Ứng dụng sinh học phân tử trong xác định đa dạng sinh học quần thể vi sinh vật
SVTH: Lê Tuấn Dũng, Sầm Minh Hải, Cao Xuân Bách , Lê Khắc Thắng Lê Tiến Hòa Ứng dụng sinh học phân tử trong xác định đa dạng sinh học quần thể vi sinh vật Đặt vấn đề Vi sinh vật quanh ta Xử lý nước thải =>Cần phải có sự hiểu biết về đa dạng vi sinh vật Nội dung Các phương pháp Phương pháp enzyme giới hạn Phương pháp giải trình tự đặc hiệu DNA microarray Các phương pháp lai Ứng dụng thực tiễn Các phương pháp Phương pháp truyền thống: Dựa vào hình thái: nhuộm, nuôi khuẩn lạc Phản ứng sinh hóa Thực khuẩn thể - vi khuẩn Kháng nguyên bề mặt Hoạt chất kháng khuẩn Phương pháp kỹ thuật sinh học phân tử Dựa trên sự khác biệt về cấu trúc DNA: kích thước, trình tự, sắp xếp Giải trình tự DNA Phân tích plasmid, DNA Lai DNA trên màng DNA(đánh dấu bằng: huỳnh quang,phóng xạ, ) [...]...Các bước Các ứng dụng • • • • • Xác định quan hệ huyết thống Xác định tình trạng bệnh Lập bản đồ gen Phân tích đa dạng di truyền Xác định đa dạng vi sinh vật đã định danh(dựa trên dữ liệu vạch điện di có sẵn) hoặc nhận biết đa dạng vi sinh vật trong môi trường dựa trên sự khác biệt về các vạch điện di Ưu nhược điểm • Có độ đặc hiệu và độ nhậy cao cho phép xác định nhanh chóng và chính xác có mặt của... (10’) Xác định mật số vi khuẩn nitrate hóa Bảng 1: Biến động mật số N europaea bằng phương pháp Real-time PCR Bảng 2: mật số Nitrobacter bằng phương pháp RT-PCR Xác định sự đa dạng quần thể vi khuẩn bằng kỹ thuật DGGE Chu trình nhiệt cho PCR: Hình 1: Sản phảm PCR khuếch đại với mồi 984f-GC và 1378R Xác định sự đa dạng quần thể vi khuẩn bằng kỹ thuật DGGE Hình 2: Cấu trúc quần thể vi khuẩn trong bùn... phân tử Cơ sở của phương pháp lai phân tử • Biến tính và hồi tính DNA - RNA • Tm • Hạ từ từ to + điều kiện thích hợp -> Bắt cặp • Đặc hiệu tuyệt đối Yếu tố ảnh hưởng • • • • Nồng độ và thời gian phản ứng Nhiệt độ Độ dài của các trình tự Lực ion Các phương pháp lai Lai trong môi trường lỏng Lai trên pha rắn Lai tại chỗ (in situ) FISH Ứng dụng sinh học phân tử trong xác định sự đa dạng của vi sinh vật. .. lai Xác định tín hiệu lai Xác định VSV Xác nhận lại mẫu dò đã thiết kế, tiên đoán in silico Giải thích dữ liệu Định lượng thành phần quần xã vi khuẩn Các vấn đề khi áp dụng kỹ thuật DNA microarray trong lĩnh vực môi trường • Về kỹ thuật – Điều kiện lai không bao giờ tối ưu – Tính đa dạng rất lớn của môi trường • Về vấn đề phân tích – Giải thích dữ liệu khó – Cần có dữ liệu trước đó về các loài vi sinh. .. sinh vật Khả năng phát triển kỹ thuật DNA microarray trong quản lý môi trường • DNA microarray thỏa mãn các yêu cầu – Xác định đồng thời nhiều loại VSV – Sử dụng phương pháp phân tích có thể tự động hóa – Giám sát RNA như chỉ thị định tính hoạt tính VSV – Định lượng mức độ RNA hoặc hoạt tính VSV Các kĩ thuật lai phân tử • • • • Khái niệm phương pháp lai phân tử Cơ sở của phương pháp lai phân tử Các... và độ nhậy cao cho phép xác định nhanh chóng và chính xác có mặt của không chỉ một loài vi khuẩn mà còn cho phép xác định và phân biệt nhiều loài vi khuẩn • Tốn thiết bị và hóa chất, không thể hiện kết quả tại chỗ PHƯƠNG PHÁP GiẢI TRÌNH TỰ • Ứng dụng: – Xác định các chủng, loài Vi khuẩn • Nguyên tắc – Các chủng vi khuẩn đều mang đoạn gen 16S – Đoạn gen 16S có độ bảo thủ cao – Không có sự trao đổi giữa... trình tự mỗi sản phẩm thu được sau điện di • So sánh với ngân hàng gen (database) xác định chính xác loài Hạn chế của phương pháp Hạn chế của phương pháp • Độ chính xác của taq DNA polymerase không cao • Không phân biệt được DNA của tế bào sống và chết trong mẫu ban đầu Kết quả Kết quả • Phân loại, xác định loài chính xác hơn • Cơ sở phát triển nghiên cứu về sự tiến hóa của giống, loài DNA Microarray... vật Nitrate hóa trong ao nuôi tôm Đặc điểm ao Lấy mẫu Sau lấy mẫu Lấy mẫu bùn Xác định mật số vi khuẩn nitrate hóa 2 Xác định mật số vi khuẩn Nitrobacter bằng kỹ thuật Real-time PCR Qui trình PCR: • VKĐC: Nitrobacter winogradskyi • Cặp mồi 5’-GGCGTAGCAATACGTCAG -3’; 5’-ATCCGGTATTAGCCCAAG -3’ • Qui trình nhiệt: 35 chu kỳ; 95oC (3’), 95oC (45’), 47oC (40’), 72oC (1’), 72oC (3’) • Điện di trong agarose... 72oC (3’) • Điện di trong agarose gel 1,5% Qui trình RT-PCR • Qui trình nhiệt : 40 chu kỳ; 95oC (3’); 95oC (45’’); 47oC (45’’), 72oC; (1’); 72oC (3’) • Điện di /agarose gel 1,5% Xác định mật số vi khuẩn nitrate hóa 1 Xác định mật số VK Nitrosomonas bằng kỹ thuật Real-time PCR Qui trình PCR: • VKĐC: Nitrosomonas europaea NCIMB 11849 • Cặp mồi 5’-GCCAATCTCAAAGCAC-3’ 5’-TCTGGTGAAAACCACTCC -3’ • Qui trình . Tiến Hòa Ứng dụng sinh học phân tử trong xác định đa dạng sinh học quần thể vi sinh vật Đặt vấn đề Vi sinh vật quanh ta Xử lý nước thải =>Cần phải có sự hiểu biết về đa dạng vi sinh vật Nội. thống • Xác định tình trạng bệnh • Lập bản đồ gen • Phân tích đa dạng di truyền • Xác định đa dạng vi sinh vật đã định danh(dựa trên dữ liệu vạch điện di có sẵn) hoặc nhận biết đa dạng vi sinh vật. còn cho phép xác định và phân biệt nhiều loài vi khuẩn • Tốn thiết bị và hóa chất, không thể hiện kết quả tại chỗ. PHƯƠNG PHÁP GiẢI TRÌNH TỰ • Ứng dụng: – Xác định các chủng, loài Vi khuẩn • Nguyên