Nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử phát hiện nguồn QTLs/gen chịu hạn trong tập đoàn các giống lúa

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI LÊ THỊ THANH NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ PHÁT HIỆN NGUỒN QTLs/GEN CHỊU HẠN TRONG TẬP ðOÀN CÁC GIỐNG LÚA LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60.42.80 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS PHAN HỮU TÔN HÀ NỘI - 2013 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… i LỜI CAM ðOAN - Tôi xin cam ñoan rằng, số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn là hoàn toàn trung thực và chưa ñược sử dụng ñể bảo vệ một học vị nào. - Tôi xin cam ñoan rằng, mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện luận văn ñã ñược cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn ñều ñược chỉ rõ nguồn gốc. Tác giả luận văn Lê Thị Thanh Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… ii LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và chân thành ñến PGS.TS. Phan Hữu Tôn, Bộ môn Công nghệ sinh học, trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội ñã tận tình giúp ñỡ, hướng dẫn tôi trong việc ñịnh hướng ñề tài cũng như trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám ñốc và tập thể cán bộ công nhân viên trong Bộ môn Công nghệ sinh học, các thành viên trong nhóm lúa hạn thuộc bộ môn Chọn giống lúa cho vùng khó khăn, trung tâm nghiên cứu và phát triển lúa thuần, Viện Cây lương thực và Cây thực phẩm, Liên Hồng, Gia Lộc, Hải Dương ñã giúp ñỡ, tạo moi ñiều kiện về vật chất và thời gian ñể tôi hoàn thành ñề tài và khóa học. Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Hoàng Bá Tiến chủ nhiệm ñề tài “Nghiên cứu chọn tạo giống lúa chịu hạn bằng chỉ thị phân tử cho các tỉnh phía Bắc” và PGS.TS Nguyễn ðức Thành, Bộ môn di truyền thực vật, Viện Công nghệ sinh học ñã tạo mọi ñiều kiện giúp ñỡ tôi hoàn thành nội dung nghiên cứu. Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể các thầy cô giáo trong Viện sau ñại học, Bộ môn Công nghệ sinh học – Khoa Công nghệ sinh học – Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội ñã tạo mọi ñiều kiện thuận lợi, giúp ñỡ tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện ñề tài. Qua ñây, tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia ñình, người thân, bạn bè, là những người luôn ủng hộ tôi trong suốt quá trình học tập và thực tập tốt nghiệp. Tác giả luận văn Lê Thị Thanh Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… i MỤC LỤC Lời cam ñoan i Lời cảm ơn ii Mục lục i Danh mục các chữ viết tắt iv Danh mục bảng v Danh mục hình vi I MỞ ðẦU 1 1.1 ðặt vấn ñề 1 1.2 Mục ñích 2 1.3 Yêu cầu 2 1.4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của ñề tài 2 1.4.1 Ý nghĩa khoa học của ñề tài 2 1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn của ñề tài 2 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 2.1 ðại cương về cây lúa 3 2.2 Tính chịu hạn 4 2.2.1 Tác hại của hạn 4 2.2.2 Cơ chế chịu hạn 5 2.3 Một số phương pháp chọn tạo giống thực vật ñược sử dụng 21 2.3.1 Chọn giống theo phương pháp truyền thống 21 2.3.2 Chọn giống bằng Công nghệ sinh học 22 2.3.3 Những phương pháp tiến hành MAS 32 2.3.4 Những thành tựu và triển vọng MAS 34 2.4 Những kết luận rút ra từ nghiên cứu tổng quan 44 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 45 3.1 Vật liệu nghiên cứu 45 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… ii 3.1.1 Vật liệu nghiên cứu 45 3.1.2 ðịa ñiểm nghiên cứu 45 3.1.3 Thời gian nghiên cứu 45 3.2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 45 3.2.1 Nội dung nghiên cứu 45 3.2.2 Phương pháp nghiên cứu 46 3.2.3 Phương pháp phân tích và xử lý số liệu 53 3.2.4 ðiều kiện môi trường tiến hành thí nghiệm 53 4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 54 4.1 Kết quả ñánh giá khả năng chịu hạn nhân tạo 54 4.1.2 ðánh giá khả năng chống chịu hạn trong ñiều kiện ñồng ruộng (nhờ nước trời) 58 4.2 Kết quả ñánh giá ñặc trưng bộ rễ các dòng, giống lúa tham gia thí nghiệm 61 4.3 ðánh giá một số ñặc trưng nông học của các dòng, giống lúa thí nghiệm 64 4.3.1 ðánh giá một số ñặc ñiểm hình thái của các dòng, giống 64 4.3.2 Chiều cao cây lúa và khả năng ñẻ nhánh của các dòng, giống tham gia thí nghiệm ở hai ñiều kiện môi trường 68 4.3.3 ðặc ñiểm lá ñòng của các dòng, giống lúa tham gia thí nghiệm 70 4.3.4 ðặc ñiểm bông và hạt của các dòng, giống tham gia thí nghiệm ở cả hai ñiều kiện môi trường 72 4.3.5 Ảnh hưởng của ñiều kiện môi trường ñến thời gian sinh trưởng của các dòng, giống lúa tham gia thí nghiệm 74 4.4 Khả năng chống chịu sâu bệnh và chống ñổ của các dòng, giống thí nghiệm 77 4.5 Các yếu tố cấu thành năng suất và năng suất 79 4.6 Xác ñịnh một số dòng/giống có khả năng chịu hạn bằng chỉ thị SSR liên kết với QTLs/gen kiểm soát tính trạng hình thái rễ có lợi cho khả năng chịu hạn. 83 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… iii 4.6.1 Kiểm tra ñộ nguyên vẹn và tinh sạch DNA của các dòng, giống lúa nghiên cứu 83 4.6.2 Tính chịu hạn của các dòng, giống ñược phát hiện với các chỉ thị RM250, RM270, RM221 và RM167 84 5 KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 88 5.1 Kết luận 88 5.2 ðề nghị 88 TÀI LIỆU THAM KHẢO 90 PHỤ LỤC 98 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… iv DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT CH : Chịu hạn TGST : Thời gian sinh trưởng SSR : Sequence single repeat (trình tự lặp lại ñơn giản) S.E.S : Hệ thống ñánh giá tiêu chuẩn trên cây lúa IRRI : Viện nghiên cứu lúa quốc tế STT : Số thứ tự Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… v DANH MỤC BẢNG STT Tên bảng Trang 3.1 Số liệu khí tượng vùng tiến hành thí nghiệm vụ mùa 2012 53 4.1 Giá trị chọn lọc về khả năng chịu hạn ở giai ñoạn nảy mầm và giai ñoạn 3 lá 55 4.2 Chỉ số chọn lọc của 21 giống phù hợp nhất với hướng chọn lọc 57 4.3 Khả năng chịu hạn của các dòng, giống lúa ở một số giai ñoạn gặp hạn trong ñiều kiện nước trời tại Gia Lộc, Hải Dương, vụ mùa 2012 59 4.4 Chiều dài bộ rễ, số lượng rễ chính và khối lượng bộ rễ trong thí nghiệm hộp rễ (60 ngày sau mọc) 63 4.5 Một số ñặc ñiểm hình thái của các dòng, giống lúa tham gia thí nghiệm tại Gia Lộc – Hải Dương, vụ mùa 2012 66 4.6 Chiều cao cây cuối cùng và khả năng ñẻ nhánh của các dòng, giống lúa ở hai ñiều kiện môi trường 68 4.7 ðặc ñiểm lá ñòng của các dòng, giống lúa thí nghiệm ở hai ñiều kiện môi trường 71 4.8 Chiều dài bông, chiều dài cổ bông và khối lượng 1000 hạt ở hai ñiều kiện môi trường 74 4.9 Thời gian sinh trưởng của các dòng, giống lúa tham gia thí nghiệm ở cả hai môi trường 76 4.10 Khả năng chống chịu sâu bệnh hại chính và ñiều kiện bất thuận của các dòng, giống lúa tại Gia Lộc, Hải Dương, vụ mùa 2012 78 4.11 Các yếu tố cấu thành năng suất và năng suất của các dòng, giống lúa thí nghiệm ở hai ñiều kiện môi trường tại Gia Lộc, Hải Dương, vụ mùa 2012 82 4.12 ðộ tinh sạch DNA chiết tách 83 4.13 Bảng Score kiểu hình và kiểu gen về tính chịu hạn của 21 giống nghiên cứu 86 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… vi DANH MỤC HÌNH STT Tên hình Trang Hình 1. Ảnh ñiện di kiểm tra ñộ nguyên vẹn DNA chiết tách 83 Hình 2. Sản phẩm PCR với mồi RM 221 vơi 21 giống lúa thí nghiệm trên gel polyacrylamide: 1-21: giống G1-G21; M. Marker 85 Hình 3. Sản phẩm PCR với mồi RM 242 với 21 giống lúa thí nghiệm trên gel polyacrylamide: 1-21: giống G1-G21 85 Hình 4. Sản phẩm PCR với mồi RM 167 với 21 giống lúa thí nghiệm trên gel polyacrylamide: 1-21: giống G1-G21 85 Hình 5. Biểu ñồ quan hệ di truyền giữa các dòng và giống lúa nghiên cứu. 87 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 1 I. MỞ ðẦU 1.1. ðặt vấn ñề Tình hình thời tiết diễn biến phức tạp do sự phá hủy môi trường sống nhất là trong những năm gần ñây ñã gây nên tình trạng lũ lụt gây ngập úng, hoặc hạn hán kéo dài ở nhiều nơi ñã ảnh hưởng rất lớn ñến năng suất cây trồng, gây nhiều khó khăn cho sản xuất nông nghiệp. Thêm vào ñó, hàng năm trên thế giới diện tích ñất trồng trọt bị hạn ngày một gia tăng. Hạn là một yếu tố ảnh hưởng rất lớn ñến năng suất cây trồng và an ninh lương thực, ñặc biệt là ảnh hưởng ñến kinh tế - xã hội ở các nước ñang phát triển. Hạn ñược xếp vào yếu tố chính gây thiệt hại ñến năng suất lúa so với các yếu tố môi trường bất lợi khác, kể cả sâu bệnh hại. Vì thế việc chọn tạo các giống lúa chịu hạn có khả năng sử dụng nước hiệu quả, sinh trưởng tốt trong ñiều kiện khắc nghiệt và cho năng suất ổn ñịnh là vấn ñề cần thiết Mặt khác, tạo ra những giống lúa mang gen chịu hạn cũng là việc làm cần thiết cho cả những vùng trồng lúa có ñủ ñiều kiện thủy lợi bởi vì tình trạng thiếu nước có thể xảy ra ở hầu hết các vùng trồng lúa, theo thống kê có tới 90% diện tích trồng lúa trên thế giới chịu ảnh hưởng của khô hạn trong vài giai ñoạn sinh trưởng. Cùng với việc phát triển của công nghệ sinh học, chọn giống nhờ chỉ thị phân tử (MAS- Marker Assisted Selection) là phương pháp chọn giống ñang ñược áp dụng nhiều và là một hướng nghiên cứu ñầy triển vọng hiện nay. Trong chọn lọc nhờ chỉ thị phân tử, các gen ñích ñược phát hiện dựa vào chỉ thị chứ không phải dựa vào sự biểu hiện kiểu hình của gen ñó. Do ñó, việc chọn lọc dựa vào các chỉ thị liên kết chặt chẽ với nhóm gen sẽ giúp cho nhà chọn giống thu ñược những kết quả chính xác về dự ñoán tiềm năng sản lượng cũng như sức sống của thế hệ con cháu. Những thành công trong việc xác ñịnh các QTL liên quan ñến tính chịu hạn là bước ñầu quan trọng cho việc ứng dụng chỉ thị phân tử vào chọn giống cây trồng chịu hạn. [49][68] Nhờ những nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật bản ñồ gen, nhiều nhà khoa học ñã xác ñịnh ñược vị trí và vai trò của một số vùng gen liên quan ñến khả năng chịu hạn. Các ñặc tính như bộ rễ khoẻ, ăn sâu, khả năng ñiều chỉnh áp suất thẩm thấu, khả [...]... s phát tri n c a các ch th phân t Các ch th có th khác nhau v k thu t, v th i gian hay ñòi h i các trang thi t b khác nhau S lư ng ch th di truy n có th ñư c tìm th y kh p nơi trong genome, m t s lư ng l n s khác nhau v di truy n ñã ñư c tìm th y m i ch th trong m t qu n th nghiên c u Vi c xây d ng các b n ñ liên k t phân t và b n ñ QTL ñã và ñang ñư c phát tri n cho nhi u loài cây lương th c (lúa, ... dòng, gi ng lúa ch u h n - Xác ñ nh ñư c các gi ng lúa mang QTLs/gen ki m soát các tính tr ng liên quan ñ n kh năng ch u h n 1.4.2 Ý nghĩa th c ti n c a ñ tài - ðánh giá nhanh ñư c ngu n v t li u ch n gi ng trên cơ s xác ñ nh kh năng ch u h n nhân t o và ch th phân t - Ch n l c ñư c nh ng dòng, gi ng lúa có kh năng ch u h n t t, mang QTLs/gen ki m soát các tính tr ng ch u h n ñ v n d ng trong các t h... a các phân t ph n ng l i stress như aldehyde Các phân t này có th là nguyên nhân phân gi i lipid, làm bi n ñ i các Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… 12 protein và nucleic acids Aldehydes có th ñã b bi n ñ i thành carboxylic acid không ñ c b i các aldehyde dehydrogenase ALDH xu t hi n trong t t c các cơ th sinh v t cho th y s quan tr ng c a nó trong các. .. t nhi u nghiên c u v ch n gi ng cây tr ng ch u h n nh ch th phân t và ñã thu ñư c nhi u thành t u trong m t s lo i cây như lúa và ngô MAS ñã ñư c áp d ng trong c i bi n tính ch u h n ngô s d ng các QTL ch u h n.[62] ð i v i lúa, trong nh ng năm 90 c a th k trư c m t s qu n th ñã ñư c phát tri n ñ khám phá các QTL nh hư ng ñ n hình thái r và m t s ñ c ñi m ch u h n khác ñ có th s d ng cho MAS trong vi... trì th nư c lá trong ñi u ki n khô h n… ñ u quy t ñ nh ñ n kh năng ch u h n c a cây tr ng Do ñó ñ t o ngu n v t li u ban ñ u cho chương trình ch n t o gi ng lúa ch u h n chúng tôi ti n hành th c hi n ñ tài: Nghiên c u ng d ng ch th phân t phát hi n ngu n QTLs/gen ch u h n trong t p ñoàn các gi ng lúa. ” 1.2 M c ñích Xác ñ nh ñư c m t s dòng/gi ng lúa năng su t cao, ch t lư ng t t có mang QTLs/gen ki m... phép phân tích ch c năng c a gen ñư c bi t ði u này có nh hư ng ñ n các ti n b trong ch n t o gi ng nh ch th phân t ðây là nh ng cơ s h t s c quan tr ng cho vi c ng d ng và phát tri n MAS [53] b/ Xác ñ nh nh ng ch th liên k t v i các tính tr ng quan tâm ð xác ñ nh các ch th liên k t v i các tính tr ng quan tâm, ph i ti n hành xây d ng b n ñ liên k t phân t và b n ñ QTL B n ñ liên k t phân t ch ra các. .. b t l i Các gen RAB ph n ng v i ABA ngo i sinh và n i sinh cho ra nh ng protein có ch c năng c ch và b o v Các k t qu phân tích s bi u hi n c a gen trong quá trình phát sinh phôi và n y m m lúa và bông ñã cho th y vi c ti n x lý ABA ñã c m ng quá trình th hi n c a gen RAB Bi u hi n ch c năng c a ABA t o ra b i kh năng kháng h n ñã ñư c phân tích chính xác m c ñ phân t [67] Các gen bi u hi n trong ñi... trí c a các ch th phân t trong genome, còn b n ñ QTL ch ra m c ñ liên k t và kho ng cách c a ch th phân t và các locus liên quan ñ n các tính tr ng hình thái quan tâm ð MAS thành công, kho ng cách này thư ng không quá 5cM Các ch th này ñư c xác ñ nh là có v trí trên b n ñ r t g n ho c th m chí Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… 26 n m ngay bên trong gen... c trong môi trư ng nuôi c y mô s o [35] K t qu là ch n ñư c dòng lúa ch u h n t mô s o gi ng lúa Khao Dawk 105 Các tính tr ng nông sinh h c quan tr ng và kh năng ch u h n ñã duy trì và n ñ nh khi phân tích th h R2 Abdelsamad và CS (2007) cũng dùng PEG 6000 các n ng ñ 10, 20, 30% cho mô s o 4 dòng lúa mỳ, sau ñó ch n ñư c m t s dòng phân tích ña hình d a vào ch th isozyme và protein ñ ñánh giá M t nghiên. .. u gi a lúa c n và lúa nư c ñi u ki n thi u nư c, m t s d ng thi u h n s ñi u ch nh th m th u Các gi ng lúa c n c truy n nói chung có xu hư ng phát tri n h r và kh năng chi t rút nư c t ñ t tr i hơn và thi u ñi kh năng ñi u ch nh th m th u Các gi ng này thư ng b m t nư c nghiêm tr ng qua lá và có ph n ng cu n lá ngay khi ñ m trong ñ t c n ki t Khi thi u nư c chúng duy trì th nư c trong lá b ng cách ñóng . GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI LÊ THỊ THANH NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ PHÁT HIỆN NGUỒN QTLs/ GEN CHỊU HẠN TRONG TẬP ðOÀN CÁC GIỐNG LÚA . hành thực hiện ñề tài: Nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử phát hiện nguồn QTLs/ gen chịu hạn trong tập ñoàn các giống lúa. ” 1.2 Mục ñích Xác ñịnh ñược một số dòng /giống lúa năng suất cao, chất. nhiều và là một hướng nghiên cứu ñầy triển vọng hiện nay. Trong chọn lọc nhờ chỉ thị phân tử, các gen ñích ñược phát hiện dựa vào chỉ thị chứ không phải dựa vào sự biểu hiện kiểu hình của gen