Bước đầu tìm hiểu kỹ thuật sinh học phân tử trong xác định đột biến trên gen HBB gây bệnh thiếu máu hồng cầu hình liềm

B GIÁO DC VẨ ẨO TO TRNG I HC M TP.HCM BÁO CÁO KHÓA LUN TT NGHIP Tên đ tài: BC U TỊM HIU K THUT SINH HC PHÂN T TRONG XỄC NH T BIN TRểN GEN HBB GÂY BNH THIU MỄU HNG CU HỊNH LIM KHOA CÔNG NGH SINH HC CHUYÊN NGÀNH: VI SINH ậ SINH HC PHÂN T GVHD: ThS. Trng Kim Phng SVTH: Nguyn Th Thu Ngân MSSV: 1053012479 Khóa: 2010 - 2014 TP.HCM, tháng 06 nm 2014 Chuyên đ khóa lun tt nghip GVHD: ThS. Trng Kim Phng Sinh viên thc hin: Nguyn Th Thu Ngân ậ 1053012479 LI CM N Em xin gi lòng tri ơn đn cô Trng Kim Phng, ngi đƣ tn tình hng dn và truyn đt kin thc cho em trong quá trình hc tp và giúp em hoàn thành tt chuyên đ khóa lun tt nghip này. Em cng chơn thƠnh cm n QuỦ Thy Cô khoa Công Ngh Sinh Hc ậ Trng i hc M TP.HCM đƣ tn tình giúp đ và truyn đt kin thc cho em trong quá trình hc tp. Xin chân thành cm n cô Lê Huyn Ái Thúy, thy Lao c Thun đƣ tn tình giúp đ và to điu kin thun li cho em trong sut thi gian thc hin chuyên đ khóa lun tt nghip này. Xin chân thành cm n Trung tơm chn đoán y khoa Medic đƣ to điu kin thun li vƠ giúp đ em trong thi gian thc hin chuyên đ khóa lun tt nghip này. Em cng xin gi li bit n sơu sc đn gia đình, ngi thân và li cm n đn bn bè đƣ đng viên em trong sut thi gian hc tp. Sau cùng em xin chân thành cm n QuỦ Thy Cô đƣ dƠnh thi gian đc và xem xét chuyên đ khóa lun tt nghip này ca em. Sinh viên thc hin Nguyn Th Thu Ngân Chuyên đ khóa lun tt nghip GVHD: ThS. Trng Kim Phng Sinh viên thc hin: Nguyn Th Thu Ngân - 1053012479 i DANH MC CÁC CH VIT TT ACS Acute chest syndrome ARMS Amplification refractory mutation system ASA Allele specific amplification AS-PCR Allele specific ậ polymerase chain reaction bp Base pair ddNTP Dideoxynucleotide triphosphat dNTP Deoxynucleotide triphosphat EDTA Ethylendiamin Tetraacetic Acid Glu Glutamic Hb Hemoglobin HbA Hemoglobin A HbA 2 Hemoglobin A 2 HbAS Hemoglobin A ậ hemoglobin S HBB Beta-hemoglobin HbC Hemoglobin C HbD Hemoglobin D HbE Hemoglobin E HbF Hemoglobin F HbS Hemoglobin S HbSbetathal Hemoglobin S ậ beta thalassemia HbSC Hemoglobin S - hemoglobin C Chuyên đ khóa lun tt nghip GVHD: ThS. Trng Kim Phng Sinh viên thc hin: Nguyn Th Thu Ngân - 1053012479 ii HbSD Hemoglobin S - hemoglobin D HbSS Hemoglobin S - Hemoglobin S IDT Integrated DNA Technologies IQ Intelligence Quotient Lys Lysine NCBI National Center for Biotechnology Information NIH National Institutes of Health NST Nhim sc th nu Nucleotide OD Optical Density PCR Polymerase chain reaction PMC Pubmed Central RFLP Restriction fragment length polymorphism SCA Sickle cell anemia SCD Sickle cell disease SNP Single nucleotide polymorphism SSCP Single strand conformation polymorphism STT S th t TAE Tris-acetate-EDTA Tm Melting temperature UV Ultraviolet Val Valine WHO World Health Organisation Chuyên đ khóa lun tt nghip GVHD: ThS. Trng Kim Phng Sinh viên thc hin: Nguyn Th Thu Ngân - 1053012479 iii THUT NG DIN GII Ting Vit Ting Anh Bnh hng cu hình lim Sickle cell disease t qu Stroke Hi chng ngc cp tính Acute chest syndrome Thiu máu hng cu hình lim Sickle cell anemia Tn thng c quan mn tính Chronic organ damage Chuyên đ khóa lun tt nghip GVHD: ThS. Trng Kim Phng Sinh viên thc hin: Nguyn Th Thu Ngân - 1053012479 iv DANH MC CÁC BNG Bng I.1. Các đc đim lâm sàng ca bnh hng cu hình lim 6 Bng I.β. Các đc đim sinh hc ca bnh hng cu hình lim 7 Bng II.1. Thành phn phn ng PCR vi cp mi HBB1-F và HBB1-R 21 Bng II.2. Chu k nhit cho phn ng PCR vi cp mi HBB1-F và HBB1-R 22 Bng II.3. Thành phn phn ng PCR vi cp mi HBB2-F và HBB2-R 22 Bng II.4. Chu k nhit cho phn ng PCR vi cp mi HBB2-F và HBB2-R 23 Bng III.1. Các dng đt bin trên gen HBB 26 Bng III.2. T l các th đt bin trên gen HBB 27 Bng III.γ. Các phng pháp đc s dng trong xác đnh đt bin 27 Bng III.4. Thông tin trình t gen HBB thu thp trên NCBI 28 Bng III.5. Các h mi thu thp đc 29 Bng III.6. Các thông s vt lý ca mi 31 Bng III.7. Kho sát đ đc hiu ca mi HBB1-F và HBB1-R, HBB2-F và HBB2- R bng phn mm Annhyb 32 Bng III.8.  đc hiu ca h mi bng công c Blast 33 Bng III.9. Kt qu đo OD DNA b gen ngi ca 3 mu bnh phm 35 Bng 1. Thông tin mu bnh phm s dng trong nghiên cu 55 Chuyên đ khóa lun tt nghip GVHD: ThS. Trng Kim Phng Sinh viên thc hin: Nguyn Th Thu Ngân - 1053012479 v DANH MC HÌNH NH Hình I.1: Hình nh ca gen HBB[44] 3 Hình I.2: Hình nh mô t các bc trong phn ng PCR (P1 vƠ Pβ: các đon mi- Primers)[49] 15 Hình III.1: Hình nh mô t v trí khuch đi vùng gen HBB ca b mi HBB1-F và HBB1-R, HBB2-F và HBB2-R 35 Hình III.2: Kt qu đin di kho sát nhit đ lai ca cp mi HBB1-F và HBB1-R 37 Hình III.3: Kt qu đin di sn phm PCR mu 1 vi cp mi HBB1-F và HBB1-R 38 Hình III.4a: Kt qu đin di sn phm PCR mu 2 vi cp mi HBB1-F và HBB1- R 39 Hình III.4b: Kt qu đin di sn phm PCR mu 2 vi cp mi HBBβ-F và HBB2- R 39 Hình III.5a: Kt qu đin di sn phm PCR mu 3 vi cp mi HBB1-F và HBB1- R 2 Hình III.5b: Kt qu đin di sn phm PCR mu 3 vi cp mi HBBβ-F và HBB2- R 2 Hình III.6: Kt qu Blast trình t A3-F trên NCBI 42 Hình III.7: Kt qu phơn tích tính tng đng ca trình t A3-F vi trình t gen HBB và v trí bt cp ca mi HBB1-R 43 Hình 1: Mc đ tng đng ca trình t 7 (AF007546) và trình t 9 (U01317) trên Seaview 53 Hình 2: Kt qu Blast ca trình t 7 (AF007546) trên NCBI 54 Hình 3: Kt qu kim tra đ đc hiu ca cp mi HBB1-F và HBB1-R bng phn mm Annhyb 55 Hình 4: Mc đ tng đng ca trình t A3-F và trình t gen HBB 56 Hình 5: Mc đ tng đng ca trình t A3-R và trình t gen HBB 57 Chuyên đ khóa lun tt nghip GVHD: ThS. Trng Kim Phng Sinh viên thc hin: Nguyn Th Thu Ngân - 1053012479 vi MC LC T VN  PHN I: TNG QUAN I.1 TNG QUAN V BNH THIU MÁU HNG CU HÌNH LIM 3 I.1.1 Tng quan v gen HBB (beta-hemoglobin)[44] 3 I.1.1.1 Gen HBB[44] 3 I.1.2 Bnh hng cu hình lim (Sickle cell disease, SCD) 4 I.1.2.1 nh ngha bnh hng cu hình lim (SCD) 4 I.1.2.2 Các th bnh hng cu hình lim 5 I.1.2.3 Du hiu ca bnh hng cu hình lim 5 I.1.3 Bnh hng cu hình lim  th HbSS[24] 7 I.2 TÌNH HÌNH BNH THIU MÁU HNG CU HÌNH LIM 8 I.2.1 Tình hình trên th gii 8 I.2.2 Tình hình bnh  Vit Nam 10 I.3 BIN CHNG CA BNH THIU MÁU HNG CU HÌNH LIM 10 I.3.1 t qu 10 I.3.2 Hi chng ngc cp tính (ACS) 10 I.3.3 Tn thng c quan mn tính 11 I.4 TÁC NG CA BNH THIU MÁU HNG CU HÌNH LIM 11 I.5 CÁC PHNG PHÁP CHN OÁN BNH THIU MÁU HNG CU HÌNH LIM 13 I.5.1 Xét nghim máu 13 I.5.2 Xét nghim cn lâm sàng 13 I.5.3 in di hemoglobin 13 Chuyên đ khóa lun tt nghip GVHD: ThS. Trng Kim Phng Sinh viên thc hin: Nguyn Th Thu Ngân - 1053012479 vii I.5.4 Phng pháp PCR (Polymerase chain reaction) 14 I.5.5 Phng pháp gii trình t 15 I.5.6 Mt s phng pháp khác 16 PHN II: VT LIU VẨ PHNG PHÁP NGHIÊN CU II.1 VT LIU 18 II.2 PHNG PHÁP NGHIÊN CU 18 II.2.1 Khai thác d liu 18 II.2.2 Kho sát in silico ậ thit k mi 18 II.2.3 Kho sát thc nghim 19 II.2.3.1 Tách chit DNA 19 II.2.3.2 Kim tra cht lng DNA thu nhn bng phng pháp đo quang ph 20 II.2.3.3 Phn ng PCR 21 II.2.3.4 Phng pháp đin di 23 II.2.3.5 Phng pháp gii trình t 24 PHN III: KT QU VÀ BÀN LUN III.1 KHAI THÁC D LIU 26 III.1.1 Thu thp bài báo 26 III.1.2 Thu thp trình t gen HBB 27 III.1.3 Thu thp b mi xác đnh đt bin gen HBB 29 III.2 KHO SÁT IN SILICO 30 III.2.1 Trình t gen HBB 30 III.2.2 Trình t mi 30 III.3 KHO SÁT THC NGHIM 35 III.3.1 Kt qu đo OD 35 Chuyên đ khóa lun tt nghip GVHD: ThS. Trng Kim Phng Sinh viên thc hin: Nguyn Th Thu Ngân - 1053012479 viii III.3.2 Kt qu phn ng PCR vƠ đin di 36 III.3.3 Kt qu gii trình t 41 PHN IV: KT LUN VẨ  NGH IV.1 KT LUN 45 IV.1.1 Khai thác d liu 45 IV.1.2 Kho sát in silico 45 IV.1.3 Kho sát thc nghim 45 IV.2  NGH 46 TÀI LIU THAM KHO 47 PH LC 53 [...]... Tìm hi u thông tin v b nh di truy n HbSS Vi t Nam N i dung nghiên c u: Chúng tôi ti n hành thu th p tài li li t bi n trên gen hemoglobin (HBB) nh h ng c u hình Vi t Nam và trên th gi i Kh o sát in silico, thi t k m i phù h p nh m phát hi n t bi n trên gen HBB gây b nh thi u máu di truy n u xây d ng quy trình d a trên k thu t PCR nh m tìm hi u v t bi n gây b nh thi u máu h ng c u hình li m th HbSS trên. .. và gây t vong i b nh Hi n nay, trên th gi i có nhi u công trình nghiên c u v ch n nh HbSS và các b nh lý khác thu c nhóm SCD (Sickle cell disease) Tuy nhiên, Nam v li u v tình hình b Vi t u phân t v b nh HbSS Do v y, nh m góp ph n tìm hi u thông tin v b nh di truy n HbSS Vi t Nam, chúng tôi th c hi U TÌM HI U K nghiên c u: THU T SINH H C PHÂN T TRONG T BI N TRÊN GEN HBB GÂY B NH THI U MÁU H NG C U HÌNH... III.2 t bi n th HbSS kho ng 73% trên th gi t bi n n i tr i c a lo i b nh thi u máu h ng c u hình li m th S ng th u và ghi nh n có s h c phân t c áp d t bi n trên gen HBB gây b nh thi u máu h ng c u hình li m (b ng III.3): PCR, Realtime-PCR Tuy v y, nh m phù h p v phân t u ki n th c t c a phòng thí nghi m sinh h c ih cM phân tích s n tìm hi u các quy trình t bi n th HbSS d a trên k thu n: AS-PCR ho c PCR... n máu, ng t i phân t hemoglobin và làm cho toàn b t bào máu i hình d ng K t qu c c t bi n này là vi c s n xu t m t d ng b ng -globin là HbS.[44] i b b nh thi u máu h ng c u hình li m th HbSS do nh n y u t di truy n th HbS t c cha và m i b nh có tri u ch ng thi u máu h ng c u hình li m gây ra b i s thay th 2 ti I.2 globin b ng HbS.[25] TÌNH HÌNH B NH THI U MÁU H NG C U HÌNH LI M I.2.1 Tình hình trên. .. ng c u hình li m th HbSS trên gen HBB trên các m u b nh ph m Sinh viên th c hi n: Nguy n Th Thu Ngân - 1053012479 Trang 1 khóa lu n t t nghi PH N I: T NG QUAN Sinh viên th c hi n: Nguy n Th Thu Ngân - 1053012479 ng khóa lu n t t nghi ng T NG QUAN V B NH THI U MÁU H NG C U HÌNH I.1 LI M I.1.1 T ng quan v gen HBB (beta-hemoglobin) I.1.1.1 Gen HBB [44] Gen beta-hemoglobin (HBB) mã hóa protein beta-globin,... NCBI v i các thông tin quan tr ng v b nh thi u máu h ng c u hình li m: s t bi n trên gen HBB di truy n và bi n ch ng c a b nh, tình hình b nh SCA trên th gi i và Vi t Nam Chúng tôi thu th p các bài báo công b trong kho ng th i gian t nh các th i nh ng d li u khoa h c t bi n trên gen HBB v i t l bình/t ng s công trình nghiên c u), d li u này trình bày K t qu phân tích ghi nh n t l th t bi n (t l trung... beta-globin, bp (v trí nucleotide 5.246.695 c 1606 5.248.300) trên NST 11p15.5 Hình I.1: Hình nh c a gen HBB[ 44] S t bi n trên gen HBB có th d t bi n 2 d ng bi n th chính: m trên trình t gen HBB d n s t ng h p chu i globin b t ng (HbS, HbC, HbE, HbD, ) Nhóm bi n th thalassemia d n làm gi m ho c b t ho t s t ng h p chu i globin Các bi n th c a HBB có t n s xu t hi n kho ng 1-1,5/1000 I.1.1.2 Hemoglobin... máu, tan máu m Th d h pt HbSC Lách to Thi u máu n nh HbS Thalassemia Lách to D u hi u sinh h c c a b nh h ng c u hình li m Sinh viên th c hi n: Nguy n Th Thu Ngân - 1053012479 Trang 6 khóa lu n t t nghi B ng I.2 ng m sinh h c c a b nh h ng c u hình li m Th b nh D u hi u sinh h c Huy : thi u máu, tan máu m n H ng c u i li m: 40 T 100% : h ng c ng c u hình li m Th ng : th y nhi u h ng c u li m HbSS... ng TV Thi u máu h ng c u hình li m th HbSS (Sickle Hemoglobin) là m t d ng b nh lý di truy n v máu, tính ch exon 1 c a gen valine (Glu6Val) bi th globin d ng h t bi m (GAG n s thay th c a acid glutamic thành v trí acid amin th sáu c a chu globin làm i HbA thành HbS Th HbSS hình thành các t bào h ng c u hình li m gây thi u máu, d n s t c ngh n m ch máu, nhi m trùng và t quan quan tr ng trong ts i, có... Trang 9 khóa lu n t t nghi I.2.2 ng Tình hình b nh Vi t Nam Vi li u th ng kê nào c th v tình hình b nh thi u máu h ng c u hình li u này ch ng t các công trình nghiên c u phân t v b nh này t i Vi t Nam còn r t ít Chính vì v y vi c nghiên c u này r t thi t th I.3 c ti tìm hi u tình hình b nh Vi t Nam BI N CH NG C A B NH THI U MÁU H NG C U HÌNH LI M B nh có ph r ng gây ra r t nhi u bi n ch ng Ph bi n nh . bin trên gen HBB 26 Bng III.2. T l các th đt bin trên gen HBB 27 Bng III.γ. Các phng pháp đc s dng trong xác đnh đt bin 27 Bng III.4. Thông tin trình t gen HBB thu thp trên. gen HBB[ 44] 3 Hình I.2: Hình nh mô t các bc trong phn ng PCR (P1 vƠ Pβ: các đon mi- Primers)[49] 15 Hình III.1: Hình nh mô t v trí khuch đi vùng gen HBB ca b mi HBB1 -F và HBB1 -R,. 5.246.695 ậ 5.248.300) trên NST 11p15.5. Hình I.1: Hình nh ca gen HBB[ 44] S đt bin trên gen HBB có th dn đn 2 dng bin th chính:  t bin đim trên trình t gen HBB dn đn s tng