ứng dụng dấu phân tử trong việc nhận diện một số tính trạng quan trọng ở lúa

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SHƯD ------------------------------- PHẠM HOÀNG ÂN ỨNG DỤNG DẤU PHÂN TỬ TRONG VIỆC NHẬN DIỆN MỘT SỐ TÍNH TRẠNG QUAN TRỌNG Ở LÚA LUẬN VĂN TỐT NGHỆP KỸ SƯ KHOA HỌC CÂY TRỒNG CHUYÊN NGHÀNH CÔNG NGHỆ GIỐNG CÂY TRỒNG Cần thơ, 2014 TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SHƯD ------------------------------- ỨNG DỤNG DẤU PHÂN TỬ TRONG VIỆC NHẬN DIỆN MỘT SỐ TÍNH TRẠNG QUAN TRỌNG Ở LÚA LUẬN VĂN TỐT NGHỆP KỸ SƯ KHOA HỌC CÂY TRỒNG CHUYÊN NGHÀNH CÔNG NGHỆ GIỐNG CÂY TRỒNG Cán hướng dẫn khoa học: Sinh viên thực hiện: Ts. Nguyễn Lộc Hiền Phạm Hoàng Ân MSSV: 3103322 Lớp: TT10Z1A1 Cần thơ, 2014 TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG BỘ MÔN DI TRUYỀN - GIỐNG NÔNG NGHIỆP Luận văn tốt nghiệp Kỹ sư Khoa Học Cây Trồng - chuyên ngành Công Nghệ Giống Cây Trồng với đề tài ỨNG DỤNG DẤU PHÂN TỬ TRONG VIỆC NHẬN DIỆN MỘT SỐ TÍNH TRẠNG QUAN TRỌNG Ở LÚA Do sinh viên Phạm Hoàng Ân thực hiện. Kính trình lên Hội đồng chấm luận văn tốt nghệp. Cần thơ, ngày tháng năm 2014 Cán hướng dẫn Ts. Nguyễn Lộc Hiền i TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG BỘ MÔN DI TRUYỀN - GIỐNG NÔNG NGHIỆP Hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp chấp nghận luận văn tốt luận văn tốt nghiệp kỹ sư ngành Khoa Học Cây Trồng - chuyên ngành Công Nghệ Giống Cây Trồng với đề tài: ỨNG DỤNG DẤU PHÂN TỬ TRONG VIỆC NHẬN DIỆN MỘT SỐ TÍNH TRẠNG QUAN TRỌNG Ở LÚA Do sinh viên Phạm Hoàng Ân thực bảo vệ trước Hội Đồng. Ý kiến hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp . Luận văn tốt nghiệp đánh giá Cần thơ, ngày tháng năm 2014 Thành viên hội đồng . . . DUYỆT KHOA Trưởng Khoa Nông Nghiệp ii LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan công trình nghiên cứu thân. Các số liệu kết trình luận văn trung thực chưa công bố luận văn nghiên cứu khoa học trước đây. Tác giả luận văn Phạm Hoàng Ân iii LƯỢC SỬ CÁ NHÂN I LÝ LỊCH SƠ LƯỢC Họ tên: Phạm Hoàng Ân Giới tính: Nam Sinh ngày 07 tháng 05 năm 1992 Dân tộc: Kinh Nơi sinh: Phước Hòa - Đông Phước - Châu Thành - Hậu Giang Số điện thoại: 01655587120 Email: hgan3322@yahoo.com Nơi thường trú: Phước Hòa - Đông Phước A - Châu Thành - Hậu Giang II QUÁ TRÌNH HỌC TẬP Tiểu học Thời gian đào tạo: từ năm 1996 – 2003 Trường: Tiểu học Ngô Hửu Hạnh Địa chỉ: Đông Phước A – Châu Thành – Hậu Giang Trung học sở Thời gian đào tạo: từ năm 2003 – 2007 Trường: Trung học sở Long Thạnh Địa chỉ: Long Thạnh – Phụng Hiệp – Hậu Giang Trung học phổ thông Thời gian đào tạo: từ năm 2007 – 2010 Trường: Trung học phổ thông Tân Long Địa chỉ: Tân Long - Phụng Hiệp – Hậu Giang Đại học Thời gian đào tạo: Từ năm 2010 – 2013 Trường: Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành: Công Nghệ Giống Cây Trồng, Khóa 36 Địa chỉ: Xuân Khánh – Ninh Kiều – Cần Thơ iv LỜI CẢM ƠN Kính dâng - Cha, mẹ hết lòng yêu thương dạy dỗ, nuôi nên người để có ngày hôm nay. Xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến - Thầy Nguyễn Lộc Hiền tận tình hướng dẫn thực tốt nghiên cứu để hoàn thành luận văn này. Xin chân thành cảm ơn - Chị Huỳnh Thị Ngọc Châu anh Nguyễn Quốc Chí nhiệt tình giúp đỡ kỹ thuật phòng thí nghiệm. - Bạn Nguyễn Thanh Danh, Nguyễn Phong Phú, Nguyễn Thanh Thảo, Trần Thị Kim Khoa, Nguyễn Thành Duy Tân, Lê Văn Quãng, Dương Trọng Khiêm giúp đỡ vượt qua khó khăn suốt trình tiến hành luận văn. - Quí thầy cô trường Đại Học Cần Thơ Khoa Nông Nghiệp Sinh Học Ứng Dụng truyền đạt kiến thức kinh nghiệm quí báo cho thời gian học trường. - Các anh chị khóa trước, bạn khóa em khóa sau học tập làm việc với hoạt động khối ngành, đoàn khoa. - Đặc biệt lớp Công nghệ giống trồng Khóa 36 trải qua năm tháng quên quãng đời sinh viên. Đó tình cảm quên đời. v PHẠM HOÀNG ÂN, 2014 “Ứng dụng dấu phân tử việc nhận diện số tính trạng quan trọng lúa”, luận văn tốt nghiệp kỹ sư Khoa học trồng chuyên ngành Công nghệ giống trồng, trường Đại Học Cần Thơ. Cán hướng dẫn: Ts. Nguyễn Lộc Hiền. TÓM LƯỢC Đối với Đồng sông Cửu Long lúa loại trồng đem lại hiệu kinh tế cao cho người nông dân. Bên cạnh đời sống người dân ngày nâng cao nên nhu cầu giống lúa gạo phải có chất lượng đặt biệt mùi thơm. Ngoài tình hình biết đổi khí hậu diễn nhanh dẫn đến khô hạn xâm nhập mặn làm cho diện tích đất trồng lúa ngày bị thu hẹp rầy nâu trở thành dịch hại quan trọng gây thất thu chí mùa. Để làm sở cho công tác lai tạo lọc giống mang đặc tính tốt nâng cao chất lượng lúa gạo, nhằm làm tăng giá trị kinh tế cho hạt lúa. Vì đề tài “Ứng dụng dấu phân tử việc nhận diện số tính trạng quan trọng lúa” thực nhằm mục tiêu tìm giống lúa có mang gen thơm, khả chịu hạn, kháng mặn kháng rầy nâu, phục vụ cho công tác chọn tạo giống. Trong tổng số 13 giống, nhận diện giống lúa mang gen thơm Jakouine, OM6161, OM6162, Jasmine 85. Có giống nhận diện có khả mang gen kháng rầu nâu: Bala Baglan, Monda Laghman, Nàng thơm Chợ Đào 1, Jakouine, OM6161, OM6162, Luke Andrab. Đã nhận diện 10 giống lúa có khả mang gen chịu hạn: Bala Baglan, Pashadi Laghman, Surjamkhi, Izayoi, OM6161, OM6162, OM6600, Cần Thơ 2, Jasmine 85. Có giống có khả mang gen kháng mặn: Pashadi Laghman, Surjamkhi, Jakouine, OM6162, OM6600, Cần Thơ 2, Luke Andrab. vi MỤC LỤC Đề mục Trang LỜI CAM ĐOAN iii LƯỢC SỬ CÁ NHÂN . iv LỜI CẢM ƠN v TÓM LƯỢC . vi MỤC LỤC vii DANH SÁCH HÌNH x DANH SÁCH BẢNG . xi DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT xii MỞ ĐẦU Chương LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 1.1 Nguồn gốc phân loại lúa . 1.1.1 Nguồn gốc 1.1.2 Phân loại lúa theo đặc tính thực vật 1.2 Giá trị kinh tế lúa gạo 1.2.1 Giá trị dinh dưỡng 1.2.2 Giá trị sử dụng 1.2.3 Giá trị thương mại 1.3 Mùi thơm lúa . 1.3.1 Chất tạo mùi thơm lúa . 1.3.2 Gen điều khiển tính trạng mùi thơm lúa . 1.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến mùi thơm lúa 1.3.3.1 Nhiệt độ . 1.3.3.2 Ẩm độ 1.3.3.3 Yếu tố đất đai . 1.3.3.4 Yếu tố dinh dưỡng 1.3.3.5 Ảnh hưởng hệ thống canh tác 1.3.3.6 Ảnh hưởng biện pháp bảo quản sau thu hoạch vii 1.3.4 Các phương pháp xác định mùi thơm lúa 10 1.3.4.1 Xác định mùi thơm lúa phương pháp cảm quan . 10 1.3.4.3 Xác định mùi thơm sắc ký khí phối phổ . 10 1.3.4.2 Xác định giống lúa thơm dấu phân tử 11 1.4 Sơ lược tình kháng rầy nâu 12 1.4.1 Khái niệm tính kháng rầy nâu giống lúa . 12 1.4.2 Phân loại tính kháng . 12 1.4.2.1 Tính kháng không di truyền 12 1.4.2.2 Tính kháng di truyền 13 1.4.3 Cơ chế tính kháng 13 1.4.3.1 Cơ chế không ưa thích . 13 1.4.3.2 Cơ chế kháng sinh 14 1.4.3.3 Cơ chế chịu đựng . 14 1.4.4 Ứng dụng công nghệ sinh học chọn giống lúa kháng rầy 14 1.5 Tính chịu hạn tác động hạn đến thực vật 15 1.5.1 Tính chịu hạn thực vật . 15 1.5.3 Các nguyên nhân gây hạn 15 1.5.3.1 Hạn không khí 15 1.5.3.2 Hạn đất . 16 1.5.3.3 Hạn toàn diện 16 1.5.4 Ứng dụng công nghệ sinh học chọn giống lúa chịu hạn 16 1.6 Cơ sở di truyền tính chống chịu mặn 18 1.6.1 Cơ chế chống chịu mặn . 18 1.6.2 Nghiên cứu di truyền số lượng tính chống chịu mặn 19 1.6.3 Sự thể gen chống chịu mặn 20 1.6.4 Ứng dụng công nghệ sinh học chọn giống lúa mặn . 21 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 22 2.1 Thời gian địa điểm thực đề tài . 22 2.2 Vật liệu nghiên cứu 22 viii Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Thời gian địa điểm thực đề tài Đề tài tiến hành từ tháng 6/2013 đến tháng 12/2013 phòng thí nghiệm Di truyền, Bộ môn Di Truyền Giống Nông Nghiệp, Khoa Nông Nghiệp Sinh Học Ứng Dụng, Trường Đại Học Cần Thơ. 2.2 Vật liệu nghiên cứu Bộ giống bao gồm 13 giống lúa nhiều vùng khác châu Á: Việt Nam, Afghanistan, India, Japan, Thailand (Bảng 2.1) Bảng 2.1 Danh sách 13 giống lúa thí nghiệm STT Tên giống Nguồn gốc Bala Baglan Afghanistan Monda Laghman Afghanistan Pashadi Laghman Afghanistan Surjamkhi India Nàng thơm Chợ Đào Việt Nam Izayoi Japan Jakouine Japan OM6161 Việt Nam OM6162 Việt Nam 10 OM6600 Việt Nam 11 Cần Thơ Việt Nam 12 Jasmine 85 Thái Lan 13 Luke Andrab Afghanistan 2.3Thiết bị, dụng cụ hóa chất sử dụng 2.3.1 Thiết bị dụng cụ - Cân điện tử Adventure OHAUS (Mỹ) - Water and oilbaths WB/ob 7-45 WBU 45 Memmert (Đức) - Máy vortex Taitec (Đức/0 - Máy ly tâm Mini CENTRIFUGE MCF – 1350 Jircas (Nhật) - Máy PCR GeneAmp PCR system 2700 (Amplied Biosystems – Malaysia) 22 - Bộ điện di ATTO CORPORATION AE 7344 - Máy đọc gel tia UV BioBlock Scientific (Pháp) - Máy ảnh Canon (Nhật) - Tủ lạnh SR – S22TN(S) SANYO (Nhật) - Tủ lạnh -290 MDF – 135 SANYO Electric Co (Nhật) - Các loại dụng cụ khác: tube 1,5 ml, típ, bao tay, cối chày nghiền mẫu, beaker, pipet,… 2.3.2 Hóa chất Hóa chất ly trích DNA: CTAB buffer, chloroform, mercaptoethanol, isopropanol,… Hóa chất PCR điện di: PCR buffer, Taq polymerase, dNTP, agarose tinh khiết, ethidium bromide,… 2.3.3 Primer Bảng 2.2 Trình tự mồi dùng thí nghiệm STT Đăc tính Tên mồi Trình tự (5’- 3’) External sense Primer (ESP) TTGTTTGGAGCTTGCTGATG Internal Fragrant Antisense Primer (IFAP) CATAGGAGCAGCTGAAATATATACC Internal Non-Fragrant sense Primer (INSP) CTGGTAAAAAGATTATGGCTTCA External Antisense Primer (EAP) AGTGCTTTACAAAGTCCCGC Nhận diện Tính thơm Kháng rầy nâu OPC07 Chịu hạn RM212 Kháng mặn RM10825 GTCCCGACGA Forward CCACTTTCAGCTACTACCAG Reverse CACCCATTTGTCTCTCATTATG Forward GGACACAAGTCCATGATCCTATCC Reverse CTTTCCTTTCCATCCTTGTTGC 2.4 Phương pháp nghiên cứu 2.4.1 Tách chiết DNA Các giống lúa sau gieo tuần tiến hành thu mẫu để ly trích DNA. Phương pháp ly trích tinh DNA từ mô áp dụng theo Doyle and Doyle (1990). 23 - Cân 100mg/mẫu lúa cho vào cối nghiền với 1000 µl dung dịch CTAB (đã ủ 650 15 phút). Cho hết dung dịch vừa nghiền vào tube thêm 10 µl ME, trộn đều. Sau ủ (10 phút lắc trộn mẫu lần). - Sau ủ xong cho vào tube 500µl CI, lắc đều. Ly tâm 13000 vòng/phút 10 phút. Lấy 500µl dung dịch bên cho vào tube mới, thêm vào 500µl CI, lắc đều. Ly tâm 13000 vòng 10 phút. - Lấy phần bên cho vào tube thêm vao 5µl RNase, trộn đều, ủ mẫu 370 giờ. - Cho thêm 500µl chloroform, trộn đều. Ly tâm 13000/phút vòng 10 phút. - Lấy phần bên cho vào tube thêm vào 400µl chloroform. Ly tâm 13000 vòng/phút 10 phút. - Lấy phần dung dịch bên cho vào tube thêm vào 300µl Isopropanol. Ủ ngăn đá 15 phút. - Ly tâm 13000 vòng 10 phút, bỏ dung dịch lấy phần kết tủa. - Rửa lần với ethanol 700, ly tâm 13000 vòng/phút 10 phút. - Rửa lần với ethanol 1000 ly tâm 13000 vòng/phút phút. - Bỏ dung dịch lấy kết tủa phơi mẫu giờ, thêm 30µl TE, trữ mẫu 200C. 2.4.2 Kiểm tra DNA phương pháp điện di agarose DNA sau ly trích tinh kiểm tra cách điện di gel agarose 1%. Cân 0,3g agarose cho vào bình tam giác thêm vào 30ml dung dịch TAE 1X, đậy kín màng bao thực phẩm, lắc cho vào microware đun sôi phút 40 giây. Trong trình đun, 50 giây tạm dừng đun, lấy lắc nhẹ để agarose tan TAE. Sau đun xong để nguội bớt cho vào khuôn điện di. Khi agarose đặc lại (sau 15 phút) nhẹ nhàng tháo cho gel vào dung dịch TAE 1X điện di, ý dung dịch phải ngậm gel. Trộn mẫu với 1µl loading dye 6X, 1µl DNA, 4µl nước cất giấy parafilm cẩn thận bơm mẫu vào giếng gel. Chạy điện di mẫu 45 phút 60V. Lấy gel nhuộm dung dịch ethidium bromide khoảng 15 phút, rửa lại với nước đem chụp ảnh với máy đọc gel tia UV. 24 2.4.3 Phản ứng PCR 2.4.3.1 Phản ứng PCR với primer ESP, IFLP, INSP, EAP Phản ứng PCR tiến hành thể tích 20 µl gồm: 14,4 µl nước cất, µl PCR Buffer 10X, 0,4µl dNTPs, 0,2µl Taq polymerase, 1µl DNA 2µl primer(0,5µl External sense Primer, 0,5µl Internal Fragrant Antisense Primer, 0,5µl Internal Non-Fragrant sense Primer, 0,5µl External Antisense Primer) máy GeneAmp PCR system 2700. 577 bp or 585 bp 355 bp INSP IFAP 257 bp Hình 2.1: Vị trí tương đối đoạn mồi ESP, IFAP, INSP, EAP sử dụng phản ứng PCR. Phản ứng PCR thực qua 30 chu kỳ gia nhiệt (Hình 3.1) máy PCR sau: phút 940C; 30 chu kỳ gồm 30 giây 940C, 30 giây 580C, 30 giây 720C; phút 720C. Sản phẩm trữ 40C. Nhiệt độ (0C) Thời gian (phút:giây) 94,0 2:00 94,0 0:30 58,0 72,0 72,0 0:30 5:00 0:30 4,0 30 chu kỳ Hình 2.2 Sơ đồ minh họa chu kỳ phản ứng PCR với primer ESP, IFAP, INSP, EAP 2.4.3.2 Phản ứng PCR với primer OPC07 Phản ứng PCR tiến hành thể tích 15 µl gồm: 11,6 µl nước cất, 1,5 µl PCR Buffer 10X, 0,4 µl dNTPs, 0,15 µl Taq polymerase, µl DNA, 0,4 µl OPC07 primer mồi máy GeneAmp PCR system 2700. 25 Phản ứng PCR thực qua 30 chu kỳ gia nhiệt (Hình 3.1) máy PCR sau: phút 950C; 30 chu kỳ gồm 30 giây 940C, 30 giây 400C, 30 giây 720C; phút 720C. Sản phẩm trữ 40C. Nhiệt độ (0C) 95,0 95,0 72,0 72,0 Thời gian (phút:giây) 5:00 0:30 40,0 0:30 5:00 4,0 0:30 30 chu kỳ Hình 2.3 Sơ đồ minh họa chu kỳ phản ứng PCR với primer OPC07 2.4.3.3 Phản ứng PCR với primer RM212 Phản ứng PCR tiến hành thể tích 20 µl gồm: 15,4 µl nước cất, µl PCR Buffer 10X, 0,4 µl dNTPs, 0,2 µl Taq polymerase, µl DNA, 0,5 µl H 0,5 µl T mồi máy GeneAmp PCR system 2700. Phản ứng PCR thực qua 30 chu kỳ gia nhiệt (Hình 3.1) máy PCR sau: phút 940C; 30 chu kỳ gồm 30 giây 940C, 30 giây 570C, 30 giây 720C; phút 720C. Sản phẩm trữ 40C. Nhiệt độ (0C) Thời gian (phút:giây) 94,0 5:0 94,0 0:30 60,0 72,0 72,0 0:30 5:0 0:30 4,0 30 chu kỳ Hình 2.4 Sơ đồ minh họa chu kỳ phản ứng PCR với primer RM212 2.4.3.4 Phản ứng PCR với primer RM10825 Phản ứng PCR tiến hành thể tích 20 µl gồm: 15,4 µl nước cất, µl PCR Buffer 10X, 0,4 µl dNTPs, 0,2 µl Taq polymerase, µl DNA, 0,5 µl H 0,5 µl T mồi máy GeneAmp PCR system 2700. Phản ứng PCR thực qua 30 chu kỳ gia nhiệt (Hình 3.1) máy PCR sau: phút 940C; 30 chu kỳ gồm 30 giây 940C, 30 giây 620C, 30 giây 720C; phút 720C. Sản phẩm trữ 40C. 26 Nhiệt độ (0C) 94,0 94,0 Thời gian (phút:giây) 5:0 0:30 72,0 72,0 0:30 7:0 62,0 0:30 4,0 30 chu kỳ Hình 2.5 Sơ đồ minh họa chu kỳ phản ứng PCR với primer RM10825 2.4.4 Điện di sản phẩm PCR - Điện di gel agarose Sản phẩm PCR với việc sử dụng primer (ESP, IFLP, INSP, EAP) OPC07 điện di gel agarose 1.5% dung dịch TAE 1X máy điện di với hiệu điện sau: 30 phút đầu hiệu điện 42V, 35 phút sau hiệu điện 60V. Nhuộm gel khoảng 15 phút ethidium bromide (1 mg/L), rửa lại với nước đem chụp ảnh gel máy chụp ảnh máy chiếu tia UV. Sự diện băng khuếch đại gel agarose đánh giá tồn gen thơm gen kháng rầy lúa. - Điện di gel polyAcrylamide Sản phẩm PCR với primer RM212 RM10825 chạy điện di gel PolyArylamide dung dịch TBE 0,5% máy ATTA Compact PAGE-twin với thời gian 60 phút hiệu điện 24V. Nhuộm gel khoảng 15 phút ethidium bromide (10 mg/L), rửa lại với nước đem chụp ảnh gel máy chụp ảnh máy chiếu tia UV. Sự diện băng khuếch đại gel acrylamide đánh giá tồn gen chịu hạn lúa. 27 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Ly trích DNA Kết điện di DNA gel agarose cho thấy hầu hết DNA ly trích có mức độ tinh chấp nhận được, nhiên số mẫu chưa thực tốt như: giếng 1,2,3 12 có tượng DNA bị nhiễm bẩn RNA DNA bị đứt gãy nhiều giếng khác (hình 3.1). Do thao tác, thời gian thu mẫu đến lúc ly trích lâu. 10 11 12 13 Hình 3.1 Kết diện di kiểm tra DNA agarose gel 1% 3.2 Nhận diện gen thơm với primer ESP, IFAP, INSP EAP Các đoạn mồi ESP EAP bắt cặp trình tự chung hai giống lúa thơm không thơm vị trí 580 bp(băng vị trí thứ nhất). Hai đoạn mồi ESP IFAP cho sản phẩm vị trí 257 bp dòng lúa thơm đồng hợp tử, hai đoạn mồi INSP EAP khuếch đại đoạn 355 bp dòng lúa không thơm đồng hợp tử. Ở giống lúa không thơm dị hợp tử xuất băng nêu (Bradbury ctv. 2005). Kết hình 3.2 cho thấy, tổng số 13 giống lúa có giống nhận diện có mang gen thơm, giống nhận diện gen thơm giống thuộc dạng dị hợp tử không thơm. Những giống lúa mang gen thơm có băng vị trí thứ hai 257 bp: Jakouine, OM6161, OM6162, Jasmine 85. Trong giống không mang gen thơm cho băng vị trí thứ hai 355 bp Bala Baghman, Pashadi Laghman, Surjamkhi, Nàng thơm Chợ Đào 1, Izayoi Luke Andrab. Bên cạnh giống lúa không thơm dị hợp tử cho băng vị trí 257 bp, 355 bp 580 bp: OM6600 Cần Thơ 2. 28 M 10 11 12 13 600 bp 500 bp 580 bp 400 bp 355 bp 300 bp 200 bp 257 bp - - - - - - + + + - - + - Hình 3.2 Phổ điện di sản phẩm PCR DNA 13 giống lúa với primer ESP, IFAP, INSP EAP M: ladder 1kb, 1: Bala Baglan, 2: Monda Laghman, 3: Pashadi Laghman, 4: Surjamkhi, 5: Nàng thơm Chợ Đào 1, 6: Izayoi, 7: Jakouine, 8: OM6161, 9: OM6162, 10: OM6600, 11: Cần Thơ 2, 12: Jasmine 85, 13: Luke Andrab Hien ctv. (2006) tiến hành phân nhóm giống thu thập Việt Nam, Nàng thơm Chợ Đào chia thành ba nhóm Nàng thơm Chợ Đào 1, Nàng thơm Chợ Đào 2, Nàng thơm Chợ Đào Nàng thơm Chợ Đào dựa việc tuyển chọn đặc điểm hình thái, nông học hương thơm. Trong nghiên cứu họ sử dụng KOH 1,7% kiểm tra cho kết không thơm giống Nàng thơm Chợ Đào 1. Nguyên nhân địa điểm thu giống nhóm khác mục đích thương mại nên Nàng thơm Chợ Đào bị lẫn tạp. Với primer này, có nhiều nhà khoa học nhà chọn giống nước tiến hành nghiên cứu. Sarhadi Hien, (2011) sử dụng primer để nhận diện thành công giống lúa thơm Pashadi Konar, Sarda Bala, Sela Doshi, Pashadi Konar, Germa Bala, Lawangi, Fajr, Qaserdashti Qaserdashti giống lúa thu thập nhiều quốc gia châu Á. 3.3 Nhận diện gen kháng rầy với primer OPC07 Kết quan sát phổ điện di hình 3.3 cho thấy có giống (Bala Baglan, Monda Laghman, Nàng thơm Chợ Đào 1, Jakouine, OM6161, OM6162, Luke Andrab) tổng 13 giống lúa có xuất băng vị trí 697 bp, theo Venkateswarlu (2012) giống lúa có diện băng 697 bp, có mang gen kháng rầy nâu. Những giống lúa có diện băng 846 bp: Surjamkhi, Izayoi, Cần Thơ 2, Jasmine 85 giống nhiễm rầy, không mang gen kháng. Tuy nhiên, giống Pashadi Laghman, OM6600 diện băng nào, primer OPC7 bắt cặp với gen hai giống lúa này. 29 Theo Venkateswarlu ctv. (2012), phân chia đa hình rõ ràng cá thể nhạy cảm cá thể kháng liên quan đến gen kháng rầy nâu phân tích quần thể trồng dồn phân ly. Như vậy, phân tích quần thể trồng dồn phân ly với RAPD marker OPC07 cá thể nhiễm rầy cho sản phẩn vị trí 846 bp cá thể kháng có sản phẩm vị trí 697 bp cung cấp lựa chọn trợ giúp tuyển chọn cá thể quần thể F2 IR50/pTb33, cho thấy kết thực thí nghiệm phù hợp với kết này. M 10 11 12 13 1000 bp 846 bp 500 bp 697 bp 400 bp + + - + - + + + - - + Hình 3.3 Phổ điện di sản phẩm PCR 13 giống lúa sử dụng primer OPC07 M: ladder 1kb Plus, 1: Bala Baglan, 2: Monda Laghman, 3: Pashadi Laghman, 4: Surjamkhi,5: Nàng thơm Chợ Đào 1, 6: Izayoi, 7: Jakouine, 8: OM6161, 9: OM6162, 10: OM6600, 11: Cần Thơ 2, 12: Jasmine 85, 13: Luke Andrab 3.4 Nhận diện gen chịu hạn với primer RM212 Kết quan sát phổ điện di hình 3.4 cho thấy có 10 giống có khả mang gen chịu hạn Bala Baglan, Pashadi Laghman, Surjamkhi, Izayoi, OM6161, OM6162, OM6600, Cần Thơ 2, Jasmine 85 giống có xuất băng vị trí 136 bp. Theo Zhu ctv. (2013), ông cho giống lúa nhận diện cặp mồi RM212 xuất băng vị trí 136 bp có khả mang gen chịu hạn. Ba giống xuất băng vị trí 154 bp: Monda Laghman, Nàng thơm Chợ Đào 1, Jakouine không mang gen chịu hạn. Theo Kanagaja ctv. (2010) cho thấy dấu phân tử RM212 liên kết với gen liên quan đến tính trạng cuộn gặp điều kiện hạn, đặc tính quan trọng cho giống lúa có khả chịu hạn. Đặc biệt giống Pashadi Laghman OM6600 sản phẩm nào, nguyên nhân sau: primer OPC07 tìm vị trí bắt cặp với gen giống lúa này. 30 M 14 M 10 11 12 13 14 200 bp 100 bp + - + + - + - + + + + + + + + 136 bp Hình 3.4 Phổ điện di sản phẩm PCR 13 giống lúa đối chứng cặp mồi RM212 M: ladder 1kb Plus, 1: Bala Baglan, 2: Monda Laghman, 3: Pashadi Laghman, 4: Surjamkhi, 5: Nàng thơm Chợ Đào 1, 6: Izayoi, 7: Jakouine, 8: OM6161, 9: OM6162, 10: OM6600, 11: Cần Thơ 2, 12: Jasmine 85, 13: Luke Andrab, 14: VND9520 3.5 Nhận diện gen kháng mặn với Primer RM10825 Kết phân tích phổ điện di hình 3.5 sản phẩm PCR từ cặp mồi RM10825 cho thấy xuất băng DNA đa hình. Trong gống Pashadi Laghman, Surjamkhi, Jakouine, OM6162, OM6600, Cần Thơ 2, Luke Andrab xuất vị trí 137 bp vị trí với Pokkali nên có khả mang gen chịu mặn. Có gống Monda, Laghman, Nàng thơm Chợ Đào 1, Jasmine 85 diện băng vị trí 181 bp đồng vị trí với IR28 nên mang gen nhiễm mặn. Kết phù hợp với kết Michael (2010) cho giống có xuất băng vị trí 137 bp vị trí với Pokkali có khả mang gen chịu mặn. Những giống xuất băng vị trí 181 bp đồng vị trí với IR28 mang gen nhiễm mặn. Đối với hai giống Bala Baglan, Izayoi không xuất băng vị trí 137 bp mà xuất băng vị trí 125 bp nên khả mang gen kháng mặn. M 14 15 M 14 15 10 11 12 13 181 bp 137 bp 200 bp 100 bp + - - - + + - - + + - + + + + - + Hình 3.5 Phổ điện di sản phẩm PCR 13 giống lúa đối chứng cặp mồi RM10825 M: ladder 1kb Plus, 1: Bala Baglan, 2: Monda Laghman, 3: Pashadi Laghman, 4: Surjamkhi, 5: Nàng thơm Chợ Đào 1, 6: Izayoi, 7: Jakouine, 8: OM6161, 9: OM6162, 10: OM6600, 11: Cần Thơ 2, 12: Jasmine 85, 13: Luke Andrab, 14: Pokkali, 15: IR28 31 3.6 Kết nhận diện dấu phân tử tính trạng thơm, kháng rầy, chịu hạn, chịu mặn Bảng 3.1 Tổng hợp kết phân tích phổ điện di với tính trạng thơm, kháng rầy, chịu hạn, chịu mặn STT Tên giống Thơm Kháng rầy Chịu hạn Kháng mặn Bala Baglan - + + + Monda Laghman - + - - Pashadi Laghman - + - Surjamkhi - - + - Nàng thơm Chợ Đào - + - + Izayoi - - + + Jakouine + + - - OM6161 + + + + OM6162 + + + + 10 OM6600 - + + 11 Cần Thơ - - + + 12 Jasmine 85 + - + - 13 Luke Andrab - + + + - Dựa vào kết tổng hợp Bảng 3.1 cho thấy giống OM6162 OM6161 hai có khả mang gen chịu hạn, kháng mặn, kháng rầy mang gen thơm 2AP. - Có giống Bala Baglan, Luke Andrab hai giống lúa không mang gen thơm 2AP có khả nang mang gen kháng rầy nâu, chịu hạn kháng mặn. - Có giông có khả mang gen chịu hạn kháng mặn: Izayoi, OM6600, Cần Thơ 2. - Đối với giống Nàng thơm Chợ Đào không mang gen thơm 2AP có khả mang gen kháng rầy nâu kháng mặn. 32 - Hai giống Jakouine Jasmine 85đều có mang gen thơm có khả mang gen kháng rầy nâu có giống Jakouine Jasmine 85 gen kháng rầy nâu không mang gen kháng mặn mang gen chịu hạn. - Giống Pashadi Laghman, Surjamkhi có khả mang gen chịu hạn. - Còn lại giống Monda Laghman mang gen kháng rầy nâu. 33 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1 Kết luận Đã nhận diện giống lúa mang gen thơm Jakouine, OM6161, OM6162, Jasmine 85 tổng số 13 giống. Chín giống lại: Bala Baglan, Monda Laghman, Pashadi, Laghman, Surjamkhi, Nàng thơm Chợ Đào 1, Izayoi, OM6600, Cần Thơ 2, Luke Andrab không mang gen thơm Primer ESP, IFAP, INSP EAP. Có giống 13 giống lúa nhận diện có khả mang gen kháng rầy nâu: Bala Baglan, Monda Laghman, Nàng thơm Chợ Đào 1, Jakouine, OM6161, OM6162, Luke Andrab với primer OPC7. Đã nhận diện 10 giống lúa có khả mang gen chịu hạn: Bala Baglan, Pashadi Laghman, Surjamkhi, Izayoi, OM6161, OM6162, OM6600, Cần Thơ 2, Jasmine 85 với việc sử dụng mồi RM212. Với việc sử dụng primer RM10825, nhận diện giống có khả mang gen kháng mặn: Pashadi Laghman, Surjamkhi, Jakouine, OM6162, OM6600, Cần Thơ 2, Luke Andrab. Các giống lại không xuất band vị trí 137 bp nên khả mang gen kháng mặn Primer RM10825. 4.2 Đề nghị - Sử dụng thị phân tử chuyên biệt để phục vụ cho công tác chọn giống, rút ngắn thời gian hiệu nhất. - Đưa giống nhận diện vào chương trình chọn giống lúa có phẩn chất cao có khả chống chịu với môi trường. - Đối với hai đặc tính kháng mặn chịu hạn nên kiểm tra lại đặc tính tốt phương pháp thử hạn thử mặn. - Nên tiến hành thí nhiều nghiệm điều kiện đồng kết hợp với việc thống kê so sánh, đánh giá lại tương thích việc sử dụng đánh dấu phân tử so với điều kiện thực tế. 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Hiệp hội Lương thực Việt Nam, (2011). Số liệu thống kê - Nông nghiệp http://vietfood.org.vn/vn/default.aspx?c=74&n=5900. Nguyễn Ngọc Đệ (2008). Giáo trình lúa, Trường Đại Học Cần Thơ. Nguyễn Thị Lang Bùi Chí Bửu (2004a). Ứng dụng marker phân tử đánh dấu gen mùi thơm lúa, Tại chí Di truyền học ứng dụng, số năm 2004. Nguyễn Thị Lang Bùi Chí Bửu (2004b). Xác định gen fgr điều khiển tính trạng mùi thơm phương pháp Fine Mapping với Microseltellites, Hội nghị quốc gia chọn tạo giống lúa, nhà xuất Nông Nghiệp TP.HCM, tr. 192199. Nguyễn Thị Lang Bùi Chí Bửu (2004c). Nghiên cứu di truyền tính kháng rầy nâu lúa Oryza satyva L., Hội nghị quốc gia chon tạo giống lúa, Nxb Nông Nghiệp TP.HCM, tr. 200-208. Quan Thị Ái Liên Võ Công Thành (2007). Xác định dấu phân tử tương quan với mùi thơm dòng, giốnglúa thơm-tính toán di truyền dấu phân tử protein kỹ thuật điện di protein SDS-PAGE, kỹ yếu hội nghị khoa học tuổi trẻ trường Đại học Cao đẳng khối Nông-Lâm-Ngư toàn quốc lần thứ ba, tháng năm 2007, tr. 537-544. Phạm Văn Lầm, (2006). Các biện pháp phòng chống dịch hại trồng nông nghiệp, Nxb Nông Nghiệp Tổng Cục Thống Kê (GSO). (2008). Số liệu thống kê - Nông nghiệp http://www.gso.gov.vn/Default.aspx?tabid=217. Trần Văn Đạt, 2005. Sản xuất lúa gạo giới: Hiện trạng khuynh hướng phát triển kỷ 21. NXB Nông Nghiệp, tr.7-9. Trương Bá Thảo (2006), Ứng dụng thị phân tử sở pản ứng chuổi polymerase (PCR) để chọn tạo giống lúa (Oryza satyva L.) có chất lượng cao, Luận án tiến sỉ Nông Nghiệp, Trương Đại Học Cần Thơ. 35 Tiếng Anh Bellwood, P (2005). First Farmers: The Origins of Agricultural Societies, Blackwell Publishing Ltd, Malden, USA. Ahn SW, CN Bollich and SD Tanksley. (1992). RFLP tagging of a gene for aroma in rice. Theor. Appl. Genet. 87:27-32 Bradbury LMT, Fitzgerald TL, Henry RJ, Jin Q, Waters DLE. (2005b). The gene for fragrance in rice. Plant Biotech. J. 3: 363-370 Bradbury LMT, Henry R, Jin Q, Reinke, RF, Waters DLE. (2005a). A perfect marker for fragrance genotyping in rice. Mol. Breed. 16: 279-283 Chandler, R.F. (1979). Rice in the Tropics: A guide to the development of national programs. Westview Press/Boulder, Colorado, pp 256. Efferson, J.N. (1965). Rice quality in world markets, In Rice grain quality and marketing, IRRI, 1-13 Gibson, J (1976). As I saw it, Mukul Pakashan, New Delhi Hien N.L, T Yoshihashi, W.A. Sarhadi, And Y. Hirata (2006a). Sensory test for arama and quantitative analysis of 2-Acetyl-1-pyrroline in Asia Aromatic rice varieties Hien NL, Yoshihashi T, Sarhadi WA, Thanh VC, Oikawa Y, Hirata Y. (2006b). Evaluation of aroma in rice (Oryza sativa L.) using KOH method, molecular marker and measurement of 2-acetyl-1-pyrroline concentration. Jpn. J. Trop. Agri. 50: 190-198 Hien NL, Sarhadi WA, Oikawa Y, Hirata Y. (2007). Genetic diversity of morphological responses and the relationships among Asia aromatic rice (Oryza sativa)cultivars. Jpn. Soc. Trop. Ecol. 16: 343-355 Kanagaraj P., K.S.J Prince, J.A. Sheeba, K. R. Biji, S.B. Paul, A. Senthil and R.C. Babu, (2010). Microsatellite markers linked to drought resistance in rice (Oryza sativaL.). Sarhadi, W.A., Hien N.L, M. Zanjani, W. Yosofzai, T. Yoshihashi and,Y. Hirata, (2011). Comparative Analyses for Aroma and Agronomic Traits of Native Rice Cultivars from Central Asia. Thomsom M.J., M.D Ocampo, J. Egdane, M.A Rahman, A.G. Sajise, D.L. Adorada, E.Tumimbang-Raiz, (2010). Characterizing theSaltolQuantitative Trait Locus for Salinity Tolerance in Rice. 36 Widiaia,R., J.D. Craske, and M. Wootton (1996). Changes in votatile components of paddy, brown and white fragrant rice during storage, J. Sci. of food and Agric. 71 (2):218-224. Yoshihashi T. (2002). Quantitative analysis on 2-acetyl-1-pyrroline of aromatic rice by stable isotope dilution method and model studies on its formation during cooking. J. Food Sci. 67: 619-622 Zhu Y. (2013). High resolution melting curve analysis: an efficient method for fingerprinting of hybrid rice cultivars and their parental lines. AJCS 7(13):2048-2053 37 [...]... quốc gia, cung cấp đầy đủ chất dinh dưỡng trong bữa ăn Xuất phát từ thực tế trên, nhu cầu chọn ra những giống lúa còn giữ được tính trạng mùi thơm, có khả năng chịu hạn, kháng mặn và kháng được rầy nâu đang là vấn đề được quan tâm, phát triển Do đó, đề tài Ứng dụng dấu phân tử trong việc nhận diện một số tính trạng quan trọng ở lúa đã được thực hiện nhằm làm cơ sở đa dạng thêm nguồn giống có chất lượng,... hoạt bởi bệnh đạo ôn và một số bệnh hại lúa khác Những cây lúa có gen MAPK5 đều sống được qua hạn và lạnh, những cây lúa có gen bị ức chế có xu hướng bị chết do stress gây ra (Yang and Xiong, 2003) Để tìm mối liên hệ giữa khả năng chịu hạn của lúa với các dấu phân tử SSR, Meng và cộng tác viên (2007) đã sử dụng 525 dấu phân tử SSR được sử dụng để biểu hiện đa hình giữa giống cha mẹ Có 121 dấu phân tử. .. cộng tính Hệ số di truyền tính chống chịu thông qua các tính chống chịu như vậy rất thấp Trong giai đoạn trưởng thành của cây lúa, tính trạng 19 chiều cao cây, năng suất trong điều kiện xử lý mặn được điều khiển bởi nhóm gen cộng tính (Bùi Chí Bửu, 2003) Trong phân tích di truyền số lượng thông qua lai diallel 6x6, năng suất lúa thể hiện tính hoạt động của nhóm gen cộng tính không có ý nghĩa trong. .. Programme xii MỞ ĐẦU Trong nền nông nghiệp, lúa chiếm một vị trí vô cùng quan trọng, đặc biệt lúa là loại lương thực chính ở vùng Châu Á Thống kế của tổ chức lương thực thế giới (FAO, 2008) cho thấy, có 114 quốc gia trồng lúa, trong đó 18 quốc gia có diện tích trồng lúa trên 1.000.000ha, tập trung nhiều ở Châu Á Đối với Việt Nam, nền nông nghiệp chủ yếu là trồng lúa, nhưng diện tích trồng lúa lại đang... nông nghiệp đại học Arkansas (Mỹ) đã nhận diện được gen điều khiển tính chống chịu hạn, mặn và lạnh ở cây lúa (Yang, 2003) Yang và ctv (2003) đã xác định được gen quan trọng MAPK5 (Mitogen Activated Protein Kinase 5) trong 200 gen liên quan đến tính chống chịu và tính kháng bệnh MAPK5 điều chỉnh việc sản xuất kinase, một protein điều chỉnh việc phản ứng của cây lúa đối với những yếu tố hạn chế như... trích chất 2-acetyl-1-pyrroline trong cây lúa thơm Chất này không bền, dễ bị ảnh hưởng bởi điều kiện môi trường và kỹ thuật canh tác 1.3.2 Gen điều khiển tính trạng mùi thơm trên cây lúa Gen điều khiển tính trạng mùi thơm trên cây lúa là một trong những mối quan tâm hàng đầu của các nhà nghiên cứu vì nó quyết định trực tiếp đến sự thành công trong công tác chọn tạo giống lúa thơm Gen này đã được nhiều... nhưng trở nên có ý nghĩa trong điều kiện xử lý mặn (Narayanan và ctv., 1990) Năng suất lúa bị giảm là do ảnh hưởng của mặn Một giống lúa có ưu thế hoạt động gen tính đối với năng suất sẽ là điều kiện thuận lợi cho chọn lọc giống trong môi trường mặn (Bùi Chí Bửu, 2003) Trong phân tích di truyền số lượng thông qua lai diallel 9x9, tính trạng chống chịu mặn được xem xét qua tỉ lệ thấp của Na+/K+ ở trong. .. và ctv., 1987) Mặn ảnh hưởng đến hoạt động sinh trưởng của cây lúa dưới mức độ thiệt hại khác nhau, ở từng giai đoạn sinh trưởng phát triển khác nhau (Bùi Chí Bửu, 2003) Nhiều nghiên cứu ghi nhận rằng tính chống chịu mặn xảy ra ở giai đoạn nảy mầm Sau đó, trở nên rất mẩn cảm trong giai đoạn mạ (cây có 2-3 lá), rồi trở nên chống chịu trong giai đoạn tăng trưởng Kế đến, nhiễm trong thời kỳ thụ phấn và... mặn Nghiên cứu di truyền số lượng co thấy cả hai ảnh hưởng hoạt động của gen cộng tính và gen không cộng tính điều đó có ý nghĩa trong di truyền tính chống chịu mặn (Bùi Chí Bửu, 2003) Trong giai đoạn mạ của cây lúa, các tính trạng chiều dài chồi, hàm lượng Na và K trong chồi, trọng lượng khô của chồi, và rể thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa giữa giống nhiễm và giống kháng Thình trạng này chủ yếu được... của cây lúa với trọng lượng phân tử 190 bp và băng thể hiện không thơm là 120 bp (Nguyễn Thị Lang và Bùi Chí Bửu, 2004a và 2004b) Gần đây, một marker đối với các dòng lúa thơm đã được nhận diện trên gen mã hóa cho betatain aldehyde dehydrogenase 2 (BAD2) nằm trên nhiễm sắc thể số 8 của lúa Oryza sativa L thông qua sự loại bỏ 8 cặp bazơ Marker này được xem là một trong những marker hoàn hảo trong công . mang đặc tính tốt nâng cao chất lượng của lúa gạo, nhằm làm tăng giá trị kinh tế cho hạt lúa. Vì vậy đề tài Ứng dụng dấu phân tử trong việc nhận diện một số tính trạng quan trọng ở lúa đã. viên. Đó là tình cảm tôi không thể quên trong cuộc đời. vi PHẠM HOÀNG ÂN, 2014 Ứng dụng dấu phân tử trong việc nhận diện một số tính trạng quan trọng ở lúa , luận văn tốt nghiệp kỹ sư Khoa. Trồng - chuyên ngành Công Nghệ Giống Cây Trồng với đề tài: ỨNG DỤNG DẤU PHÂN TỬ TRONG VIỆC NHẬN DIỆN MỘT SỐ TÍNH TRẠNG QUAN TRỌNG Ở LÚA Do sinh viên Phạm Hoàng Ân thực hiện và bảo vệ trước