production in China, FAO, Bangkok, Thailand.61 III Tài liệu từ website 85 Luận văn Thạc sĩ khoa học Lê Hải Hà 49 http://www.biomed.cas.cz/mbu/folia 50 http:// www.cat.inist 51 http://www.clst.cs.vn/AP/tapchitrongnuoc/kem/2001/tapchi10/4/tep4 6.htm 52 http://www.ingentaconect.com/content/klu/ticu 53 http//www-mvd,iaea.org 54 http:// www.rauhoaquavietnam.vn 55 http://www.soygenetics.org/articleFiles 56.http://www.jstage.jst.go.jp/browse/jjsh 57.http://vndgkhktnn.vietnamgateway.org/news.php 86 Luận văn Thạc sĩ khoa học Lê Hải Hà i ... tài Áp dụng thị phân tử để đánh giá đa dạng di truyền số dòng cẩm chướng sau xử lý đột biến tia gamma kết hợp EMS ” 1.2 Mục đích yêu cầu đề tài 1.2.1 Mục đích Áp dụng phương pháp đột biến phóng... triển sau xử lý điều kiện in vitro điều kiện tự nhiên để chọn lọc đột biến - Đánh giá đa dạng di truyền dòng cẩm chướng đột biến giống gốc thị SSR - Đánh giá độ ổn định di truyền dòng đột biến. .. độ EMS giảm mạnh kết hợp xử lý tia gamma EMS Tuy nhiên tỷ lệ biến dị xuất hiên nhiều xử lý kết hợp tia gamma EMS cao công thức tia gamma từ 30-45Krad + 0,2% EMS [56] Để đánh giá hiệu việc xử lý