2.3.2.1. Chọn giống bằng ñột biến gen
ðột biến lă những biến ñổi trong vật chất di truyền, nghĩa lă những biến ñổi trong cấu trúc của gen hay nhiễm sắc thể. Những câ thể mang những tính trạng mới do ñột biến lă những thể ñột biến. ðột biến xuất hiện một câch ñột ngột trong câc tế
Trường ðại học Nông nghiệp Hă Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 23
băo riíng biệt vă ñược giữ lại chính xâc qua câc thế hệ. Gồm có câc loại lă ñột biến gen, ñột biến NST vă ñột biến genome.
ðột biến lă con ñường quan trọng dẫn ñến việc lăm tăng quâ trình biến dị. Vì vậy, ñể khắc phục nhược ñiểm do thiếu những biến dị như mong muốn vă ñể tạo ra nhiều ñột biến lăm nguồn nguyín liệu cho chọn lọc, câc nhă chọn giống ñê tiến hănh gđy tạo ñột biến nhđn tạo với câc tâc nhđn gđy ñột biến như: hóa học, vật lý.... Nhờ tạo ra câc ñột biến nhđn tạo, số lượng câc ñột biến tăng lín, câc nhă chọn giống có nhiều cơ hội ñể chọn lọc câc biến dị mong muốn hơn vă hiệu quả chọn lọc cũng tăng lín. Tuy nhiín, việc tạo ra câc ñột biến có những hạn chế như: ñòi hỏi phòng thí nghiệm phải ñược trang bị, nhiều ñột biến có hại cho cơ thể sinh vật có thể lăm giảm sức sống, thậm chí gđy chết. Câc ñột biến ñược hình thănh một câch ngẫu nhiín không mang tính ñịnh hướng, câc tâc nhđn gđy ñột biến tâc ñộng lín cấu trúc phđn tử của DNA nhưng rất nhiều thay ñổi ñược tạo ra lại phục hồi trước khi trở thănh ñột biến vă ñược thể hiện ở kiểu hình. [29]. Vì vậy, phương phâp năy không phải lúc năo cũng ñem lại hiệu quả như mong muốn.
2.3.2.2. Chọn giống bằng công nghệ tế băo thực vật
Chọn giống bằng công nghệ tế băo thực vật xuất phât từ những biến dị (biến dị soma) thu ñược trong quâ trình nuôi cấy mô, tế băo. Bản chất vă cơ chế của hiện tượng năy liín quan mật thiết ñến những thay ñổi trong hệ gen của tế băo nuôi cấy. Những kiểu hình trong nuôi cấy có những ñặc ñiểm như: (a) bền vững qua nhiều lần nuôi cấy, (b) tần số xảy ra thấp (10-6 – 10-10), (c) có quan hệ chặt chẽ với những sản phẩm của gen ñặc trưng.
Câc nhă chọn giống ñê lợi dụng ñặc tính năy ñể xđy dựng phương phâp chọn lọc mới. Nguyín lý của phương phâp chọn dòng tế băo soma lă khi nuôi cấy mô vă tế băo thực vật ở dạng tế băo mô sẹo trong ñiều kiện invitro chúng thường có những biến ñổi tự phât. Câc biến dị năy rất ña dạng về kiểu gen vă kiểu hình vì thế có thể chọn lọc ñược những tế băo khâc nhau về sinh lý, sinh hóa ... Cđy tâi sinh từ những tế băo chọn lọc có thể vẫn giữ ñược câc tính trạng ñê chọn. Nếu câc tính trạng năy ñược di truyền cho câc thế hệ tiếp theo bằng con ñường sinh sản hữu tính vă trở thănh tính trạng ổn ñịnh thì có thể ñâp ứng yíu cầu lăm giống.
Trường ðại học Nông nghiệp Hă Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 24
Bằng phương phâp chọn lọc năy câc nhă chọn giống ñê tạo ra ñược những dòng dòng tế băo chống chịu ñược ñiều kiện bất lợi của ngoại cảnh như: nóng, lạnh, phỉn, mặn, hạn, úng...; câc dòng tế băo khâng câc ñộc tố do câc tâc nhđn sinh học gđy ra; hoặc câc dòng sản xuất dư thừa câc loại sản phẩm năo ñó...
Tuy nhiín, câc dạng ñột biến trong nuôi cấy in vitro thường xuất hiện với tần số thấp nín lăm hạn chế việc ứng dụng văo chọn giống. ðiều năy có thể khắc phục nếu xử lý với câc tâc nhđn chọn lọc ñể nđng cao tần số nhằm thu ñược nhiều biến dị hơn cho chọn lọc. [1].
2.3.2.3. Chọn giống nhờ sự trợ giúp của câc chỉ thị phđn tử
a/ Cơ sở của chọn lọc nhờ sự trợ giúp của câc chỉ thị phđn tử (MAS-Marker assisted Selection)
Lập bản ñồ gen vă phđn tích di truyền ñê trở thănh một công cụ di truyền thích hợp trong biến ñổi nhiều loại cđy trồng. Việc lập bản ñồ nhiều gen có giâ trị trong sản xuất nông nghiệp ñem lại những ứng dụng quan trọng như phđn lập, tâch dòng câc gen vă chọn lọc với sự trợ giúp của câc chỉ thị phđn tử.
Bản ñồ liín kết phđn tử cho phĩp nghiín cứu chi tiết những biến ñổi di truyền của câc gen kiểm soât nhiều tính trạng quan trọng như: năng suất, tính khâng sđu bệnh, tính khâng với những yếu tố bất lợi của môi trường. Việc lập bản ñồ câc locus tính trạng số lượng (QTL – Quantitative Trait Loci) xâc ñịnh số lượng, vị trí, hiệu quâ gen vă hoạt ñộng của câc locus liín quan trong tương tâc gen vă tương tâc QTL với môi trường từ ñó chọn lọc nhờ sự trợ giúp của câc chỉ thị phđn tử (MAS – Marker Assisted Selection) có thể sử dụng nhằm chọn lọc có hiệu quả câc tính trạng năy ở ñiều kiện không ñặc trưng.
Thông qua một bản ñồ liín kết phđn tử chi tiết với câc chỉ thị phđn tử phủ kín lín tất cả câc vùng của bộ nhiễm sắc thể cho phĩp xâc ñịnh vị trí chính xâc của một gen ñược quan tđm, tiến tới phđn lập vă tâch dòng câc gen năy phục vụ cho việc nghiín cứu sđu hơn cơ chế hoạt ñộng của gen cũng như việc tạo ra câc giống cđy trồng mới hội tụ nhiều tính trạng mong muốn nhờ quâ trình chuyển gen.
Nếu gen ñiều khiển tính trạng ñê ñược xâc ñịnh vị trí trín bản ñồ gen vă ñê biết ñược dêy mê của câc chỉ thị tức lă câc ñoạn DNA lđn cận (dùng ñể ñânh dấu),
Trường ðại học Nông nghiệp Hă Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 25
thì có thể dùng MAS. MAS trong phạm vi chọn giống lă sự ghi nhận không trực tiếp cho sự có mặt hay vắng mặt của kiểu hình mong muốn hoặc câc thănh phần kiểu hình dựa trín sự có mặt hay vắng mặt của trình tự hay băng của chỉ thị phđn tử nằm ở trong hoặc gần gen kiểm soât kiểu hình quan tđm.
So với chọn lọc truyền thống nếu tính trạng bị giới hạn về giới tính hoặc chỉ có thể ño ñếm văo giai ñoạn muộn của chu kỳ sống thì MAS lă thích hợp hơn vì thông tin chỉ thị có thể dùng cho cả hai giới tính vă ở bất cứ giai ñoạn năo. MAS có ưu ñiểm lă ñược thực hiện ở bất cứ thế hệ năo vă cả ở ñiều kiện ñồng ruộng hay nhă kính, trong khi chọn lọc kiểu hình thường ñòi hỏi những ñiều kiện chăm sóc ñặc biệt cho quản lý nông học, trong ñânh giâ vă ghi nhận kết quả.
Một ưu ñiểm khâc lă MAS có thể sử dụng khi cần chọn lọc một tính trạng năo ñó do nhiều gen kiểm soât mă mỗi gen trong ñó ñều gđy ra những hiệu quả kiểu hình giống nhau (tính khâng sđu bệnh). Thông thường ở mỗi thế hệ phải tiến hănh phđn tích, việc lăm ñó ñối với tính trạng nhiều gen kiểm soât không dễ dăng vă rất chậm chạp. Nhưng nếu câc gen ñó liín kết với nhau thì có thể dễ dăng theo dõi một trong số câc gen ñó bằng việc lai. Từng cđy sẽ ñược kiểm tra xem có mang bao nhiíu gen chống chịu ñó mă không cần phđn tích câc thế hệ lai. MAS ñặc biệt hiệu quả khi cần ñưa gen lặn hoặc ñưa cùng lúc nhiều gen khâc nhau văo một hệ gen ưu việt.
Cơ sở cho ứng dụng MAS lă tất cả câc cơ thể sống ñược cấu tạo từ tế băo ñược hình thănh bởi vật chất di truyền ñược gọi lă DNA.DNA tạo nín từ một chuỗi dăi câc bazơ nitơ. Gen chỉ một ñoạn nhỏ trình tự DNA, phần còn lại DNA không mê hóa vă vai trò của phần năy còn chưa ñược hiểu rõ. Vật chất di truyền trong cơ thể ñược tổ chức thănh câc nhiễm sắc thể vă toăn bộ tổ chức năy ñược gọi lă hệ gen. Ở câc câ thể lưỡng bội mỗi gen có hai alen, một từ bố vă một từ mẹ. Chỉ thị phđn tử không phải lă một gen thông thường, chúng không có bất cứ tâc ñộng sinh học năo. Chúng có thể ñược xem như một mốc cố ñịnh trong hệ gen. Chúng lă trình tự DNA có thể nhận dạng ñược ở những vị trí ñặc trưng trong hệ gen vă ñược truyền bởi quy luật cơ bản của di truyền từ thế hệ năy sang thế hệ khâc. Chúng dựa trín phđn tích di truyền, khâc với chỉ thị hình thâi lă dựa trín tính trạng nhìn thấy ñược vă chỉ thị hóa học lă dựa trín câc protein lă sản phẩm của gen.
Trường ðại học Nông nghiệp Hă Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 26
Một cơ sở quan trọng cho MAS lă sự phât triển của câc chỉ thị phđn tử. Câc chỉ thị có thể khâc nhau về kỹ thuật, về thời gian hay ñòi hỏi câc trang thiết bị khâc nhau. Số lượng chỉ thị di truyền có thể ñược tìm thấy ở khắp nơi trong genome, một số lượng lớn sự khâc nhau về di truyền ñê ñược tìm thấy ở mỗi chỉ thị trong một quần thể nghiín cứu.
Việc xđy dựng câc bản ñồ liín kết phđn tử vă bản ñồ QTL ñê vă ñang ñược phât triển cho nhiều loăi cđy lương thực (lúa, ngô, ñậu...), cđy công nghiệp (bông, chăm...) vă cđy trồng. Song song với việc xđy dựng câc bản ñồ liín kết phđn tử vă bản ñồ QTL lă việc tìm ra nhiều chỉ thị phđn tử liín kết với câc tính trạng kinh tế quan trọng như năng suất, chất lượng, khâng bệnh vă khả năng chống chịu với câc ñiều kiện bất lợi (hạn, mặn, lạnh ...) của môi trường [55]
Gần ñđy, có nhiều thănh tựu về giải mê hệ gen của câc giống cđy trồng chủ lực như lúa, ngô, ñậu tương, nhưng có tới hơn 50% gen chưa biết chức năng trong từng hệ gen. Hiện nay chương trình quốc tế “Rice Funtional Genomics” ñê vă ñang nỗ lực hợp nhất tăi nguyín toăn cầu cho nghiín cứu hệ gen chức năng ở lúa. Một trong câc chiến lược của chương trình năy lă sử dụng ñột biến ñể tạo nín những biến ñổi trong DNA ñể có thể gắn thím hoặc lăm mất ñi chức năng. Trong ñó TILLING (Targeted Local Lesion in Genome, tạm dịch lă phương phâp xâc ñịnh biến ñổi cục bộ trong genome) lă phương phâp mới ñể nghiín cứu di truyền ngược nhằm xâc ñịnh biến dị di truyền mới khi thay ñổi ở mức ñộ từng nucleotide, cho phĩp phđn tích chức năng của gen ñược biết. ðiều năy có ảnh hưởng ñến câc tiến bộ trong chọn tạo giống nhờ chỉ thị phđn tử. ðđy lă những cơ sở hết sức quan trọng cho việc ứng dụng vă phât triển MAS [53].
b/ Xâc ñịnh những chỉ thị liín kết với câc tính trạng quan tđm
ðể xâc ñịnh câc chỉ thị liín kết với câc tính trạng quan tđm, phải tiến hănh xđy dựng bản ñồ liín kết phđn tử vă bản ñồ QTL. Bản ñồ liín kết phđn tử chỉ ra câc vị trí của câc chỉ thị phđn tử trong genome, còn bản ñồ QTL chỉ ra mức ñộ liín kết vă khoảng câch của chỉ thị phđn tử vă câc locus liín quan ñến câc tính trạng hình thâi quan tđm. ðể MAS thănh công, khoảng câch năy thường không quâ 5cM.
Trường ðại học Nông nghiệp Hă Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 27
nằm ngay bín trong gen ñang ñược quan tđm. Vì vậy, có thể sử dụng MAS ñể chọn lọc những biến ñổi của chỉ thị có thể nhận biết ñược (alen) ñể chọn lọc những biến ñổi có triển vọng nhưng không nhận biết ñược của gen quan tđm. Ví dụ: chỉ thị M có hai alen M1 vă M2 ñược xâc ñịnh qua phđn tích DNA lă nằm trín nhiễm sắc thể ở vị trí gần với gen quan tđm Q (với biến ñổi Q1 lă tăng năng suất vă Q2 lă giảm năng suất). Nếu câ thể trong quần thể có alen M1 vă Q1 trín một nhiễm sắc thể vă M2, Q2 trín nhiễm sắc thể khâc thì bất cứ ở thế hệ năo câc câ thể nhận ñược alen M1 sẽ có khả năng cũng mang alen Q1 (khả năng năy tùy thuộc văo M vă Q gần nhau như thế năo trín nhiễm sắc thể) vì vậy có thể sử dụng trong chọn lọc.
Mối quan hệ giữa câc chỉ thị vă gen quan tđm ñược chia ra lăm ba dạng quan hệ: - Chỉ thị phđn tử nằm trong gen quan tđm. Trong trường hợp năy, chọn lọc dựa trín gen chỉ thị, sự di truyền của alen mang ñoạn gen chỉ thị vă gen quan tđm luôn ñi cùng nhau. ðđy lă trường hợp thuận lợi nhất nhưng không phổ biến vă khó tìm ñược trong thực tế.
- Chỉ thị liín kết không cđn bằng với gen quan tđm trong toăn bộ quần thể. Liín kết không cđn bằng lă xu hướng tổ hợp chắc chắn của câc alen mang chỉ thị vă gen quan tđm ñược di truyền cùng nhau. Quần thể liín kết không cđn bằng có thể tìm thấy khi chỉ thị phđn tử vă gen quan tđm có khoảng câch vật lý rất gần với nhau hoặc giữa câc dòng hoặc chọn lọc qua câc thế hệ gần.
- Chỉ thị liín kết cđn bằng với gen quan tđm trong toăn bộ quần thể. Trong trường hợp năy khó có thể ứng dụng MAS.[41]
c/ Câc chỉ thị dùng trong chọn giống * Chỉ thị RFLP
ða dạng ñộ dăi câc ñoạn cắt hạn chế (RFLP) lă một chỉ thị phđn tử quan trọng trong nghiín cứu vật liệu di truyền. Cơ sở của phương phâp sử dụng chỉ thị RFLP lă dùng câc enzyme hạn chế endonuclease cắt DNA genome tại những trình tự nhận biết ñặc hiệu. Kết quả lăm phât sinh hăng ngăn ñoạn DNA có ñộ dăi khâc nhau, số lượng của những ñoạn năy tùy thuộc văo số ñiểm nhận biết của enzyme hạn chế có trong DNA genome.
Trường ðại học Nông nghiệp Hă Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 28
hiện nay chỉ thị năy ít ñược câc nhă chọn giống sử dụng vì thao tâc phức tạp của nó. Gần ñđy có một số ít công trình về RFLP như việc dùng 789 mẫu dò RFLP ở
Sorghum bicolor ñê tìm ñược 19 chỉ thị có ña hình liín quan ñến bệnh hĩo rũ vă có
thể sử dụng cho MAS [63]. Một công bố sử dụng chỉ thị RFLP liín quan ñến gen ñiều khiển tổng hợp axit bĩo.[56] vă một số gen quan trọng ở Coix (thuộc họ cỏ ñược trồng lăm cđy lương thực) [61].
* ða dạng DNA nhđn bản ngẫu nhiín (RAPD)
Trong kỹ thuật RAPD những mồi ñơn có trình tự ngẫu nhiín lă những oligonucleotide ñược tổng hợp nhđn tạo có ñộ dăi từ 9 ñến 12 bazơ.
Một quần thể F2 gồm 117 câ thể phât triển từ cặp lai giữa giống hạnh nhđn lùn VG 9514 khâng bệnh rỉ sắt vă cđy mẫn cảm lă TAQ 24 ñê khâm phâ ñược 11 mồi RAPD có ña hình giữa bố vă mẹ. Qua phđn tích nhận ñược chỉ thị J7 có mối liín kết hoăn toăn với khả năng khâng bệnh rỉ sắt. ðđy lă một công bố ñầu tiín về phât hiện chỉ thị RAPD có mối liín kết với gen khâng bệnh rỉ sắt ở lạc. Như vậy với chỉ thị năy có thể ứng dụng MAS ñể chọn tạo giống lạc khâng bệnh rỉ sắt. [59].
Câc gen Er1, Er2 vă Er3 như ñê biết lă câc gen khâng bệnh phủ nấm mốc
trắng ở ñậu. Fondevilla vă CS ñê nhận ñược 4 chỉ thị RAPD liín kết với gen khâng bệnh Er3 từ quần thể F2 có thể cho mang gen Er3 cho ña hình giữa cđy bố vă cđy
mẹ [43].
Ngoăi ra gần ñđy còn khâm phâ một loạt câc chỉ thị RAPD khâc liín kết với gen khâng bệnh ñốm lâ mắt ếch, gen khâng bệnh mốc sương ở ñậu tương, gen kiểm soât tính ñộc của cđy nghệ ñê ñược phđn tích câc ñặc ñiểm phđn tử vă phât hiện một số chỉ thị AFLP liín kết với nó.
* ða hình câc ñoạn DNA nhđn chọn lọc (AFLP)
ða hình ñộ dăi câc ñoạn ñược nhđn chọn lọc lă một kỹ thuật chỉ thị phđn