SỬ DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ MICROSATELLITE ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÁC DÕNG KEO LÁ TRÀM

SỬ DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ MICROSATELLITE ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÁC DÕNG KEO LÁ TRÀM

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ******  ****** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP SỬ DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ MICROSATELLITE ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÁC DÕNG KEO LÁ TRÀM (Acacia auriculiformis) Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2007 Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học Niên khóa: 2003-2007 Sinh viên:Trần Thị Thanh Hƣơng BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ******  ****** SỬ DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ MICROSATELLITE ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÁC DÕNG KEO LÁ TRÀM (Acacia auriculiformis) Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS. VƢƠNG ĐÌNH TUẤN TRẦN THỊ THANH HƢƠNG Niên khóa: 2003-2007 Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2007 1 LỜI CẢM ƠN Con xin cảm ơn Ba Má cùng các anh chị trong gia đình đã nuôi dạy con đến ngày khôn lớn và cho con ăn học thành tài.  Chân thành cảm ơn! Trƣờng Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học Trƣờng Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. Phân viện nghiên cứu khoa học kĩ thuật lâm nghiệp Nam bộ Trung Tâm Công nghệ sinh học TP. Hồ Chí Minh. Đã tạo mọi điều kiện cho tôi học tập và hoàn thành luận án tốt nghiệp đúng tiến độ.  Chân thành cảm ơn! Tất cả các Thầy Cô đã tận tình chỉ bảo, truyền đạt kiến thức cho lớp chúng tôi trong thời gian học tập tại trƣờng Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh.  Chân thành cảm ơn! TS.Vƣơng Đình Tuấn TS. Nguyễn Quốc Bình Đã luôn tận tình giúp đỡ, hƣớng dẫn, động viên và tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt quá trình làm đề tài.  Chân thành cảm ơn! Chị Ngô Huỳnh Phƣơng Thảo và tất cả các anh, chị và các bạn lớp Công nghệ sinh học 29, đã không ngừng động viên giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiên đề tài. Xin chân thành tri ân! Sv: TRẦN THỊ THANH HƢƠNG 2 TÓM TẮT TRẦN THỊ THANH HƢƠNG, Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. Tháng 8/2007. “SỬ DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ MICROSATELLITE ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÁC DÕNG KEO LÁ TRÀM (Acacia auriculiformis)”. Hƣớng dẫn khoa học: TS.Vƣơng Đình Tuấn  Thời gian nghiên cứu Từ tháng 3/2007 đến 8/2007.  Địa điểm nghiên cứu Phân viện nghiên cứu khoa học kĩ thuật lâm nghiệp Nam Bộ . Trung tâm Công nghệ sinh học TP Hồ Chí Minh.  Mục đích nghiên cứu -Xác định đƣợc chỉ thị ADN phù hợp cho nghiên cứu đa đạng di truyền Keo lá tràm (Acacia auriculiformis). Từ đó xác định đƣợc mối quan hệ di truyền giữa các cá thể thu thập từ những xuất xứ khác nhau, có liên hệ đến tính trạng sinh trƣởng nhanh của các cá thể, góp phần phục vụ công tác chọn giống theo hƣớng chất lƣợng cao.  Yêu cầu - Xác định các cặp mồi để đánh giá đa dạng di truyền các dòng Keo lá tràm. - Tìm hiểu mối quan hệ di truyền của các dòng cây Keo lá tràm ở Việt Nam.  Phƣơng pháp nghiên cứu - Sử dụng kĩ thuật PCR để khuếch đại DNA ly trích từ mẫu lá của 100dòng Keo lá tràm thu đƣợc với 9cặp mồi.  Kết quả - Bƣớc đầu thanh lọc đƣợc một số cặp mồi SSR đƣợc sử dụng cho phân tích đa dạng di truyền. Và có sự khác nhau về trọng lƣợng các bands của các cá thể phân tích và có sự biến động di truyền giữa các cá thể.  Kết luận 3 - Thí nghiệm đã thanh lọc đƣợc một số cặp mồi (Am 341, Am 326 và Am 770) có thể cho hiệu quả phân tích đa dạng di truyền Keo lá tràm khá tốt. 4 MỤC LỤC ĐỀ MỤC TRANG TRANG TỰA . ii LỜI CẢM ƠN . iii TÓM TẮT . iv MỤC LỤC v DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT viii DANH SÁCH CÁC HÌNH . ix DANH SÁCH CÁC BẢNG VÀ SƠ ĐỒ . x Phần 1. MỞ ĐẦU . 1 1.1 Đặt vấn đề 1 1.2 Yêu cầu và mục đích nghiên cứu của đề tài . 2 1.4 Giới hạn của đề tài . 2 Phần 2. TỔNG QUAN . 4 2.1 Giới thiệu về đa dạng sinh học . 4 2.1.1 Định nghĩa . 4 2.1.2 Ý nghĩa của đa dạng sinh học . 4 2.1.3 Các phân mức về đa dạng sinh học . 4 2.1.3.1 Sự đa dạng về hệ sinh thái 4 2.1.3.2 Đa dạng loài . 5 2.1.3.3 Đa dạng về di truyền 6 2.2 Một số DNA marker sử dụng nghiên cứu sự đa dạng di truyền 7 2.2.1 Phân loại 7 2.2.2 Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) . 8 2.2.3 Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP) . 9 2.2.4 Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphism DNA) 10 2.2.5 SSR (Microsatellite) 10 5 2.3 Kỹ thuật Microsatellite . 11 2.3.1 Khái niệm về Microsatellite 11 2.3.2 Tính chất 12 2.3.3 Sự phát triển của primer Microsatellite . 13 2.3.4 Giới hạn của Microsatellite . 14 2.3.5 Các loại Microsatellite 15 2.3.6 Cơ chế hình thành và vai trò của Microsatellite . 15 2.3.6.1 Cơ chế hình thành Microsatellite 15 2.3.6.2 Vai trò của Microsatellite . 17 2.3.7 Các phƣơng pháp phát hiện Microsatellite . 18 2.3.7.1 Phƣơng pháp lai . 18 2.3.7.2 Phƣơng pháp PCR 19 2.4 Polymerase Chain Reaction (PCR) 19 2.4.1 Khái niệm 19 2.4.2 Thành phần và vai trò của các chất trong phản ứng PCR . 20 2.4.4 Ứng dụng của kỹ thuật PCR 23 2.4.5 Ƣu và nhƣợc điểm của kỹ thuật PCR 23 2.5 Quy trình ly trích DNA thực vật 23 2.5.1 Định lƣợng DNA bằng phƣơng pháp quang phổ 25 2.5.2 Định tính DNA ly trích bằng phƣơng pháp điện di 26 2.6 Tổng quan về cây Keo lá tràm (Acacia auriculiformis) 28 2.6.1 Vài nét về chi Keo (Acacia) 28 2.6.1.1 Đặc điểm sinh học của các loài Keo 28 2.6.1.2 Công dụng của các loài Keo (Acacia) 30 2.6.2 Vài nét về cây Keo lá tràm (Acacia auriculiformis A. Cunn ex Benth) 32 2.6.2.1 Các đặc điểm sinh học và sinh thái 33 2.6.2.2 Công dụng và tiềm năng gây trồng 35 Phần 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP . 36 6 3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện . 36 3.1.1 Thời gian thực hiện . 36 3.1.2 Địa điểm thực hiện . 36 3.2 Vật liệu thí nghiệm . 36 3.3 Phƣơng pháp thí nghiệm 36 3.4 Thiết bị và dụng cụ . 37 3.5 Ly trích DNA . 37 3.5.1 Hóa chất . 37 3.5.2 Quy trình ly trích DNA . 38 3.5.3 Kiểm tra sản phẩm DNA ly trích . 40 3.6.1 Qui trình phản ứng PCR 40 3.6.2 Điện di sản phẩm PCR 42 Phần 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 44 4.1 Quá trình ly trích . 44 4.2 Phản ứng PCR 44 Phần 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ . 48 5.1 Kết luận 48 5.2 Đề nghị . 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 PHỤ LỤC 7 DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT  µg: microgram  µM: micromol/lite  Al: Allele  bp: base pair  M:mét  cm: centimét  CTAB: Cetyltrimethylammonium bromide  DNA: Deoxyribonucleic acid  dNTP: Deoxynucleotide triphosphate  EDTA: Ethylene diaminetetra acetic acid  EtBt: Ethidium bromide  Kb: kilobases  mM: milimolar (milimol/lite).  PCR: Polymerase chain reaction  RNA: Ribonucleic acid  RNase: Ribonuclease  SSR: Single sequence repeat  Ta : Annealing temperature (nhiệt độ bắt cặp)  TAE: Tris-glacial acetic acid- ethylenne diamine tetra acetic acid  TE: Tris-EDTA (ethylenne diamine tetra acetic acid)  Tm: Melting temperature (nhiệt độ nóng chảy)  U: Đơn vị hoạt tính của Taq  UV: Ultra Violet 8 DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1: Cơ chế bắt chéo lỗi trong giảm phân . 16 Hình 2.2: Cơ chế trƣợt lỗi trong quá trình sao mã . 16 Hình 2.3:Nguyên tắc cơ bản của phản ứng PCR . 20 Hình 2.4: Hình thái lá các loài Keo(Acacia) 29 Hình2.5:Hình thái một số loài Keo 30 Hình 2.6. Keo lá tràm . 33 [...]... xây dựng và bảo vệ sự đa dạng loài là rất cần thiết 2.1.3.3 Đa dạng về di truyền Đa dạng di truyền là phân mức cơ bản nhất trong đa dạng sinh học Đa dạng di truyền thể hiện qua sự khác nhau của tất cả các gen di truyền của tất cả các cá thể thực vật, động vật, nấm, và vi sinh vật Đa dạng di truyền là sự đa dạng về thành phần gen giữa các cá thể tồn tại trong cùng một loài và giữa các loài khác nhau (http://www.nea.gov.vn/html/DDDT)... Xác định các cặp mồi để đánh giá đa dạng di truyền các dòng Keo lá tràm - Tìm hiểu mối quan hệ di truyền của các dòng cây Keo lá tràm ở Việt Nam 1.4 Giới hạn của đề tài Do quỹ thời gian và kinh phí còn hạn chế nên chúng tôi mới chỉ dừng lại ở việc thanh lọc các cặp mồi SSR để tìm ra những cặp mồi thích hợp cho những nghiên cứu tiếp theo trong việc hoàn thiện đánh giá đa dạng di truyền Keo lá tràm Và... việc sử dụng nguồn tài nguyên thực vật một cách có hiệu quả hơn để cải thiện giống cây trồng, phục vụ tốt hơn công tác quản lí và bảo tồn đa dạng sinh học, rút ngắn thời gian của quá trình chọn, tạo giống phục vụ cho công tác trồng rừng Nhằm góp phần đánh giá tính đa dạng di truyền của các dòng Keo lá tràm (Acacia auriculiformis) ở Việt Nam, đề tài Đánh giá tính đa dạng di truyền của các dòng Keo lá tràm. .. (http://www.nea.gov.vn/html/DDDT) Đa dạng di truyền tạo nên sự khác biệt giữa các cá thể trong quần thể.Xét cho cùng, đa dạng di truyền chính là sự biến dị của sự tổ hợp trình tự của bốn cặp bazơ cơ bản, thành phần của axit nucleic, tạo thành mã di truyền Nghiên cứu về đa dạng di truyền là các nghiên cứu cơ bản và chính xác nhất sự khác biệt về loài Sự đa dạng về mặt di truyền trong loài chịu ảnh hƣởng bởi tập tính sinh sản của các. .. những giống vật nuôi đa dạng, nhƣng do chỉ tiêu chọn thuộc về hình thái, chủ yếu về kiểu hình và chỉ tiêu sinh hóa thƣờng không ổn định và chịu ảnh hƣởng rất mạnh bởi môi trƣờng Sử dụng chỉ thị phân tử (DNA marker) để chọn giống sẽ bỏ qua các biến động không di truyền đồng thời theo dõi đƣợc các biến động di truyền không thể hiện ra kiểu hình Hiểu biết về cấu trúc di truyền phân tử sẽ giúp chúng ta... công nghệ Đa dạng sinh học là nguồn tạo ra năng suất và tính bền vững trong nông nghiệp Ngoài ra đa dạng sinh học giúp duy trì các dịch vụ sinh thái quan trọng từ đó tạo cơ sở ổn định kinh tế và các hệ thống chính trị, xã hội và làm giàu chất lƣợng cuộc sống của chúng ta 2.1.3 Các phân mức về đa dạng sinh học 2.1.3.1 Sự đa dạng về hệ sinh thái Đây là sự đa dạng bao trùm và cao nhất của đa dạng sinh... Sequence Repeat (Microsatellite) SSCP Single Strand Conformation Polymorphism RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism SNP Single Nucleotide Polymorphism STS Sequence-Tagged Sites 2.2.2 Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) Ngay từ klhi ra đời, RFLP một chỉ thị phân tử rất hữu dụng trong việc đánh giá đa dạng di truyền RFLP đƣợc định nghĩa là tính đa hình chiều dài các phân đoạn cắt giới... liệu mang thông tin di truyền đƣợc cấu tạo bởi nucleotide, là yếu tố mở đầu cho mọi nghiên cứu và ứng dụng sinh học phân tử, trong đó bao gồm các nghiên cứu tính đa dạng di truyền trong quần thể Để có thể tiến hành các thí nghiệm phân tích sâu hơn thì việc thu nhận một lƣợng DNA lớn và sạch là điều kiện đầu tiên Đối với tách chiết DNA thì mối quan tâm hàng đầu là thu nhận đƣợc các phân tử này ở trạng thái... (tính đa dạng về mặt di truyền trong một loài) và đa dạng sinh thái (số lƣợng các loài trong một quần xã sinh vật) Đa dạng sinh học (Biodiversity) là sự giàu có, phong phú và đa dạng về nguyên liệu di truyền, về loài và các hệ sinh thái (Lê Trọng Cúc, 2002) Quỹ bảo tồn thiên nhiên thế giới – WWF (1989) đề xuất định nghĩa: “ Đa dạng sinh học là sự phồn thịnh của sự sống trên Trái đất, là hàng triệu loài... ra các đoạn có kích thƣớc khác nhau, có khi lên tới 2 kb Các đoạn với kích thƣớc khác nhau này đƣợc nhận biết bằng điện di Một primer có thể tạo nên sự đa hình DNA giữa các cá thể và các đoạn đa hình này có thể đƣợc dùng nhƣ những marker để xác định sự đa dạng di truyền RAPD đƣợc xem nhƣ một phƣơng pháp tạo sự đa hình DNA nhanh và hữu hiệu Các bộ kit primer dùng cho RAPD đã đƣợc thƣơng mại hóa trên thị . SỬ DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ MICROSATELLITE ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÁC DÕNG KEO LÁ TRÀM (Acacia auriculiformis) Giáo viên hƣớng. 2.1.3.3 Đa dạng về di truyền Đa dạng di truyền là phân mức cơ bản nhất trong đa dạng sinh học. Đa dạng di truyền thể hiện qua sự khác nhau của tất cả các