Nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử phát hiện gen quy định hàm lượng amylose ở lúa

Nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử phát hiện gen quy định hàm lượng amylose ở lúa

PHẦN I MỞ ĐẦU

Hiện nay một trong những chỉ tiêu đánh giá chất lượng của một giống lúa đó làhàm lượng amylose (AC) cao, thấp hay trung bình Với những giống lúa cho gạo cóhàm lượng amylose cao thường lâu chín, cơm khô và cứng khi để nguội, gạo có hàmlượng amylose thấp hoặc rất thấp thường dính không tơi cơm, trong khi đó gạo cóhàm lượng amylose trung bình thường tơi cơm ăn không ráp và không cứng khi đểnguội nên được người tiêu dùng ưa chuộng Do đó chọn tạo các giống hàm lượngamylose trung bình là vấn đề cấp thiết.

Cùng với sự phát triển nhanh chóng của công nghệ sinh học và tin học đã chophép chúng ta tiếp cận các yếu tố liên quan quyết định chất lượng lúa gạo ở mức phântử, đặc biệt hàm lượng amylose Hiểu rõ bản chất cấu trúc chức năng của các yếu tốquy định sự hình thành và biến đổi của amylose trong hạt gạo ở cấp độ phân tử sẽ chophép chúng ta, các nhà khoa học, nhà chọn giống ứng dụng vào nghiên cứu và chọntạo các giống mới có năng suất, chất lượng với hàm lượng amylose hợp lý Dựa trên

cơ sở đó chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tửphát hiện gen quy định hàm lượng amylose ở lúa”

Mục đích và yêu cầu

- Khảo sát đánh giá một số chỉ tiêu cơ bản liên quan đến hàm lượng amylose của cácgiống địa phương.

- Xác định gen waxy quy định hàm lượng amylase ở hạt gạo bằng maker phân tử.

PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Các nghiên cứu đã chỉ ra một số enzyme chủ yếu tham gia tổng hợp tinh bột:ADP glucophosphate synthetase (AGPase) hoạt hoá glucose 1 phosphate thành ADPglucose (Pressis et al 1991) Granule – bound starch synthase (GBSS) gắn các ADP –glucose vào đoạn mồi bắt đầu từ đầu không khử bằng liên kết 1-4 glycozid EnzymSBE cắt chuỗi liên kết 1-4 glucan và tạo liên kết α – (1-6)glucan tạo nên các phân tửamylopectin Enzyme Ganule bound starch synthase GBSS được mã hoá bởi gene Wxở nhiễm sắc thể số 6 (Okagaki wessler 1988) Soluble starch synthase (SSS) cũng cótác động đến sự tạo mạch nhánh Tuy nhiên SBE có vai trò chủ yếu tới sự tổng hợpamylopectin

Trình tự của gene Wx trên giống O Sativa (Japonica Heng-feng) dài 5499 bpgồm 14 Exon, 13 Intron (Wang, et al 1990); Trên cơ sở hàm lượng GBSS trong cácloài non-Waxy, đã tìm thấy 2 alen Waxy là Wxa, Wxb lần lượt trên loài phụ Indica vàJaponica, còn ở lúa nếp là alen lặn wx (Sano 1980) Một số nghiên cứu khác cũng chỉ

ra rằng trên locus Wx có ít nhất 3 alen có chức năng khác nhau Wxa, Wxb, wx lần lượttrong các loài Indica, Japonica và lúa nếp (Sano, 1984).

Khi so sánh giữa 2 alen Wxa và Wxb Y Sano, M.Kasumata (1986) thấy rằngWxa tăng cường hoạt động của GBSS, do đó làm tăng hàm lượng amylose trong nộinhũ hạt hơn so với Wxb So sánh trình tự Wxb và Wxa cho thấy có sự thay thế một nuG bởi T tại vị trí cắt nối intron 1 (trình tự cắt nối từ đầu 5’ của intron 1 của Wxa làAGGTATA, của Wxb là AGTTATA) Kết quả làm giảm hàm lượng mRNA thànhthục dẫn đến giảm GBSS tạo thành, từ đó giảm hàm lượng amylose (Sano 1984,Hirano 1998)

Hiro- Yuki Hirano và cs (1998) sử dụng tế bào trầnđể nghiên cứu chức năng gen waxy thông qua sự biểu hiện của gen gus, kết hợp phân tích Nothern blot Kết quả cho thấy với loài mang gen Wxa có quá trình sao mã cao và gen GUS hoạt động mạnh, với loài mang gene Wxb thì cho mứchoàn thành quá trình sao mã giảm và gene GUS hoạt động yếu Trên cơ sở đó tác giả đã phân các loài lúa theo mức tiến hoá được thể hiện ở hình 9 Hai loài O barthii và O Rufipogon đều có kiểu gene Wxa, hàm lượng amylose cao, được hình thành từ tổ tiên hoang dại của chúng cũng mang gene Wxa và cho hàm lượng amylase cao Loài phụ O glaberrima mang gene Waa được tiến hóa từ O barthii Hai loài phụ O sativa indica và O sativa japonica có tổ tiên là O Rufipogon, nhưng indica mang gene Wxa với hàm lượngamylose cao còn loài japonica mang kiểu gen có chứa đột biến Wxb cho hàm lượng amylase trung bình.

Khi xác định trình tự lặp TC (TC repeats) Hirano và cs sử dụng SSR và nhân lên trình tự microsatellite DNA có chứa trình vùng nu đột biến ở đầu 5’ intron 1 Hình 6

Tại Việt Nam, các nhà chọn giống ở đồng bằng sông Cửu Long đã sử dụngMAS trong chọn giống lúa có hàm lượng amylose thấp và trung bình trên cơ sở ứngdụng microsatellite marker liên kết rất chặt với gen Waxy (Nguyễn Thị Lang, 2004 )

PHẦN III NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1.Vật liệu nghiên cứu: Sử dụng 40 giống lúa địa phương được lưu giữ trong tập đoàn

giống của khoa Công Nghệ Sinh Học - Trường Đại Học Nông Nghiệp –Hà Nội.

3.2 Nội dung nghiên cứu

3.2.1 Đánh giá các chỉ tiêu chất lượng gạo của một số giống lúa địa phương:nhiệt hoá hồ, độ bền gel, và hàm lượng amylose.

3.2.2.Sử dụng chỉ thị phân tử phát hiện gen quy định hàm lượng amylose củamột số giống địa phương.

3.3 phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Phương pháp đánh giá các chỉ tiêu chất lượng gạo

Nhiệt hoá hồ

Lấy 6 hạt gạo đã xát trắng, không có vết nứt, gãy, sắp vào đĩa petri Cho vào mỗiđĩa 10 ml dung dịch KOH 1.7%, đậy nắp và để trong 23 giờ ở nhiệt độ 30oC Nhiệt trởhồ được xác định bằng mức lan rộng và độ trong suốt của gạo sau khi xử lý (theophương pháp của Little và cs) Đánh giá nhiệt hoá hồ và độ phân huỷ theo thang điểmIRRI.(1996)

Phân tích độ bên gel (gel cosistency)

Lấy 100 mg bột cho vào ống nghiệm, cho vào 0.2 ml Ethanol 95% có chứa0.025% thymol blue, 2ml KOH 0.2N và lắc đều Đậy ống nghiệm và đem chưng cáchthuỷ trong 8 phút rồi lấy ra, để yên 5 phút, sau đó làm lạnh bằng nước đá trong 20 phút.Để ống nghiệm nằm ngang cho gel chảy ra từ từ và để 1giờ đến khi gel đặc lại, đo chiềudài gel (theo phương pháp của N Dela Cruz và G.S Khush) Phân cấp độ bền gel theothang điểm của IRRI (1996)

Phân tích hàm lượng amylose

Định lượng amylose theo phương pháp của H Seko, 2003: hạt lúa được bóc vỏ,xát trắng, nghiền nhỏ Lấy 100 mg bột đã nghiền, bổ sung vào 1ml Ethanol 95%, 9 mlNaOH 1N Đun sôi ở 100oC trong 10 phút và định mức cho đủ 100 ml Lấy 5 ml dungdịch hoà tan, cho thêm 1 ml CH3COOH 1M, 2 ml dung dịch iodine Định mức cho đủ100 ml, giữ ấm ở 30oC trong thời gian 20 phút rồi đo OD ở bước sóng 620 nm trên máyđo quang phổ và đọc giá trị Đối chiếu bảng quy đổi tìm ra hàm lượng amylose Phânnhóm hàm lượng amylose theo tiêu chuẩn IRRI (1988)

3.3.2 Tách chiết ADN tổng số

2 cm mẫu lá non thu vào buổi sáng được cắt nhỏ và nghiền với 400 µl dịch chiết(50mM Tris-HCl pH8.0, 25mM EDTA, 300mM NaCl và 1%SDS) cho tới khi thànhdịch màu xanh lá cây Bổ sung 400µl dịch chiết vào cối rồi chuyển sang ống eppendorf.Thêm 700 µl dung dịch phenol: chloroform: Isoamyalcohol (25:24:1), ly tâm và thudịch nổi Tủa ADN bằng ethanol 99,9% Thu tủa và hoà trong TE (10mM Tris-HCl pH8.0, 1mM EDTA pH 8.0).

3.3.3 Phương pháp xác định gen Wx bằng kỹ thuật PCR

Chúng tôi sử dụng cặp mồi PCR-AccI CAPS marker được thiết kế bởi Cai và cs

( 2002), mồi sẽ được gắn và nhân lên một đoạn 530bp có chứa trình tự vùng xảy ra độtbiến thay nu G bởi nu T ở vị trí cắt 5’ intron1

Trình tự primer PCR-AccI CAPS marker (Cai et al, 2002)

Forward primer(Wx-F) 5’-gcttcacttctctgcttgtg-3’Reverse primer(Wx-R) 5’-atgatttaacgagttgaa-3’

Chuẩn bị thành phần phản ứng PCR với thể tích 25μl gồm: Thành phần phản ứng PCR

với thể tích 25μl gồm: 0.2μl Taq DNA polymerase, 2.5 μl Taq Buffer 10X,l gồm: 0.2μl gồm: 0.2μl Taq DNA polymerase, 2.5 μl Taq Buffer 10X,l Taq DNA polymerase, 2.5 μl gồm: 0.2μl Taq DNA polymerase, 2.5 μl Taq Buffer 10X,l Taq Buffer 10X,

2.5 μl gồm: 0.2μl Taq DNA polymerase, 2.5 μl Taq Buffer 10X,l MgCl2 25mM, 0.5 μl gồm: 0.2μl Taq DNA polymerase, 2.5 μl Taq Buffer 10X,ldNTP 10mM, 1μl gồm: 0.2μl Taq DNA polymerase, 2.5 μl Taq Buffer 10X,l Wx-F, 1μl gồm: 0.2μl Taq DNA polymerase, 2.5 μl Taq Buffer 10X,l Wx-R, 15.3μl gồm: 0.2μl Taq DNA polymerase, 2.5 μl Taq Buffer 10X,l nuclerase freewater và 1μl gồm: 0.2μl Taq DNA polymerase, 2.5 μl Taq Buffer 10X,l DNA tổng số Mỗi mẫu được cho vào ống eppendorf có tên tương ứng,đưa lên máy chạy PCR, kiểm tra và thiết lập chu kỳ hoạt động: 95oC trong 3’; 35 chukỳ: 94oC – 45’’, 58oC– 45” ,72oC- 45” và 72oC trong 10 phút Sau khi chạy phản ứngPCR đem điện di trên gel agarose 1% phát hiện gene.

PHẦN IV KẾT QUẢ4.1 Đánh giá nhiệt hoá hồ

Nhiệt độ hoá hồ là khoảng nhiệt độ mà hạt tinh bột bắt đầu trương phồng lênkhông thuận nghịch trong nước nóng Trên cơ sở phương pháp của Little và cs, chúngtôi đã tiến hành đánh giá và tìm được khoảng nhiệt độ hoá hồ của các giống theo tiêuchuẩn của IRRI Gạo của những giống có nhiệt độ hoá hồ cao sẽ không bị phân huỷtrong dd KOH, gạo của những giống có nhiệt độ hoá hồ trung bình sẽ bị phân hủy mộtphần Kết quả được trình bày ở bảng 1.1(lúa tẻ) và bảng 1.2(lúa nếp)

Bảng 1.1 Bảng kết quả đánh giá nhiệt hoá hồ

TTgiốngTênĐộ phân huỷtrong kiềmNhiệt hoá hồTTgiốngTênĐộ phân huỷ trong kiềmNhiệt hoá hồ

1 645 Thấp Cao (>75oC) 14 10172 Thấp Cao (>75oC)2 10059 Cao Thấp (<69oC) 15 10175 Thấp Cao (>75oC)3 10063 Thấp Cao (>75oC) 16 10243 Thấp Cao (>75oC)4 10067 Cao Thấp (<69oC) 17 10244 Thấp Cao (>75oC)5 10069 Thấp Cao (>75oC) 18 10246 Thấp Cao (>75oC)6 10091 Cao Thấp (<69oC) 19 10247 Thấp Cao (>75oC)7 10101 Cao Thấp (<69oC) 20 10248 Thấp Cao (>75oC)8 10111 Thấp Cao (>75oC) 21 10259 Thấp Cao (>75oC)9 10115 Thấp Cao (>75oC) 22 10279 TB TB (70-74oC)10 10119 Cao Thấp (<69oC) 23 10715 Cao Thấp (<69oC)11 10120 Cao Thấp (<69oC) 24 10716 Cao Thấp (<69oC)12 10122 Cao Thấp (<69oC) 25 CL645 Cao Thấp (<69oC)13 10164 Thấp Cao (>75oC) 26 Kim32B Thấp Cao (>75oC)

Bảng 1.2 Kết quả đánh giá nhiệt hoá hồ của các giống nếp địa phương

Độ phân huỷ

Độ phân huỷ

1 10057 TB TB (70-74oC) 8 10637 TB TB (70-74oC)2 10103 Cao Thấp (<69oC) 9 10640 Cao Thấp (<69oC)3 10118 TB TB (70-74oC) 10 10641 Cao Thấp (<69oC)4 10167 Cao Thấp (<69oC) 11 10668 Cao Thấp (<69oC)5 10169 TB TB (70-74oC) 12 10675 TB TB (70-74oC)6 10171 Cao Thấp (<69oC) 13 10685 TB TB (70-74oC)7 10173 TB TB (70-74oC) 14 10698 TB TB (70-74oC)Kết quả đánh giá trên 26 giống lúa tẻ địa phương cho thấy có 15 giống có độphân huỷ trong kiềm thấp và nhiệt độ hoá hồ cao đó là: 10063; 10069; 10164;… , và 10giống có độ phân huỷ trong kiềm cao, nhiệt độ hoá hồ thấp, chỉ có giống 10115 có độphân huỷ trong kiềm và nhiệt hoá hồ trung bình Các giống lúa nếp đều có nhiệt hoá hồthấp hoặc trung bình điều này có thể có liên quan đến hàm lượng amylose rất thấp tronghạt tinh bột của chúng Tinh bột gạo nếp thành phần chủ yếu là amylopectin nên dễphân huỷ trong kiềm và hoá hồ ở nhiệt độ thấp hoặc trung bình

4.2 Kết quả đánh giá độ bền gel

Độ bền gel là một chỉ tiêu quyết định độ mềm dẻo của cơm Các giống có cùnghàm lượng amylose nhưng có thể khác nhau về độ bền gel, từ đấy ảnh hưởng đến chấtlượng thương phẩm của lúa, gạo Do đó chúng tôi đánh giá độ bền gel một số giống địaphương để làm cơ sở cho chọn vật liệu chọn tạo giống lúa sau này Kết quả được trìnhbày ở bảng 2.1 (với các dòng tẻ) và bảng 2.2 ( với các giống nếp)

Bảng 2.1 kết quả đánh giá độ bền gel một số giống tẻ địa phương

TTGiốngTênGel (mm)ChiềudàiXếp loạiTTGiốngTênGel (mm)ChiềudàiXếp loại

Chiều dài

gel (mm)Xếp loạiTT

Trong tất cả 14 giống lúa nếp đều có chiều dài 90mm và rất mềm Điều này phùhợp với hàm lượng amylopectin cao ở trong hạt tinh bột lúa nếp Các giống có hàmlượng amylopectin cao (AC thấp) thường dẻo và rất mềm

4.3 Kết quả đánh giá hàm lượng amylose

Amylose là thành phấn cấu trúc cơ bản của tinh bột lúa, hàm lượng của nó tronghạt tinh bột có ảnh hưởng tới một số đặc tính hoá lý tinh bột, từ đó ảnh hưởng tới chấtlượng thương phẩm của lúa gạo Amylose được mã hoá bởi gene Wx, các dạng thể hiệnkhác nhau (cấu trúc phân tử của gene) của Wx sẽ cho các AC khác nhau, ngoài rachúng còn phụ thuộc các kiểu gen phụ Sbe1, Sbe3 tương ứng Đây cũng là một trongcác yếu tố quan tâm của các nhà nghiên cứu, nhà chọn giống Do đó chúng tôi khảo sáthàm lượng amylose (AC) của một số giống địa phương, làm cơ sở cho việc đối chiếuđánh giá với kết quả nghiên cứu kiểu gene waxy, sbe, sbe3 trên cả 3 locus sau này Kếtquả đánh giá được thể hiện ở bảng 3.1 và 3.2

Trong 26 giống lúa tẻ đựơc khảo sát có 2 giống hàm lượng Amylose rất thấp:645; 10067, một giống AC thấp, một giống AC trung bình, còn lại 22 giống có AC cao.Số liệu này cho thấy đa số các giống có mức AC cao, mức AC thấp hoặc trung bìnhchiếm tỷ rất ít Đặc biệt trong 14 giống lúa lúa nếp thì có 5 giống cho thấy hàm lượngAmylose rất thấp (3-9%), kết quả này có thể do những thay đổi di truyền mà nguyênnhân từ sự thoái hoá giống.

Bảng3.1: Kết quả đánh giá hàm lượng Amylose các giống tẻ địa phương

TTTên giốngACXếp loạiTTTên giốngACXếp loại

Bảng 3.2 Kết quả đánh giá hàm lượng amylose của các giống lúa nếp địa phương

4.4 Kiểm tra độ tinh sạch của ADN tách chiết

Sau khi tách chiết DNA, chúng tôi chạy điện di để kiểm tra độ nguyên vẹn, tinhsạch Kết quả điện di 5μl gồm: 0.2μl Taq DNA polymerase, 2.5 μl Taq Buffer 10X,l DNA ở hình 4.1

Giếng 1:IR64Giếng 2: Bắc ThơmGiếng 3:10115Giếng 4:10269Giếng 5:10063Giếng 6:10119Giếng 7:10122

Hình 4.1.Kết quả điện di kiểm tra DNA

Kết quả điện di kiểm tra độ tinh sạch cho thấy các vệt băng đều rõ, tập trung gọn điềunày chứng tỏ DNA chiết tách nguyên vẹn và khá tinh sạch

4.5 Kết quả sử dụng cặp mồi Wx –F và Wx – R Để phát hiện gen Wx

Chúng tôi sử dụng cặp mồi Wx-F và Wx- R được thiết kế bởi Cai et al 2002 đểnhân đoạn trình tự có chứa đột biến G thành T tại điểm nối giữa exon 1 và intron 1 Có11 giếng ứng với 11 giống được đánh số thứ tự từ trái sang phải Đối chứng là 3 giốngIR64, Bắc thơm và Jasmine đã được kiểm tra và xác định nhân đoạn đặc hiệu 530bp vớicặp mồi trên Sản phẩm của PCR được điện di trên gel agarose 1% Kết quả được thểhiện ở hình 4.2:

Hình 4.2 Kết quả nhân gene với cặp mồi Wx-F và Wx-R

Giếng1:10115Giếng 7:10120 Giếng2:10063Giếng 8:10269Giếng 3:10119Giếng 9:IR64Giếng 4:10122Giếng 10: Bắc thơmGiếng 5:10068Giềng 11: JasmineGiếng 6:10069Giếng 12: Ladder

Qua hình ảnh điện di cho thấy tất cả các giống đều có một vạch băng với kíchthước đúng bằng 530bp Kết quả này cho thấy độ chính xác của cặp mồi Wx-F và Wx-R là 100%

Để kết luận chính xác sản phẩm PCR nhân gen Wx có chứa đột biến, chúng tôilấy ngẫu nhiên mẫu số 3; 4 đem giải trình tự trên máy giải trình tự CEQ8000 tại trườngĐH Nông Nghiệp Hà Nội với mồi Wx-R và so sánh với trình tự gen trên ngân hànggen Kết quả cho thấy:

- Trình tự 2 mẫu thuộc gen Waxy của chi Oryza sativa

Sử dụng phần mềm Clustalx 1.83 căn trình tự 5 chuỗi bao gồm 2 chuỗi của hai mẫu 3; 4

và 3 chuỗi được lấy từ ngân hàng gen có mã genbank: GB/AB28143; GB/AB28143; GB/AB28142

- Sử dụng phần mềm Bioedit 3.3.19.0 tính ma trận tương đồng, kết quả:

Từ đó cho thấy cặp mồi Wx-F,R có tính đặc hiệu cao.

Điều này sẽ có ý nghĩa quyết định đến kết quả sử dụng enzym AccI cắt sản phẩmPCR khi nghiên cứu phân biệt các alen trên locus gen waxy cũng như việc xác định tácđộng gene trên cả ba locus Wx, Sbe1, Sbe3 đến hàm lượng amylose, amylopectin vàcác đặc tính hoá lý của hạt tinh bột trong nội nhũ lúa gạo.

PHẦN V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ5.1 Kết luận

Qua kết quả đánh giá nhiệt hoá hồ, độ bền gel, hàm lượng amylose và phươngpháp xác định gen waxy quy định hàm lượng amylose chúng tôi thấy rằng:

Về nhiệt hoá hồ

- Trong 26 giống lúa tẻ địa phương có 15 giống có độ phân huỷ trong kiềm thấp vànhiệt độ hoá hồ cao, và 10 giống có độ phân huỷ trong kiềm cao, nhiệt độ hoá hồ thấp,chỉ có giống 10115 có độ phân huỷ trong kiềm và nhiệt hoá hồ trung bình

- Trong 14 giống lúa nếp địa phương có 8 giống độ phân huỷ trong kiềm và nhiệt hoáhồ trung bình, 6 giống có độ phân huỷ trong kiềm cao và nhiệt hoá hồ thấp.

Về độ bền gel

- Trong 26 giống lúa tẻ địa phương, có 2 giống rất cứng, 10 giống trung bình, còn lạimột giống mềm: 10259 và 7 giống có độ bền gel rất mềm Tất cả 14 giống nếp địạphương đều có chiều dài gel 90 mm và rất mềm.

Về hàm lượng Amylose

- Trong 26 giống lúa tẻ đựơc khảo sát có 2 giống hàm lượng Amylose rất thấp: 645;10067, một giống AC thấp, một giống AC trung bình, còn lại 22 giống có AC cao.- Trong 14 giống lúa nếp địa phương có 6 giống nếp: 10173; 10685; 10640; … còn 8 giống: 10103; 10118; 10167; … có hàm lượng amylose rất thấp (3-9%), kết quả này có thể do những thay đổi di truyền mà nguyên nhân có thể từ sự thoái hoá giống

*Từ kết quả đánh giá các chỉ tiêu chất lượng của các giống lúa địa phương ta thấy không phải các giống có hàm lượng amylose cao thì đều có nhiệt độ hoá hồ cao và cứng và ngược lại , điều này cho thấy độ bền gel, nhiệt hoá hồ liên quan không chặt vớihàm lượng amylose.

Về xây dựng phương pháp xác định gene waxy quy định hàm lượng amylose: