Sử dụng chỉ thị phân tử SSR đánh giá sự đa dạng di truyền tập đoàn nấm mốc Aspergillus oryzae

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI          NGUYỄN THỊ THU PHƯƠNG SỬ DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ SSR ðÁNH GIÁ SỰ ðA DẠNG DI TRUYỀN TẬP ðOÀN NẤM MỐC Aspergillus oryzae LUẬN VĂN THẠC SĨ HÀ NỘI - 2013 Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ii BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI          NGUYỄN THỊ THU PHƯƠNG SỬ DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ SSR ðÁNH GIÁ SỰ ðA DẠNG DI TRUYỀN TẬP ðOÀN NẤM MỐC Aspergillus oryzae CHUYÊN NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Mà SỐ : 60.42.02.01 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC : TS. ðẶNG XUÂN NGHIÊM HÀ NỘI - 2013 Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp i LỜI CAM ðOAN Tôi xin cam ñoan rằng số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và không trùng lặp với các ñề tài khác. Tôi cũng xin cam ñoan rằng các thông tin trích dẫn trong luận văn ñều ñược ghi rõ nguồn gốc. Học viên Nguyễn Thị Thu Phương Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ii LỜI CẢM ƠN Luận văn này ñược thực hiện tại phòng thí nghiệm bộ môn Công nghệ Vi sinh và Sinh học phân tử, Khoa Công nghệ Sinh học, trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội. ðể hoàn thành ñược luận văn này tôi ñã nhận ñược rất nhiều sự ñộng viên, giúp ñỡ của nhiều cá nhân và tập thể. Trước hết, tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và kính trọng tới TS. ðặng Xuân Nghiêm, người ñã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn tôi hoàn thành luận văn này. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Ks. Nguyễn Ngọc Hòa, Ks. Nguyễn Ngọc Chỉnh, Ks. Nguyễn Khắc Hải, Ks. ðỗ Hải Quỳnh ñã nhiệt tình giúp ñỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu. Tôi xin gửi lời cảm ơn ñến Ban Giám hiệu, Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ Sinh học, Ban Quản lý ðào tạo sau ñại học, các Thầy Cô giáo Khoa Công nghệ Sinh học Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội, ñã tạo mọi ñiều kiện và giúp ñỡ tôi trong suốt 2 năm học tập và nghiên cứu. Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc ñến gia ñình, bạn bè, ñồng nghiệp ñã luôn ñộng viên và khuyến khích tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Hà Nội, ngày 12 tháng 09 năm 2013 Học viên Nguyễn Thị Thu Phương Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp iii Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp iv MỤC LỤC Lời cam ñoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iv Danh mục bảng vi Danh mục hình vii Danh mục viết tắt viii TÓM TẮT 1 MỞ ðẦU 2 1. ðặt vấn ñề 2 2. Mục ñích, yêu cầu của ñề tài 3 2.1. Mục ñích của ñề tài 3 2.2. Yêu cầu của ñề tài 3 Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 1.1. Nấm mốc A. oryzae 4 1.1.1. ðặc ñiểm của A. oryzae 4 1.1.2. Ứng dụng 5 1.2. Protease nấm mốc 6 1.2.1. Một số yếu tố ảnh hưởng ñến quá trình sinh tổng hợp protease 6 1.2.2. Ứng dụng của protease nấm mốc 11 1.3. Tổng quan về SSRs (Simple sequence repeats) 13 1.3.1. Khái niệm 13 1.3.2. Phân loại SSRs 13 1.3.3. ðặc ñiểm di truyền của SSRs 14 1.3.4. Cơ chế tạo ñột biến của SSRs 15 1.3.5. Phân bố của SSRs 15 1.3.6. Vai trò của SSRs 16 1.3.7. Các phương pháp phát hiện các trình tự SSRs 17 1.3.8. Phân tích trình tự SSRs 18 1.4. Những nghiên cứu trong nước và trên thế giới liên quan ñến ñề tài 19 Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp v Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1. Vật liệu, ñịa ñiểm và thời gian nghiên cứu 22 2.1.1. Vật liệu 22 2.1.2. ðịa ñiểm và thời gian nghiên cứu 25 2.2. Phương pháp nghiên cứu 26 2.2.1. Phân lập và nhận diện nấm A. oryzae dựa trên ñặc ñiểm hình thái 26 2.2.2. Phát hiện các trình tự SSRs bằng phầm mềm tin sinh học 26 2.2.3. Thiết kế mồi bằng tiện ích của Workbench 3.2 26 2.2.4. Tách chiết DNA tổng số 27 2.2.5. Phản ứng PCR kiểm tra sự ña hình ở các locus SSR 27 2.2.6. Phân tích kết quả 27 2.2.7. Khảo sát pH tối thích của các enzyme protease ngoại bào của các isolate A. oryzae bằng phương pháp khuyếch tán ñĩa thạch. 28 2.2.8. Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của nhiệt ñộ ñến hoạt ñộ của enzyme 28 Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29 3.1. Kết quả phân lập chủng nấm mốc A. oryzae 29 3.2. Hệ SSR của Aspergillus oryzae và mồi nhân dòng các locus SSR tiềm năng 32 3.3. Kết quả lựa chọn và thiết kế mồi cho các ñoạn SSR tiềm năng 37 3.4. Khảo sát sự ña hình của 19 locus SSR 40 3.4.1. Khảo sát ñánh giá mức ñộ ña hình của các locus SSR 40 3.4.2. Khảo sát mức ñộ tương ñồng di truyền của các chủng Aspergillus oryzae 42 3.5. Khảo sát ảnh hưởng của pH và ñộ bền nhiệt của enzyme protease của nấm mốc 44 3.5.1. Khảo sát ảnh hưởng của pH ñến hoạt tính của protease 44 3.5.2. Khảo sát ñộ bền nhiệt của protease 47 KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 50 1. Kết luận 50 2. ðề nghị 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO 51 Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp vi DANH MỤC BẢNG STT Tên bảng Trang 1.1 Các yếu tố thích hợp cho sự tổng hợp enzyme của A. oryzae 8 2.1 Danh sách các chủng nấm mốc sử dụng trong nghiên cứu trong ñề tài 22 2.2 Danh mục máy móc sử dụng trong ñề tài 24 2.3 Danh mục hóa chất sử dụng trong ñề tài 25 3.1 Một số ñặc ñiểm hình thái sai khác giữa các chủng nấm mốc 30 3.2 Sự phân bố của các locus SSR trên từng NST của A. oryzae 33 3.3 Phân loại SSR theo dạng lặp ở nấm mốc 34 3.4 Phân loại SSR theo mức ñộ hoàn hảo ở nấm mốc 35 3.5 Phân loại SSR dựa theo chiều dài ñoạn lặp ở nấm mốc 36 3.6 Danh sách 19 mồi nhân dòng các locus SSR ứng viên 38 3.7 Kết quả khảo sát sự ña hình của từng locus SSR 40 3.8 Hoạt tính của protease ngoại bào ở các pH khác nhau 45 Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp vii DANH MỤC HÌNH STT Tên hình Trang 1.2 Cấu trúc bộ gene của Aspergillus oryzae (Machida và cs., 2005). 5 3.1 Hình thái tế bào và khuẩn lạc của một số chủng nấm mốc A. oryzae 32 3.2 Thành phần hệ SSR của A. oryzae theo score 37 3.3 Kết quả sản phẩm SSR của locus AoIV1.1 trên gel agarose 2,5% 41 3.4 Kết quả sản phẩm SSR của locus AoVIII 1.2 trên gel agarose 2,5% M: thang chuẩn DNA 100Kb 41 3.5 Sơ ñồ hình cây về mức ñộ tương ñồng di truyền dựa trên 19 trình tự SSR của 27 isolate A. oryzae. Thang trục hoành chỉ hệ số tương ñồng (coefficient). 43 3.6 Hoạt tính của protease ở các pH khác nhau 47 3.7 Kết quả bền nhiệt của protease ngoại bào ở một số chủng A. oryzae ở các mức nhiệt ñộ khác nhau: a: 30 0 C, b: 45 0 C, c: 60 0 C, d: 75 0 C, e: 90 0 C 48 3.8 Hoạt ñộ tương ñối của protease ngoại bào sau khi xử lý ở các nhiệt ñộ khác nhau 49 Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp viii DANH MỤC VIẾT TẮT A. oryzae : Aspergillus oryzae A. kawachii : Aspergillus kawachii A. flavus : Aspergillus flavus A. fumigatus : Aspergillus fumigatus A. nidulans : Aspergillus nidulans A. niger : Aspergillus niger AFLP : Amplified fragment length polymorphism Bp : Base pair DNA : Deoxyribonucleic acid EDTA : Ethylendiamin Tetraacetic Acid Kb : Kilo base Mb : Mega base pair NCBI : National Center for Biotechnology Information NST : Nhiễm sắc thể NXB : Nhà xuất bản PCR : Polymerase chain reaction PDA : Potato dextrose agar RNA : Ribonucleic acid RFLP : Restriction fragment length polymorphism [...]... Hưng Yên Aspergillus section Flavi Aspergillus section Flavi Aspergillus section Flavi Aspergillus section Flavi Aspergillus section Flavi Aspergillus section Flavi Aspergillus section Flavi Aspergillus section Flavi Aspergillus section Flavi Trư ng ð i H c Nông Nghi p Hà N i – Lu n văn th c sĩ khoa h c nông nghi p A oryzae A oryzae A oryzae A oryzae A oryzae A oryzae A oryzae A oryzae A oryzae 23... -/section Aspergillus section Flavi Aspergillus section Flavi Aspergillus section Flavi Aspergillus section Flavi Aspergillus section Flavi Aspergillus section Flavi Aspergillus section Flavi Aspergillus section Flavi Aspergillus section Flavi Aspergillus section Flavi Aspergillus section Trư ng ð i H c Nông Nghi p Hà N i – Lu n văn th c sĩ khoa h c nông nghi p Loài (sơ b ) A oryzae A oryzae A oryzae A oryzae. .. locus SSR, ch n l c t p h p các locus SSR ña hình, ñánh giá ñư c m i quan h di truy n gi a các ch ng A oryzae Thu ñư c d ch thô enzyme ngo i bào và ñánh giá ñư c ñ c ñi m protease c a các ch ng n m m c A oryzae phân l p ñư c Trư ng ð i H c Nông Nghi p Hà N i – Lu n văn th c sĩ khoa h c nông nghi p 3 Chương 1 T NG QUAN TÀI LI U 1.1 N m m c A oryzae 1.1.1 ð c ñi m c a A oryzae A oryzae thu c chi Aspergillus, ... oryzae A oryzae A oryzae A oryzae A oryzae A oryzae A oryzae 22 TT Kí hi u M u ð a ñi m 12 M64 M c tương M Hào – Hưng Yên 13 M65 M c tương Yên Nhân – Hưng Yên 14 M66 M c tương B c Ninh 15 M67 M c tương Thái Nguyên 16 M71 M c tương M Hào - Hưng Yên CS SX Tri u Sơn - m c tương CS SX Hư ng ð t-M c tương Chi -/section Flavi Aspergillus section Flavi Aspergillus section Flavi Aspergillus section Flavi Aspergillus. .. Aspergillus section Flavi Aspergillus section Flavi Aspergillus section Flavi Aspergillus section Flavi Aspergillus section Flavi Loài (sơ b ) A oryzae A oryzae A oryzae A oryzae A oryzae TT B n – M Hào Hưng Yên Aspergillus section Flavi A oryzae TT B n – M Hào Hưng Yên Aspergillus section Flavi A oryzae 17 M72 18 M73 19 M74 M c tương Thanh Oai Hà N i 20 M75 M c tương Thanh Oai Hà N i 21 M76 M c tương... c phân t thay th các phương pháp truy n th ng ñ phân bi t gi a các loài Aspergillus khác nhau ð ng th i nghiên c u chi ti t h genome c a các loài Aspergillus khác nhau nh m m c ñích b tr cho phương pháp phân lo i b ng sinh h c phân t và nh ng nghiên c u khác Năm 1987, Klick và Mullaney ñã phân tích trình t 18S rDNA, 5,8S rDNA ñ s d ng làm công c h u ích cho s phân bi t s khác bi t gi a các loài Aspergillus. .. Aspergillus oryzae Nh ng công vi c chính trong ñ tài bao g m phân l p các ch ng n m m c Aspergillus oryzae t nhi u ngu n khác nhau (m u men rư u, m u m c tương, m u h t m c các lo i); kh o sát v m t hình thái qua ñó sơ b ñ nh danh và so sánh ñ c ñi m hình thái c a các ch ng.; nghiên c u c u trúc h SSR c a A oryzae t ñó xác ñ nh t p h p các locus SSR có ti m năng ña hình, ñánh giá s ña d ng di truy n... cs., 1996) cũng như m i liên quan ki u hình SSR v i các ñ c ñi m h enzyme protease c a nhóm vi sinh v t này Chính vì v y chúng tôi ti n hành nghiên c u ñ tài: “S d ng ch th phân t SSR ñánh giá s ña d ng di truy n t p ñoàn n m m c Aspergillus oryzae 2 M c ñích, yêu c u c a ñ tài 2.1 M c ñích c a ñ tài M c ñích c a ñ tài là nghiên c u c u trúc h SSR c a n m m c A oryzae d a trên các công c tin sinh h c... kh năng phân gi i protein và ch t lư ng s n ph m cho giá tr dinh dư ng cao, an toàn Tuy nhiên chưa có nhi u các nghiên c u ch ra m i liên h gi a s khác bi t v ki u locus SSR và h enzyme protease ngo i bào c a chúng ð hi u rõ hơn ti m năng sinh enzyme ngo i bào c a nhóm n m m c này m t cách có h th ng chúng tôi ñã ti n hành: “S d ng ch th phân t SSR ñánh giá s ña d ng di truy n t p ñoàn n m m c Aspergillus. .. ñư c b m i thích h p không h d dàng vì SSRs ph i ñư c phân l p trư c (Hà Vi t Cư ng, 2009) Trư ng ð i H c Nông Nghi p Hà N i – Lu n văn th c sĩ khoa h c nông nghi p 18 Các bư c chính trong phân tích trình t SSRs bao g m: 1 Xây d ng thư vi n SSRs 2 Xác ñ nh locus SSRs duy nh t 3 Xác ñ nh vùng thích h p ñ thi t k m i 4 Th PCR 5 ðánh giá và di n gi i các băng 6 ðánh giá s n ph m PCR t o s ña hình (Hà Vi . enzyme ngoại bào của nhóm nấm mốc này một cách có hệ thống chúng tôi ñã tiến hành: Sử dụng chỉ thị phân tử SSR ñánh giá sự ña dạng di truyền tập ñoàn nấm mốc Aspergillus oryzae . Những công việc.          NGUYỄN THỊ THU PHƯƠNG SỬ DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ SSR ðÁNH GIÁ SỰ ðA DẠNG DI TRUYỀN TẬP ðOÀN NẤM MỐC Aspergillus oryzae CHUYÊN NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH. nấm mốc 30 3.2 Sự phân bố của các locus SSR trên từng NST của A. oryzae 33 3.3 Phân loại SSR theo dạng lặp ở nấm mốc 34 3.4 Phân loại SSR theo mức ñộ hoàn hảo ở nấm mốc 35 3.5 Phân loại SSR