Ứng dụng Marker phân tử trong xác định dòng bất dục đực tế bào chất (CMS) và dòng phục hồi hữu dục Rf ở ớt (Capsicum annuum L.)

TRNG I HC M THÀNH PH H CHÍ MINH KHOA CÔNG NGH SINH HC  BÁO CÁO KHÓA LUN TT NGHIP  tài: NG DNG MARKER PHÂN T TRONG XÁC NH DÒNG BT DC C T BÀO CHT (CMS) VÀ DÒNG PHC HI HU DC Rf  T (Capsicum annuum L.) KHOA CÔNG NGH SINH HC CHUYÊN NGÀNH: CNSH NÔNG NGHIP. GVHD: TS. Lê Th Kính CN. Nguyn Duy Khánh SVTH: Nguyn Ngc Kim MSSV: 1053010353 Niên khóa: 2010-2014 TP. H Chí Minh, tháng 5 nm 2014 Báo cáo khóa lun tt nghip khóa 2010 GVHD: TS Lê Th Kính SVTT: Nguyn Ngc Kim-1053010353 Trang i LI CM N u tiên, em xin chân thành cm n tt c thy cô Khoa Công ngh sinh hc, Trng i hc M TP. H Chí Minh đã nhit tình ging dy, trang b cho em nhng kin thc cn thit trong sut nhng nm tháng đi hc. Em xin gi li cm n sâu sc đn cô Lê Th Kính đã hng dn, giúp đ, to mi điu kin thun li cho em hoàn thành đ tài này. Cm n tt c các anh, ch phòng thí nghim Marker phân t đã giúp đ em rt nhiu trong sut thi gian thc tp và làm khóa lun, đc bit cm n anh Nguyn Duy Khánh đã tn tình ch dy, hng dn đ em hoàn thành đ tài. Em xin chân thành cám n Ban giám hiu nhà trng và Ban giám đc cùng toàn b anh, ch trong công ty C phn ging cây trng Min Nam đã to điu kin thun li đ em thc t p và hoàn thành khóa lun. Trân trng cm n bn bè đã giúp đ, ng h, khích l tinh thn cng nh chia s, cng c kin thc cùng mình trong quá trình thc tp và thc hin khóa lun tt nghip. Cui cùng, con xin t lòng bit n đn ba m đã nuôi nng, dy d, chm sóc, khích l, to mi điu kin đ con hc tp, hoàn thành thc tp và t t nghip. TP. H Chí Minh, tháng 05 nm 2014. Nguyn Ngc Kim Báo cáo khóa lun tt nghip khóa 2010 GVHD: TS Lê Th Kính SVTT: Nguyn Ngc Kim-1053010353 Trang ii MC LC DANH MC HÌNH DANH MC BNG 1. T VN  1 2. TNG QUAN TÀI LIU 4 2.1 Gii thiu v cây t 5 2.1.1 Tên gi 5 2.1.2 Ngun gc 5 2.1.3 Công dng 5 2.1.4 Phân loi 7 2.1.5 c đim thc vt hc ca cây t 8 2.1.6  cay ca t 10 2.2 Phng pháp phát hin gen CMS và gen Rf 10 2.2.1 Gen CMS 10 2.2.2 Gen phc hi Rf 13 2.2.3 Marker phân t 13 2.2.4 Các dòng t trong h thng sn xut t lai 3 dòng. 15 2.3 Tng quan tình hình nghiên cu v marker phân t liên kt vi gen CMS và gen phc hi hu dc (Rf)  t 15 2.3.1. Nghiên cu v marker liên kt gen CMS 16 2.3.2 Nghiên cu v marker liên kt gen phc hi hu dc (Rf)  t 17 3. VT LIU & PHNG PHÁP 20 3.1 Mu thc vt 21 3.2 Nhum ht phn vi acetocarmine 24 Báo cáo khóa lun tt nghip khóa 2010 GVHD: TS Lê Th Kính SVTT: Nguyn Ngc Kim-1053010353 Trang iii 3.3 Tách chit DNA 24 3.3.1. Phng pháp tách chit DNA genome ca các ging t 24 3.3.1.1. Nguyên lý 24 3.3.1.2. Quy trình 25 3.4 Kim tra tính đc hiu ca các marker bng phng pháp PCR và đin di 27 3.4.1 Phng pháp PCR 27 3.4.1.1 Nguyên tc 27 3.4.1.2 Thành phn phn ng 29 3.4.2 Phng pháp đin di 30 3.4.2.1 Nguyên lý 30 3.4.2.2 Quy trình đin di gel agarose 30 4. KT QU & THO LUN 31 4.1. Kt qu soi phn hoa 32 4.1.1 Phn hoa ca 8 cp A/B và 7 dòng R 32 4.1.1 Phn hoa ca 49 mu thu thp 33 4.2. Kt qu kho sát các b mi 34 4.2.1 Kt qu tách chit DNA 34 4.2.2 Chy th nghim marker CMS trên dòng CMS và duy trì 35 4.2.3 K t qu kho sát gradient nhit đ trên các dòng CMS và duy trì 37 4.2.4 Kt qu phân tích marker Orf456 trên 8 cp dòng CMS và dòng duy trì 38 4.2.5 Chy kim tra marker Rf trên dòng phc hi và dòng duy trì 39 4.2.6 Kt qu kho sát gradient nhit đ ca b mi CRF-SCAR trên dòng R 40 Báo cáo khóa lun tt nghip khóa 2010 GVHD: TS Lê Th Kính SVTT: Nguyn Ngc Kim-1053010353 Trang iv 4.2.7 Kt qu phân tích marker CRFSCAR trên 8 dòng B và 7 dòng R 41 4.2.8 Phân tích yu t bt dc và phc hi trên 49 mu thu thp 43 5. KT LUN &  NGH 47 6. TÀI LIU THAM KHO 50 Báo cáo khóa lun tt nghip khóa 2010 GVHD: TS Lê Th Kính SVTT: Nguyn Ngc Kim-1053010353 Trang v DANH MC HÌNH Hình Trang Hình 2.1 Các loi t trng ph bin  Vit Nam 7 Hình 2.2 t à Lt 7 Hình 2.3 Các loi t king 8 Hình 3.1 Phá v màng t bào 24 Hình 3.2 Mu sau khi  vàng cho thêm chloroform - IAA (24:1) 25 Hình 3.3 Mu sau ly tâm 25 Hình 3.4 DNA ta  đáy eppendorf 26 Hình 3.5 Các giai đon ca phn ng PCR 27 Hình 4.1 Ht phn các dòng A/B nhum vi acetocarmine 31 Hình 4.2 Kt qu soi ht phn ca 49 dòng/ging t thu thp 32 Hình 4.3 Kt qu tách chit DNA 33 Hình 4.4 Chy th nghim marker orf456 trên dòng CMS và dòng duy trì 34 Hình 4.5 Chy th nghim marker atp6 trên dòng CMS và duy trì 35 Hình 4.6 Kho sát gradient nhit đ mi orf456 và atp6 36 Hình 4.7 Kt qu phân tích marker CMS trên 8 cp dòng A/B 37 Hình 4.8 Kim tra marker CRFSCAR trên dòng phc hi và dòng duy trì 38 Hình 4.9 Kho sát gradien nhit ca b mi CRFSCAR trên dòng phc hi và dòng duy trì 39 Hình 4.10 Phân tích marker CRFSCAR trên 8 dòng B và 7 dòng R 40 Hình 4.11 Phân tích nhân t CMS bng marker Orf456 trên 49 mu t thu thp 42 Hình 4.12 Phân tích nhân t phc hi bng marker CRFSCAR trên 49 mu t thu thp 43 Báo cáo khóa lun tt nghip khóa 2010 GVHD: TS Lê Th Kính SVTT: Nguyn Ngc Kim-1053010353 Trang vi DANH MC BNG Bng Trang Bng 1: Danh sách tên 49 dòng/ ging thu thp 20 Bng 2: Thông và trình t mi s dng trong đ tài 22 Bng 3: Kt qu phân tích yu t bt dc, hu dc bng marker, kim tra ht phn trên 8 cp A/B và 7 dòng R 40 Bng 4: Kt qu phân tích nhân t CMS, Rf bng marker cùng kt qu kim tra ht phn trên 49 dòng/ging thu thp 43 Báo cáo khóa lun tt nghip khóa 2010 GVHD: TS Lê Th Kính SVTT: Nguyn Ngc Kim-1053010353 Trang 1 1. T VN  Báo cáo khóa lun tt nghip khóa 2010 GVHD: TS Lê Th Kính SVTT: Nguyn Ngc Kim-1053010353 Trang 2 t là loi cây đc con ngi trng trt và thu hái t lâu đi. Vi nhiu ngi, đây là gia v không th thiu trong ba n hng ngày, làm tng cm giác ngon ming. Trong t có các hp cht sinh hc có hot tính tt cho sc khe nh vitamin, capsaicin, flavonoid,…vì th t đc coi là mt dc liu quý trong y hc. Hn th na, t còn là nguyên liu quan trng cung cp cho các nhà máy, công ty sn xut các mt hàng thc ph m tiêu th và xut khu đem li li nhun cao [36].  nc ta, t đc trng khp 3 min vi din tích trng khong 26.000 ha, nhu cu ht ging t hàng nm khong 2,6 tn ht vi giá tr khong 2 triu USD [7]. Các ging t cay đc trng ch yu  nc ta là nhng ging đa phng nh t sng, chìa vôi, t him,… Ngoài ra còn mt s ging nhp ni t Trung Quc, ài Loan và Nht Bn [8]. Th trng ht ging t cay  Vit Nam hu nh do các công ty nc ngoài chim lnh, nghiên cu v chn to và sn xut ht ging t cay trong nc ch  phát trin trong khong mt thp k nay. Nm 2004, B Nông nghip và Phát trin Nông thôn công nhn ging tm thi và đa vào sn xut th 2 ging t lai F1 do Viên nghiên cu rau qu Vit Nam lai to là HB 9 và HB 14, nng sut trung bình đt 20- 25 tn/ha. Vin Nghiên cu Cây n qu Min Nam đã cho ra đi ging t lai Long nh 3 d trng, ít sâu bnh, phù hp vi th nhng vùng ng bng sông Cu Long, nng sut cao 40-50 tn/ha. Tuy nhiên, các ging t cay k trên vn cha th kinh doanh trên din rng do cha có kh nng cnh tranh vi các ging ngoi nhp v nng sut và cht lng thng phm [7]. Khó khn trong sn xut ht ging t lai F1 là do hoa t có kích thc rt nh, nên vic kh túi phn tn rt nhiu công lao đng, làm tng giá thành sn xut gim sc cnh tranh ca ging t cay F1. Bin pháp ph bin hin nay đc các công ty ging s dng là dùng các ging có yu t bt dc đc làm dòng m đ gim chi phí kh túi phn [7]. V mt di truyn, bt dc đc có 2 dng là bt dc đc do nhân và bt dc đc t bào cht, dng bt dc đc trong nhân ít đc s dng do nó ph thuc quá nhiu vào điu kin môi trng, trong bi cnh bin đi khí hu nh hin Báo cáo khóa lun tt nghip khóa 2010 GVHD: TS Lê Th Kính SVTT: Nguyn Ngc Kim-1053010353 Trang 3 nay s dng dng bt dc đc nhân đ phc v công tác lai to là không tha đáng vì con lai có kh nng tp nhim cao do dòng m bt dc không n đnh. Vì vy, s dng yu t bt dc t bào cht trong sn xut t lai 3 dòng là gii pháp u vit do dòng m có tính n đnh cao và không ph thuc vào điu kin môi trng [11]. Mt hn ch trong chn to ging t cay lai F1 có yu t CMS là mt nhiu thi gian đ to ra các dòng A/B, R cho con lai 3 dòng, thi gian đ to mt ging t lai F1 có kh nng kinh doanh là 6-8 nm. Tuy nhiên, các ging t cay nhp ni ca các công ty nc ngoài hàng nm vào Vit Nam ngày càng nhiu, càng đa dng thì thi gian 6-8 nm mi ra ging là không có kh nng cnh tranh [7]. Ngày nay, công ngh sinh hc đóng vai trò quan trng trong nông nghip nói chung và chn to ging cây trng nói riêng. Mt trong nhng ng dng quan trng là dùng marker phân t đ xác đnh mt tính trng mc tiêu ca cây trng vi đ chính xác cao và thi gian nhanh chóng. S dng marker phân t đ xác đnh các yu t liên quan đn CMS trên t đã đc nghiên cu  nhiu ni trên th gii [11]. Ti Vit Nam, nhóm nghiên cu thu c trng H Khoa hc T nhiên TP.HCM đã tin hành kho sát các b mi liên kt vi tính trng CMS và phc hi hu dc  ging t ch thiên (Capsicum frutescens), kt qu nhóm xác nhn 3 marker đc hiu trong vic phát hin nhân t CMS và phc hi [12], tuy nhiên đây ch là đ tài s khi trên 1 ging vi 4 b mi, vì vy cn có nghiên cu sâu hn trên b mi l n hn và qun th t đa dng hn bao gm c t ch thiên và ch đa. T nhng thc tin nêu trên, chúng tôi đã thc hin đ tài: “ng dng marker phân t trong xác đnh dòng bt dc đc t bào cht (CMS) và dòng phc hi hu dc Rf  t (Capsicum annuum l.)”. Mc tiêu kho sát đ đc hiu ca các marker liên kt cht v i gen CMS và gen phc hi hu dc (Rf). T đó, chn lc các dòng CMS, dòng phc hi n đnh phc v công tác chn to sn xut ht t lai F1 [...]... át ch b i gen tr i Rf nh ng nó l i tr i so v i gen rf, gen Pr làm th c v t s n xu t phát tri n, nh h ng ng th i h t ph n bình th ng và h t ph n không n quá trình ch n l c dòng và lai t o h t gi ng F1 [20] [31] [34] 2.2.3 Marker phân t Trong di truy n h c, marker phân t là 1 o n DNA liên k t v i 1 locus nh t nh trong b gen Marker phân t ngh sinh h c xác c s d ng trong sinh h c phân t và công nh m t trình... cho tính c, ki u gen trong nhân không có gen tr i Rf - Dòng ph c h i (dòng R): ki u gen ty th có ho c không có gen tr ng cho tính tr ng b t d c c, ki u gen trong nhân có c, ki u gen trong nhân không có - Dòng F1: con lai c a dòng b t d c Dòng A và B không có tr ng CMS còn c tr ng cho ng h p tr i Rf c hai dòng ki u gen trong nhân dòng A có gen dòng B thì không có t bi n c và dòng ph c h i [12] ng... dòng b t d c nh h ng c a kh n ng duy trì và kh n ng ph c h i h u c t bào ch t trên qu n th t Capsicum annuum L ,nhóm tác gi [33] ã dùng 1 marker liên k t gen Rf (marker CRF- SCAR) phân tích trên 6 dòng CMS, 5 dòng duy trì và 6 dòng ph c h i K t qu cho th y marker này c hi u trong vi c xác nh các dòng cây mang gen ph c h i h u d c, t ph n h tr công tác ch n t o các dòng cây ó góp ph c v s n xu t h t lai... gen ph c h i h u d c Rf trên qu n th c hi u c a marker liên F2 c a Niujiaojiao No.21 (rf/ rf)/Xiangtanwan (Rf/ Rf) Hai marker RAPD (Random amplified polymorphic DNA) là OP131400 và OW19800 kho ng cách di truy n t c xác nh là có liên k t ch t v i locus Rf, ng ng c a 2 marker này v i locus Rf là 0,37 và 8,12cM Hai marker giúp nh n di n 13 dòng t lai có kh n ng ph c h i khác nhau c hai marker u không hi n... Marker phân t orf456 và watp6-2 c s d ng trong ch n l c dòng CMS t Tuy nhiên, trong th c t , gen orf456 và watp6-2 hi n di n (m c th p) gây lo ng i v c dòng duy trì tin c y trong vi c ch n l c nh ng cây có ch a gen CMS Nhóm nghiên c u [30] phát tri n marker accD-U giúp xác nh dòng CMS t áng tin c y h n Qua k t qu nghiên c u nhóm ch ng minh r ng accD-U có th xác nh ki u di truy n t bào ch t chính xác h... tr i Rf, tuy nhiên c ng h p tr i Rf - Dòng duy trì (dòng B): ki u gen ty th không có gen tính tr ng b t d c t bi n u t bi n hình thành nên tính t bi n này Dòng B dùng b ng cách lai v i dòng A (dòng A làm m ), k t qu nh n duy trì dòng A c 100% cây dòng A b t d c dùng làm dòng m trong s n xu t h t lai 2.3 T ng quan tình hình nghiên c u v marker phân t liên k t v i gen CMS và gen ph c h i h u d c (Rf) ... PR-CAPS h u d ng trong vi c xác nh và ch n l c các dòng ph c h i - Nhóm nghiên c u [21] ã kh o sát c hi u c a 4 marker có liên quan v i gen ph c h i h u d c Rf, c th h s d ng 3 marker liên k t gen ph c h i Rf (OPP13-CAPS, AFRF8-CAPS, CRFSCAR-SCAR) và 1 marker liên k t gen ph c h i h u d c không hoàn toàn Pr (PR-CAPS) K t qu cho r ng 4 marker này u có liên k t ch t v i locus gen ph c h i, nh ng marker này... Kính marker phân thành 3 nhóm v i kho ng cách di truy n cách locus Rf l n l t là 0,4 cM (marker CRF-SCAR); 1,4 cM (marker BAC13T7 SCAR); 14 cM (marker PEPPR1), nh v y marker CRF-SCAR cho k t qu t c cho là có kh n ng ng d ng cao khi ng ng gi a ki u gen v i ki u hình K t qu nghiên c u này cho th y các marker m i phát tri n này cho phép xác nh dòng ph c h i chính xác v i tin c y cao d c nghiên c u v dòng. .. c a atp6 trong ty th watp6-2] trong dòng CMS t nghiên c u s t t, c bi t là gen gi atp6 [(S) ng quan gi a gen watp6 và tính tr ng CMS, h so sánh RNA phiên mã và RNA ch nh s a các atp6 dòng CMS (thi u gen Rf) và dòng ph c h i (mang gen Rf) K t qu thí nghi m cho th y có s tái t h p x y ra gen atp6 và coxII, ó có th là nguyên nhân d n n hình thành dòng CMS - D a trên các k t qu c a phân tích RFLP (restriction... gi a dòng t h u d c và dòng CMS, nhóm nghiên c u [17] cho r ng vùng coxII và atp6-2 c a hai dòng này có c u trúc DNA khác nhau Nhóm tác gi cho r ng có nhi u h n m t tác nhân gây nên tính tr ng CMS và h phát hi n có s khác bi t trong quá trình phiên mã c a gen atp6 gi a dòng CMS và dòng h u d c Cu i cùng, nhóm tác gi k t lu n vùng gen orf456 và atp6 có th là nguyên nhân t o nên tính b t d c c t - Marker . “ng dng marker phân t trong xác đnh dòng bt dc đc t bào cht (CMS) và dòng phc hi hu dc Rf  t (Capsicum annuum l. ) . Mc tiêu kho sát đ đc hiu ca các marker liên kt cht.  BÁO CÁO KHÓA LUN TT NGHIP  tài: NG DNG MARKER PHÂN T TRONG XÁC NH DÒNG BT DC C T BÀO CHT (CMS) VÀ DÒNG PHC HI HU DC Rf  T (Capsicum annuum L. ) KHOA CÔNG NGH SINH. Marker phân t Trong di truyn hc, marker phân t l 1 đon DNA liên kt vi 1 locus nht đnh trong b gen. Marker phân t đc s dng trong sinh hc phân t và công ngh sinh hc đ xác