3. VẬT LIỆU VĂ PHƯƠNG PHÂP NGHIÍN CỨU 1 Vật liệu nghiín cứu
3.2.2.Phương phâp nghiín cứu
(i)Thí nghiệm 1: ðânh giâ giân tiếp khả năng chịu hạn trong ñiều kiện hạn nhđn tạo
thông qua tỷ lệ nảy mầm, tỷ lệ rễ mầm ñen, tỷ lệ rễ mạ ñen sau khi xử lý ở câc nồng ñộ muối khâc nhau.
* Số mẫu: 70 mẫu giống lúa. Mỗi thí nghiệm ñược lặp lại 3 lần, ñối chứng lă giống
LC93-1.
* Phương phâp:
- Xử lý hạt bằng dung dịch Kaliclorate:
+ Giai ñoạn nảy mầm (KClO3 3%): Ngđm hạt giống trong dung dịch KClO3 3% trong 48h. Sau ñó, rửa sạch bằng nước trung tính rồi chuyển sang ñĩa Petri có lót giấy lọc ẩm cho hạt nảy mầm. Dựa văo % hạt nảy mầm, % rễ mầm ñen ñể ñânh giâ khả năng chịu hạn.
Trường ðại học Nông nghiệp Hă Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 47
ñến lúc cđy ñược 3 lâ thì ngđm rễ mạ văo dung dịch KClO3 1% trong 8h, sau ñó quan sât số rễ mạ ñen. Dựa văo tỷ lệ % rễ mạ ñen ñể ñânh giâ khả năng chịu hạn.
* Cơ sở khoa học của phương phâp xử lý bằng KClO3: ðđy lă phương phâp
nhđn tạo, ñânh giâ giân tiếp khả năng chịu hạn của câc giống lúa. Khả năng chịu hạn của cđy liín quan ñến khả năng chịu ñộc vă giữ nước của keo nguyín sinh khi dùng một hóa chất ñộc ñể xử lý. Nếu keo nguyín sinh ít bị ñộc, tế băo vă mô ít bị mất nước, ít bị hại, chứng tỏ cđy có khả năng chịu hạn. Ngược lại nếu keo nguyín sinh bị nhiễm ñộc, tế băo vă mô bị mất nước dẫn ñến cđy bị hại chứng tỏ cđy không có khả năng chịu hạn
- Tỷ lệ % hạt nảy mầm tính theo công thức:
+ % hạt nảy mầm = (Số hạt nảy mầm/Tổng số hạt xử lý) x 100 - Tỷ lệ % rễ mầm bị ñen tính theo công thức:
+ % rễ mầm ñen = (Số rễ mầm ñen/ Tổng số rễ mầm) x 100 - Tỷ lệ % rễ mạ ñen tính theo công thức:
+ % Rễ mạ ñen = (Số rễ mạ ñen/Tổng số rễ mạ) x 100
Dựa văo kết quả trín, ñối chiếu với kết quả theo dõi khả năng chịu hạn vă những phđn tích hình thâi rễ của câc giống năy khi xảy ra hạn tự nhiín khi gieo cấy trín ruộng cạn chúng tôi chọn lọc ñược 21 mẫu giống lúa có khả năng chịu hạn tốt nhất ñể tiếp tục lăm câc thí nghiệm tiếp theo.
(ii)Thí nghiệm 2: ðânh giâ ñặc trưng bộ rễ câc dòng, giống lúa tham gia thí nghiệm –
kỹ thuật hộp rễ
Âp dụng phương phâp ñânh giâ chiều sđu bộ rễ của Bohm W, 1979. Dùng giấy nhựa mica lăm thănh câc hộp hình trụ tròn có ñường kính 10cm, dăi khoảng 90 cm. Dùng ñất nhỏ trộn ñều với 0.3g phđn NPK 6-11-2 rồi nhồi ñầy văo trong câc ống nhựa, câch thănh ống 5cm. Dựng ống thănh hăng có giâ ñỡ câch nhau 3-5 cm, gieo khoảng 3-4 hạt thóc của mỗi giống văo 1 ống. Mỗi giống lặp lại 3 lần. Khi hạt nảy mầm thì tỉa bớt cđy chỉ ñể lại 1 cđy/ống. ðặt câc ống cđy trong nhă lưới, nơi có thể nhận ñược nước mưa tự nhiín. Bịt kín ống ñể giữ tối cho rễ. Câc ống cđy không ñược tưới thím nước.
Trường ðại học Nông nghiệp Hă Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 48
ðến khi cđy ñẻ nhânh, tiến hănh thâo ñất trong ống ra lấy nguyín vẹn bộ rễ lúa, rửa sạch vă ño chiều dăi bộ rễ ñếm số rễ chính. Sau ñó ñem sấy vă cđn khối lượng rễ.
(iii) Thí nghiệm 3 vă 4: ðânh giâ khả năng sinh trưởng phât triển vă một số ñặc ñiểm nông sinh học trong ñiều kiện chủ ñộng nước vă nhờ nước trời.
* Số mẫu: Gồm 21 mẫu dòng, giống lúa ñê ñược chọn lọc qua thí nghiệm 1, trong ñó có giống ñối chứng lă LC93-1.
* Phương phâp:
- Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm ñược bố trí theo phương phâp quan sât vườn dòng, không nhắc lại của IRRI.
* Biện phâp kỹ thuật:
- Tiến hănh gieo, cấy số mẫu giống lúa cần ñânh giâ trín ñồng ruộng. Câc giống sẽ ñược bố trí trín 2 ñiều kiện:
+ Chủ ñộng nước (Thí nghiệm 3) + Nhờ nước trời (Thí nghiệm 4)
- Thời vụ gieo: Vụ mùa 2012, ngăy gieo 2/7/2012 (với lúa cấy). ðối với lúa gieo cạn cần chọn thời ñiểm có mưa nhỏ ñể gieo.
- Ở ruộng lúa cấy trong ñiều kiện chủ ñộng nước lăm ñất kỹ vă chia thănh câc ô theo kích thước ñê chọn. Mỗi giống gieo cấy thănh 5 hăng trong 1 ô thí nghiệm có chiều dăi khoảng 2m, khoảng câch hăng - hăng lă 25cm, cđy – cđy lă 20cm. Theo dõi 3 hăng, mỗi hăng theo dõi 10 cđy, dùng que cắm theo dõi cố ñịnh từ khi bắt ñầu mọc cho ñến khi kết thúc cho tất cả câc chỉ tiíu, không theo dõi những cđy quanh rìa ô.
- Lăm ñất ở ruộng gieo cạn, căy bừa kỹ, lín thănh câc luống sđu vă rộng bằng nhau, câch nhau 20cm. Rạch hăng nông 3cm dọc trín mặt luống, gieo hạt bằng tay (ñảm bảo ẩm ñộ ñất lă 18-32%) rồi phủ một lớp ñất mỏng 0,5-1cm. Sau khi cđy mọc tỉa cđy theo khoảng ñê xâc ñịnh. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Chăm sóc vă bón phđn: theo quy trình chuẩn của Viện Cđy lương thực &CTP.
Trường ðại học Nông nghiệp Hă Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 49
- Theo dõi, ñânh giâ một số ñặc tính nông sinh học vă hình thâi cơ bản liín quan ñến khả năng chịu hạn của câc dòng, giống lúa như: ñộ tăn lâ, ñộ khô của lâ, ñộ cuốn lâ, phục hồi sau hạn… Theo dõi ñânh giâ văi lần theo chu kỳ hạn, theo dõi văo buổi sang lă phù hợp hơn vì sau khi khô hạn cđy lúa có thể phục hồi vă khả năng trở lại về ban ñầu của bộ lâ.
- Theo dõi câc giai ñoạn sinh trưởng phât triển: Ngăy gieo, ngăy cấy, ngăy bắt ñầu ñẻ nhânh, ngăy kết thúc ñẻ nhânh, ngăy trỗ 10%, ngăy trỗ 80%, ngăy trỗ hoăn toăn, ngăy chín hoăn toăn ở cả 2 ñiều kiện ñủ nước vă nhờ nước trời.
- Theo dõi một số ñặc ñiểm hình thâi: Chiều cao cđy cuối cùng (cm), chiều dăi/rộng lâ ñòng (cm), góc ñộ lâ ñòng (ñộ), chiều dăi cổ bông (cm), chiều dăi bông (cm), năng suất vă câc yếu tố cấu thănh năng suất ở cả 2 ñiều kiện ñủ nước vă nhờ nước trời.
- Theo dõi tình hình chịu hạn, khả năng phục hồi khi có hạn xảy ra theo thang ñiểm SES của IRRI (2002).[9],[19].
(i)Thí nghiệm 5: Sử dụng một số mồi SSR liín kết với câc QTLs/gen kiểm soât tính
trạng hình thâi rễ có lợi cho khả năng chịu hạn ở lúa.
* Số mẫu: Gồm 21 mẫu dòng, giống lúa ñê ñược chọn lọc qua thí nghiệm 1, trong ñó có giống ñối chứng lă LC93-1.
* Phương phâp:
Chiết tâch DNA theo Quy trình chiết tâch DNA (theo Zheng vă Cs có cải tiến năm 1995)
Thănh phần dung dịch chiết tâch DNA
Thănh phần Nồng ñộ dung dịch mẹ Nồng ñộ dung dịch lăm việc Hỗn hợp 10ml dung dịch chiết tâch Tris- HCl (pH=8) 1M 50mM 0,5ml EDTA (pH=8) 0,5M 0,25mM 0,5ml SDS 10% 1% 1,0ml NaCl 5M 300mM 0,6ml H2O 7,4ml
Trường ðại học Nông nghiệp Hă Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 50 Thănh phần dung dịch ñệm TE Thănh phần Nồng ñộ dung dịch mẹ Nồng ñộ dung dịch lăm việc 50ml dung dịch TE lăm việc Tris- HCl (pH=8) 1M 10mM 0,5ml EDTA (pH=8) 0,5M 1mM 0,1ml H2O 49,4ml
Quy trình chiết tâch DNA
Bước 1: Thu ngắt mẫu lâ khỏe, 14 ngăy tuổi dăi khoảng 2cm bỏ văo ống nghiệm có dung tích 1,5 ml ñânh dấu tín giống rồi bỏ văo ñâ lạnh.
Bước 2: Trong phòng thí nghiệm câc cối chăy sứ ñê dược hấp khử trùng ñặt trong ñâ lạnh. Câc mẫu lâ ñược cắt nhỏ 0,5 cm bỏ văo cối chăy sứ.
Bước 3: Nhỏ 400µl dung dịch chiết xuất ADN văo cối rồi nghiền nhỏ mẩu lâ
cho ñến khi dung dịch chiết xuất chuyển sang mău xanh ñen, chứng tỏ tế băo lâ ñê vỡ vă diệp lục ñược giải phóng ra.
Bước 4: ðổ thím 400µl dung dịch chiết xuất ADN văo, trộn lẫn rồi hút 400µ
dung dịch văo ống nghiệm ñê ñược ñânh dấu.
Bước 5: ðổ văo ống nghiệm 400µl hỗn hợp Phenol : Chloroform : Isolamylalchohol (25 : 24 : 1). Sau ñó quay ly tđm khoảng 30 giđy rồi chuyển phần dung dịch trín sang ống nghiệm ñê ñược ñânh dấu cùng giống.
Bước 6: ðổ thím 700 - 800µl hỗn hợp Chloroform : Isolamylalchohol (24:1).
Sau ñó ly tđm 13000 vòng/phút trong 3 phút ở 4oC rồi chuyển phần dịch phía trín sang ống nghiệm ñê ñược ñânh dấu cùng giống.
Bước 7: Cho 800µl ethanol (96%) văo trộn ñều rồi ly tđm 3 phút với tốc ñộ
12000 vòng/phút. ðổ phần dung dịch phía trín, giữ lại phần kết tủa dưới ñây ống nghiệm.
Bước 8: Rửa kết tủa bằng ethanol 70%, lăm khô tự nhiín ở nhiệt ñộ phòng bằng câch úp ngược ống nghiệm lín giấy thấm.
Trường ðại học Nông nghiệp Hă Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 51
* Kiểm tra ñộ nguyín vẹn vă tinh sạch của DNA thu ñược
- ðộ nguyín vẹn: 1 µl DNA + 7 µl TE + 2 µl loadding dye 6X trộn lẫn rồi nhỏ văo câc giếng trín bản gel agarose 1%, chạy ñiện di với U = 65V, 60 phút. Nhuộm bằng Ethidium bromide sau ñó quan sât hình ảnh ñiện di vă ñânh giâ. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- ðộ tinh sạch DNA: ðo bằng mây Nanodrop 1000 nếu tỷ số OD260/OD280 trong phạm vi 1.8-2.0 thì mẫu DNA ñó ñược coi lă sạch.
Phản ứng PCR
- Trình tự câc mồi sử dụng: [73],[ 34].
Stt
Tín mồi NST Trình tự mồi xuôi 5’ --- 3’ Trình tự mồi ngược 5’ --- 3’ Kích thước (bp) 1 RM 270 12 ggccgttggttctaaaatc tgcgcagtatcatcggcgag 108 2 RM 250 2 ggttcaaaccaagctgata gatgaaggccttccacgcag 153 3 RM 167 9 gatccagcgtga ggaacacgt agtccgaccacaaggtgcgttgtc 128 4 RM 242 9 ggccaacgtgtgtatgtctc tđttgccaagacggatggg 225 5 RM 221 2 acatgtcagcatgccacatc tgcaagaatctgaccggg 192 - Thănh phần phản ứng PCR: STT Hoâ chất Thể tích (µl) 1 DNA mẫu (25ng/ µl) 2 2 Tag Polimerase 5U 0.5 3 PCR Buffer 10X 2.0 4 MgCl2 50mM 1.0 5 dNTPs 2.5mM 1.6 6 pimer F (10µM) 2 pimer R (10µM) 2 7 H20 8.9 Tổng thể tích 20
Trường ðại học Nông nghiệp Hă Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 52
- Chu trình nhiệt bao gồm câc bước: 940C trong 5 phút, 940C trong 30 giđy, 550C trong 30 giđy, 720C trong 45 giđy, 720C trong 5 phút, giữ nhiệt ở 40C. Lặp lại 35 chu kỳ từ bước 2 ñến bước 4.
Kiểm tra sản phẩm PCR bằng ñiện di trín gel agarose 0,8%, sau ñó chạy ñiện di trín gel polyacrylamide 5%.
* Phương phâp ñiện di trín gel polyacrylamide:
Chuẩn bị kính chạy gel: lau kính bằng nước cất vă cồn tuyệt ñối cho cả hai tấm, vă dùng giấy mềm, dai, không bụi ñể lau cho kính không xước vă dính bụi giấy. Tấm dẫn ñiện ngắn cho bôi trơn bằng nước rửa kính Rain X, tấm dăi cho hỗn hợp 1ml (0,5% acid acetic + 95% cồn 950), + 2,5µl chất dính, bôi ñều mặt kính, ñể khô trong 15-20 phút. Lắp hai bản kính với nhau theo khung có sẵn, ñể ñộ dăy của tấm spacer tạo khoảng trống lăm khuôn ñúc gel.
Chuẩn bị gel: Lấy 55ml polyacrylamide 5% (0,25% bis acrylamide + 7,5M urea + 50mM Boric acid + 1mM EDTA) vă 55 µl Temed cùng với 165 µl APS 10% khuấy ñều.
Chạy ñiện di: bản gel ñược ñiện di trín mây Sequence Gen (BioRad Laboratories Inc, Hercules, California, USA) trong ñệm 0,5xTBE. Lăm nóng mây trong 30’ ở dòng ñiện có công suất 100W bắt ñầu tra mẫu (ñê thím 6 µl loading dye ñược biến tính) sau ñó chạy ñiện di ở 75W trong khoảng 1,5 giờ.
Khi chạy xong bản gel ñược ñưa văo dung dịch cố ñịnh (125 ml acid acetic +1 lít nước cất) trong 30’, sau khi rửa sạch ngđm trong dung dịch nhuộm (1g AgNO3. 1,5ml formandehyt vă 1 lít nước cất) trong 30’; cuối cùng ñưa văo dung dịch hiện (30g sodiumcacbonat, 1.5 ml formandehyt, 0,4 ml sodium thiosunfat khuấy cho tan hết sau ñó lăm lạnh ở 40C.
5 mồi SSR chúng tôi sử dụng liín kết với câc QTL tính trạng rễ có lợi cho tính chịu hạn[178]. Cụ thể: hai mồi RM250 vă RM270 liín kết với tính trạng ñộ dăi rễ, mồi RM167 liín kết với tính trạng khối lượng rễ/thđn, mồi RM221 liín kết với tính trạng tỷ lệ rễ sđu/thđn, mồi RM 242 liín kết với tính trạng tỷ lệ rễ/thđn.
Trường ðại học Nông nghiệp Hă Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 53