Ứng dụng chỉ thị phân tử để xác định cá thể mang gen kháng bệnh mốc sương trong quần thể chọn tạo giống khoai tây

Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa Công Nghệ Sinh Học VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Đề tài: Ứng dụng thị phân tử để xác định cá thể mang gen kháng bệnh mốc sương quần thể chọn tạo giống khoai tây Giáo viên hướng dẫn : TS Lê Hùng Lĩnh Sinh viên thực : Nguyễn Thị Duyên Lớp : K18.11-01 Hà Nội – 2015 Nguyễn Thị Duyên – K18.1101 Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa Công Nghệ Sinh Học VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Đề tài: Ứng dụng thị phân tử để xác định cá thể mang gen kháng bệnh mốc sương quần thể chọn tạo giống khoai tây Giáo viên hướng dẫn : TS Lê Hùng Lĩnh Sinh viên thực : Nguyễn Thị Duyên Lớp : K18.11-01 Hà Nội – 2015 Nguyễn Thị Duyên – K18.1101 Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa Công Nghệ Sinh Học LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy cô giáo, cán thuộc Khoa Công nghệ sinh học – Viện Đại học Mở Hà Nội tạo điều kiện thuận lợi cho em thực tập hồn thành khóa luận Em xin đặc biệt gửi lời biết ơn chân thành sâu sắc tới TS Lê Hùng Lĩnh – Trưởng môn Sinh học phân tử, Viện Di truyền Nông nghiệp Việt Nam, hướng dẫn bảo tận tình giúp đỡ em suốt q trình thực đề tài hồn chỉnh luận văn Em xin chân thành cảm ơn TS Đinh Xuân Tú, trực tiếp hướng dẫn, giúp đỡ em xuyên suốt trình thực đề tài hoàn chỉnh luận văn Để hoàn thành luận văn, em cịn nhận động viên khích lệ tập thể phịng thí nghiệm Sinh học phân tử- Viện Di truyền Nơng nghiệp, bạn bè gia đình Em xin chân thành cảm ơn tất tình cảm cao q Trong q trình thực tập khơng tránh khỏi sai sót, kính mong thầy giáo, anh chị bạn đóng góp ý kiến để cá nhân em tiếp thu hoàn thiện Hà Nội, ngày…tháng…năm 2015 Sinh viên Nguyễn Thị Duyên Nguyễn Thị Duyên – K18.1101 Khoa Công Nghệ Sinh Học Viện Đại học Mở Hà Nội MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 ĐẶT VẤN ĐỀ MỤC ĐÍCH, NỘI DUNG ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI .3 2.1 Mục đích 2.2 Nội dung 2.3 Địa điểm nghiên cứu CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÂY KHOAI TÂY 1.1.1 Nguồn gốc, lịch sử phát triển .4 1.1.2 Đặc điểm khoai tây 1.1.3 Tình hình sản xuất khoai tây giới Việt Nam 1.2 BỆNH MỐC SƯƠNG Ở CÂY KHOAI TÂY 11 1.2.1 Giới thiệu chung bệnh mốc sương 11 1.2.2 Nguyên nhân gây bệnh mốc sương khoai tây 12 1.2.3 Triệu chứng tác hại bệnh mốc sương khoai tây 13 1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU BỆNH MỐC SƯƠNG Ở CÂY KHOAI TÂY TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM 14 1.3.1 Tình hình nghiên cứu bệnh mốc sương khoai tây giới 14 1.3.2 Tình hình nghiên cứu Việt Nam 16 1.4 ỨNG DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ TRONG NGHIÊN CỨU DI TRUYỀN VÀ CHỌN TẠO KHOAI TÂY MANG GEN KHÁNG BỆNH MỐC SƯƠNG 18 CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU, DỤNG CỤ HÓA CHẤT .20 2.1.1 Vật liệu nghiên cứu 20 2.2.2 Dụng cụ, hóa chất 21 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .24 2.2.1 Phương pháp thí nghiệm đồng ruộng 24 2.2.2 Phương pháp tách chiết DNA tổng số 24 2.2.3 Phương pháp điện di gel agarose 25 2.2.4 Phương pháp xác định nồng độ độ tinh DNA thu 26 2.2.5 Phương pháp PCR 27 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29 Nguyễn Thị Duyên – K18.1101 Khoa Công Nghệ Sinh Học Viện Đại học Mở Hà Nội 3.1 KẾT QUẢ THU THẬP VÀ ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM NÔNG SINH HỌC CỦA CÁC MẪU GIỐNG KHOAI TÂY CÓ NGUỒN GỐC XUẤT XỨ KHÁC NHAU 29 3.1.1 Tình hình sinh trưởng giống khoai tây vụ xuân 2014 29 3.1.2 Đặc điểm hình thái giống khoai tây thí nghiệm 36 3.2 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH CÁ THỂ MANG GEN KHÁNG BỆNH MỐC SƯƠNG BẰNG CÁCH SỬ DỤNG CÁC CHỈ THỊ PHÂN TỬ .38 3.2.1 Kết tách chiết tinh DNA 38 3.2.2 Kết thu thập phát triển thị tìm nhiệt độ gắn mồi đặc hiệu phản ứng PCR 40 3.2.3 Kết khảo sát cá thể mang gen QTL/gen kháng bệnh mốc sương nấm Phytopthora infestans 41 CHƯƠNG IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 53 4.1 KẾT LUẬN 53 4.2 KIẾN NGHỊ .53 TÀI LIỆU THAM KHẢO .54 Nguyễn Thị Duyên – K18.1101 Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa Công Nghệ Sinh Học DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU STT Từ viết tắt Nội dung DNA CIP QTLs Quantitative trait loci FAO Food and Agriculture Organization of the United Nations CTAB Cetyltrimethyl Amonium Bromide EDTA Ethylenediaminetetra Acetic Acid PCR Polymerase Chain Reaction SSR Simple Sequence Repeats TBE Tris – Bric Acid – EDTA 10 RAPD 11 TE 12 VAAS 13 SNP Deoxyribonucleic acid International Potato Center Random amplified polymorphism DNA Tris – EDTA Vietnam Academy of Agricultural Sciences Simple Nucleotide Polymorphism Nguyễn Thị Duyên – K18.1101 Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa Công Nghệ Sinh Học DANH MỤC BẢNG BIỂU STT Bảng Tên bảng Trang Bảng 1.1 Thành phần hóa học trung bình củ khoai tây (%) Bảng 1.2 Năng suất protein lượng số loại trồng Bảng 1.3 Diện tích, suất, sản lượng khoai tây châu Âu Bảng 1.4 Diện tích, suất, sản lượng khoai tây châu Á Bảng 1.5 Diện tích, suất, sản lượng khoai tây Việt Nam 10 Bảng 2.1 Thơng tin mã hóa giống sử dụng 20 Bảng 2.2 Danh sách dòng/giống khoai tây 21 Bảng 2.3 Chu trình phản ứng PCR 27 Bảng 3.1 Một số tiêu sinh trưởng số mẫu giống khoai 35 tây thí nghiệm 10 Bảng 3.2 Đặc điểm hình thái số mẫu giống khoai tây tham 37 gia thí nghiệm 11 Bảng 3.3 Nồng độ số độ tinh DNA tổng số 40 12 Bảng 3.4 Các cặp mồi dùng nghiên cứu 41 13 Bảng 3.5 Tổng hợp kết điện di sản phẩm PCR 49 14 Bảng 3.6 Tổng hợp kết điện di sản phẩm PCR 50 Nguyễn Thị Duyên – K18.1101 Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa Cơng Nghệ Sinh Học DANH MỤC HÌNH ẢNH STT Hình Tên hình Trang Hình 1.1 Triệu chứng bệnh mốc sương khoai tây 14 Hình 3.1 Hình ảnh thực tế đồng ruộng 29 Hình 3.2 Một số mẫu giống khoai tây tham gia thí nghiệm thực tế 34 Hình 3.3 Kết diện di DNA tổng số mẫu khoai tây 38 Hình 3.4 Kết điện di sản phẩm PCR sử dụng Marker R3b 42 Hình 3.5 Kết điện di sản phẩm PCR sử dụng Marker RB-629 43 Hình 3.6 Kết điện di sản phẩm PCR sử dụng Marker R1- 45 1025 Hình 3.7 Kết điện di sản phẩm PCR sử dụng Marker SSTO- 46 448 Hình 3.8 Kết điện di sản phẩm PCR sử dụng Marker LP3 Nguyễn Thị Duyên – K18.1101 47 Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa Công Nghệ Sinh Học MỞ ĐẦU ĐẶT VẤN ĐỀ Khoai tây (Solanum tuberosum L) lương thực, thực phẩm có giá trị trồng nhiều nước giới Củ khoai tây chứa trung bình 25% chất khơ, chất dinh dưỡng quan trọng tinh bột 80-85%, protein 3% nhiều loại vitamin A, C, B1, B6,…[12] Với giá trị dinh dưỡng cao, khoai tây bốn lương thực quan trọng phổ biến giới, xếp sau lúa, ngô khoai lang [1] Mỗi năm giới có tỷ người sử dụng khoai tây thức ăn Bên cạnh giá trị dinh dưỡng, khoai tây cịn có giá trị cao mặt kinh tế Hàng năm, ngành sản xuất chế biến khoai tây đóng góp vào kinh tế tồn cầu khoảng 700 tỷ USD với việc tiêu thụ khoảng 400 triệu tấn/năm (FAO, 2010) Hiện nay, Trung Quốc nước có diện tích trồng sản xuất khoai tây với sản lượng lớn giới Tình hình sản xuất khoai tây giới (FAO, 2011) Cây khoai tây du nhập vào Việt Nam từ 100 năm trước Sản xuất Việt Nam đạt đỉnh điểm vào năm 1979 – 1980, sau giảm dần Nhu Nguyễn Thị Duyên – K18.1101 Page Khoa Công Nghệ Sinh Học Viện Đại học Mở Hà Nội cầu khoai tây việc sản xuất loại bắt đầu phát triển mạnh mẽ trở lại từ năm 1998 Hiện nay, 70% diện tích khoai tây tập trung tỉnh đồng Sông Hồng khoai tây trở thành trồng vụ đông quan trọng Năm 2012 Việt Nam, khoai tây trồng diện tích 40.000 sản lượng đạt 440.000 (FAOSTAT) Sản lượng đáp ứng 20% đến 25% nhu cầu tiêu dùng nước Có điều sản xuất khoai tây nước ta nhiều yếu tố bất lợi kìm hãm suất như: bệnh hại, sâu hại, trình độ canh tác người nơng dân Trong yếu tố đó, bệnh hại yếu tố quan trọng nguy hiểm bậc Bệnh hại khoai tây đa dạng thành phần nguyên nhân gây bệnh Khoai tây bị nhiều dịch hại công như: nấm, vi khuẩn, virus, tuyến trùng Thành phần bệnh khoai tây đa dạng: bệnh mốc sương, bệnh héo rũ gốc mốc trắng, bệnh héo vàng, bệnh sưng rễ tuyến trùng nốt sưng Trong đó, bệnh mốc sương nấm Phytophthora infestans gây bệnh hại nghiêm trọng, đặc biệt bệnh bùng phát thành dịch gây nguy hiểm cho vùng chuyên canh Các nghiên cứu phân bố tác hại bệnh tiến hành từ sớm Theo đánh giá tác hại bệnh mốc sương gây hại vùng ngoại thành Hà Nội năm 1965, thiệt hại trung bình từ 30% - 70%, mức độ cao gây suất hồn tồn Trong năm gần đây, mức độ gây hại bệnh cao phân bố rộng, phổ biến vùng Hà Nội, Lào Cai, Bắc Giang, Bắc Ninh, Hải Phòng, Lâm Đồng, Nhiều biện pháp đưa để hạn chế tác hại bệnh mốc sương sử dụng tập đoàn giống cho vùng nhiễm bệnh, sử dụng thuốc hóa học chưa đem lại kết mong đợi Bên cạnh đó, việc sử dụng thuốc hóa học để phịng trừ bệnh khơng hợp lý, việc tăng nồng độ thuốc cao gấp nhiều lần dẫn đến tình trạng kháng thuốc bắt đầu xuất loài nấm Hơn tình hình biến động quần chủng, điều kiện sống tự nhiên mà lồi nấm hình thành chủng giống khác nhau, phân bố rộng rãi gây thiệt hại nghiêm trọng đến sản xuất Với tiến công nghệ sinh học, nhờ việc kết hợp thị phân tử với chọn giống truyền thống, nhà khoa học dễ dàng quy tụ gen Nguyễn Thị Duyên – K18.1101 Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa Công Nghệ Sinh Học nghiệm với dải nhiệt độ gắn mồi khác xác định nhiệt độ gắn mồi đặc hiệu cho 10 cặp mồi nghiên cứu Kết thị phân tử SSR thơng tin liên quan trình bày bảng 3.4 Bảng 3.4 Bảng cặp mồi dùng nghiên cứu khoai tây Tên mồi RB - 629 Loại Nhiễm Ta; thị sắc thể O SCAR Trình tự mồi C 65 F - GAATCAAATTATCCACCCCAACTTTTAAAT R - CAAGTATTGGGAGGACTGAAAGGT SSTO – SCAR 61 448 R1 - R - TGCATAGGTGGTTAGATGTATGTTTGATTA SCAR 61 1205 R3b - F - CACTCGTGACATATCCTCACTA R - GTAGTACCTATCTTATTTCTGCAAGAAT SCAR 11 64 378 LP3 F - GTGGAACGCCGTCCATCCTTAG F- GTCGATGAATGCTATGTTTCTCGAGA R- ACCAGTTTCTTGCAATTCCAGATTG SNP 58 F - GTA GTA CAT CAA CAT ACA TTT TGC GG R - CTC AGA ATT CAG AGC TTC AAC TGA TG 3.2.3 Kết khảo sát cá thể mang gen QTL/gen kháng bệnh mốc sương nấm Phytopthora infestans Phân tích kết chạy điện di sản phẩm PCR sử dụng Marker R3b cho thấy, gen khuếch đại giếng 22, 23, 26, 38, 40 với kích thước 378 bp (hình 3.4) Điều cho phép kết luận rằng, có giống Solara (giếng 26, 38), PO3 (giếng 40) trồng phổ biến Viêt Nam tổ hợp lai số 10-41 (giếng 22), 10-83 (giếng 23) phép lai Solar47 có mang gen R3b nằm nhiễm sắc thể số 11 kháng bệnh mốc sương Các dòng 47 (giếng 29), 106 (giếng 30), 113 (giếng 31), 115 (giếng 32), 116 (giếng 33), 119 (giếng 27, 34), 124 (giếng 35), 129 (giếng 28, 36), 140 (giếng 37) nhận từ trung tâm khoai tây quốc tế (CIP) giống KT3 (giếng 24, 25, 39) trồng phổ biến nước ta, tổ hợp lai chúng không mang gen kháng bệnh mốc sương R3b Nguyễn Thị Duyên – K18.1101 Khoa Công Nghệ Sinh Học Viện Đại học Mở Hà Nội Hình 3.4 Kết điện di sản phẩm PCR sử dụng Marker R3b Giếng – dòng 1-18; giếng – dòng 1-87; giếng – dòng 1-93; giếng – dòng 1104; giếng – dòng 1-112; giếng – dòng 1-128; giếng – dòng 1-187; giếng – dòng 2-11; giếng – dòng 3-18; giếng 10 – dòng 3-213;giếng 11 – dòng 3-234; giếng 12 – dòng 4-35; giếng 13 – dòng 4-64; giếng 14 – dòng 4-66; giếng 15 – dòng 4-187; giếng 16 – dòng 6-77;giếng 17 – dòng 6-130; giếng 18 – dòng 6-162; giếng 19 – dòng 7-28; giếng 20 – dòng 7-54; giếng 21 – dòng 8-33; giếng 22 – dòng 10-41; giếng 23 – dòng 1083; giếng 24, 25, 39 – giống KT3; giếng 26, 38 – giống Solara; giếng 27, 34 – dòng 119; giếng 28, 36 – dòng 129; giếng 29 – dòng 47; giếng 30 – dòng 106; giếng 31 – dòng 113; giếng 32 – dòng 115; giếng 33 – dòng 116; giếng 35 – dòng 124; giếng 37 – dòng 140; giếng 40 – giống PO3; M – Gene Ruler Kb plus Nguyễn Thị Duyên – K18.1101 Khoa Công Nghệ Sinh Học Viện Đại học Mở Hà Nội Hình 3.5 Kết điện di sản phẩm PCR sử dụng Marker RB-629 Giếng – dòng 1-18; giếng – dòng 1-87; giếng – dòng 1-93; giếng – dòng 1104; giếng – dòng 1-112; giếng – dòng 1-128; giếng – dòng 1-187; giếng – dòng 2-11; giếng – dòng 3-18; giếng 10 – dòng 3-213; giếng 11 – dòng 3-234; giếng 12 – dòng 4-35; giếng 13 – dòng 4-64; giếng 14 – dòng 4-66; giếng 15 – dòng 4-187; giếng 16 – dòng 6-77;giếng 17 – dòng 6-130; giếng 18 – dòng 6-162; giếng 19 – dòng 7-28; giếng 20 – dòng 7-54; giếng 21 – dòng 8-33; giếng 22 – dòng 10-41; giếng 23 – dòng 1083; giếng 24, 25, 39 – giống KT3; giếng 26, 38 – giống Solara; giếng 27, 34 – dòng 119; giếng 28, 36 – dòng 129; giếng 29 – dòng 47; giếng 30 – dòng 106; giếng 31 – dòng 113; giếng 32 – dòng 115; giếng 33 – dòng 116; giếng 35 – dòng 124; giếng 37 – dòng 140; giếng 40 – giống PO3; M – Gene Ruler Kb plus Kết điện di sản phẩm PCR sử dụng Marker RB-629 cho thấy, gen khuếch đại giếng số 1, 2, 5, 10, 13, 14, 15, 16, 17, 19, 21, 24, 25, 32, 39 với kích thước 629 bp (hình 3.5) Phân tích kết rằng, giống khoai tây địa phương KT3 (giếng 24, 25, 39) dòng 115 (giếng 32) nhập từ trung tâm khoai tây quốc tế CIP có chứa gen Rb/Rpi-blb1 nhiễm sắc thể số 8, kháng bệnh mốc sương nấm phytophtora infestans gây Các dòng số 47 (giếng 29), 106 (giếng 30), 113 (giếng 31), 116 (giếng 33), 119 (giếng 27, 34), 124 (giếng 35), 129 (giếng 28, 36), 140 (giếng 37) Nguyễn Thị Duyên – K18.1101 Khoa Công Nghệ Sinh Học Viện Đại học Mở Hà Nội nhập từ CIP hai giống địa phương Solara (giếng 26, 38), PO3 (giếng 40) không mang gen Rb/Rpi-blb1 Mặt khác, phân tích tổ hợp lai dựa thị RB-629 cho thấy, lai số 1-18 (giếng 1), 1-87 (giếng 2), 1-112 (giếng 5) phép lai KT3×116; lai số 3213 (giếng 10) phép lai KT3×140; lai số 4-64 (giếng 13), 4-66 (giếng 14), 4-187 (giếng 15) phép lai KT3×106; lai số 6-77 (giếng 16), 6-130 (giếng 17) phép lai KT3×115; lai số 7-28 (giếng 19) phép lai KT3×129; lai số 8-33 (giếng 21) phép lai KT3×113 mang gen kháng bệnh mốc sương Rb/Rpi-blb1 Kết điện di sản phẩm PCR sử dụng Marker R1-1205 cho thấy, gen khuếch đại giếng số 2, 4, 5, 8, 10, 11, 14, 16, 17, 18, 20, 21, 24, 25, 35, 37, 39, với kích thước 1205 bp (hình 3.6) Phân tích kết rằng, giống khoai tây địa phương KT3 (giếng 24, 25, 39), dòng 124 (giếng 35), 140 (giếng 37) trung tâm khoai tây quốc tế CIP mang gen R1 nằm nhiễm săc thể số 5, kháng bệnh mốc sương nấm Phytophtora infestans gây Như vậy,chỉ thị R1-1205 sử dụng để xác định gen R1 kháng bệnh mốc sương dòng/giống khoai tây trồng Việt Nam Tương tự, sử dụng thị R1-1205 phân tích tổ hợp lai phép lai giống địa phương KT3 với dòng khoai tây CIP cho thấy, lai 1-87 (giếng 2), 1-104 (giếng 4), 1-112 (giếng 5), 2-11 (giếng 8), 3-213 (giếng 10), 3-234 (giếng 11), 4-66 (giếng 14), 6-77 (giếng 16), 6-130 (giếng 17), 6-162 (giếng 18), 7-54 (giếng 20), 8-33 (giếng 21) mang gen R1 kháng bệnh mốc sương Nguyễn Thị Duyên – K18.1101 Khoa Công Nghệ Sinh Học Viện Đại học Mở Hà Nội Hình 3.6 Kết điện di sản phẩm PCR sử dụng Marker R1-1205 Giếng – dòng 1-18; giếng – dòng 1-87; giếng – dòng 1-93; giếng – dòng 1104; giếng – dòng 1-112; giếng – dòng 1-128; giếng – dòng 1-187; giếng – dòng 2-11; giếng – dòng 3-18; giếng 10 – dòng 3-213; giếng 11 – dòng 3-234; giếng 12 – dòng 4-35; giếng 13 – dòng 4-64; giếng 14 – dòng 4-66; giếng 15 – dòng 4-187; giếng 16 – dòng 6-77;giếng 17 – dòng 6-130; giếng 18 – dòng 6-162; giếng 19 – dòng 7-28; giếng 20 – dòng 7-54; giếng 21 – dòng 8-33; giếng 22 – dòng 10-41; giếng 23 – dòng 1083; giếng 24, 25, 39 – giống KT3; giếng 26, 38 – giống Solara; giếng 27, 34 – dòng 119; giếng 28, 36 – dòng 129; giếng 29 – dòng 47; giếng 30 – dòng 106; giếng 31 – dòng 113; giếng 32 – dòng 115; giếng 33 – dòng 116; giếng 35 – dòng 124; giếng 37 – dòng 140; giếng 40 – giống PO3; M – Gene Ruler Kb plus Phân tích kết sản phẩm điện di sử dụng SCAR Marker SSTO-448 cho thấy, gen nhân bội giếng 1, 4, 7, 11, 14, 15, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 31, 32, 33, 34, 36, 38, 39, 40 với kích thước 448 bp (hình 3.7) Điều chứng tỏ mẫu khoai tây 1-18 (giếng 1), 1-104 (giếng 4), 3-234 (giếng 11), 4-66 (giếng 14), 4-187 (giếng 15), 6-130 (giếng 17), 6-162 (giếng 18), 7-28 (giếng 19), 833(giếng 21), 10-41 (giếng 22), 10-83 (giếng 23), KT3 (giếng 24, 25, 39), Solara (giếng Nguyễn Thị Duyên – K18.1101 Khoa Công Nghệ Sinh Họcc Vi Viện Đại họ ọc Mở Hà Nội 26, 38), 119 (giếng ng 27, 34), 129 (gi (giếng 28, 36), 47 (giếng 29), 113 (giếng ng 31), 115 (giếng (gi 32), 116 (giếng 33) mang đoạn gen liên kkết với thị SSTO-448 xác định khả kháng bệnh mốc sương câyy khoai tây ng Marker SSTO - 448 Hình 3.7 Kết điệện di sản phẩm PCR sử dụng Giếng – dòng 1-18; 18; gi giếng – dòng 1-87; giếng – dòng 1-93; 93; giếng gi – dòng 1104; giếng – dòng 1-112; 112; gi giếng – dòng 1-128; giếng – dòng 1-187; 187; giếng gi – dòng 2-11; giếng – dòng 3-18; 18; gi giếng 10 – dòng 3-213; giếng 11 – dòng 3-234; 234; giếng gi 12 – dòng 4-35; giếng 13 – dòng 64; giếng 14 – dòng 4-66; giếng 15 – dòng 4-187; giếng 16 – dòng 6-77;giếng 17 – dòng 66-130; giếng 18 – dòng 6-162; giếng ng 19 – dòng 7-28; giếng 20 – dòng 7-54; giếng ng 21 – dòng 8-33; giếng 22 – dòng 10-41; giếng ng 23 – dòng 1083; giếng 24, 25, 39 – giống ng KT3; gi giếng 26, 38 – giống Solara; giếng ng 27, 34 – dòng 119; giếng 28, 36 – dòng 129; giếng ng 29 – dòng 47; giếng 30 – dòng 106; giếng ng 31 – dòng 113; giếng 32 – dòng 115; giếng ng 33 – dòng 116; giếng 35 – dòng 124; giếng ng 37 – dòng 140; giếng 40 – giống PO3; M – Gene Ruler Kb plus Tuy nhiên, dòng khoai tây 44-66 (giếng 14), 4-187 (giếng 15), 130 (giếng 17), 8-33 (giếng 21) lại xuất hiệnn thêm m băng gen với kích thước khoảng ng 510 bp (hình Nguyễn Thị Dun – K18.1101 Khoa Cơng Nghệ Sinh Học Viện Đại học Mở Hà Nội 3.7) Băng gen 510 bp nguyên nhân khác biệt khẳ kháng bệnh mốc sương dòng khoai tây so với dòng khác quần thể Kết sản phẩm điện di sử dụng SNP Marker LP3 cho thấy, gen khuếch đại giếng 2, 3, 4, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 21, 23, 24, 25, 26, 28, 31, 32, 34 với kích thước 610 bp (hình 3.8) Điều chứng tỏ rằng, dòng/giống khoai tây 1-87 (giếng 2), 1-93 (giếng 3), 1-104 (giếng 4), 1-187 (giếng 7), 2-11 (giếng 8), 3-18 (giếng 9), 3-213 (giếng 10), 3-234 (giếng 11), 4-35 (giếng 12), 4-66 (giếng 14), 4187 (giếng 15), 6-77 (giếng 16), 6-130 (giếng 17), 6-162 (giếng 18), 7-28 (giếng 19), 833 (giếng 21), 10-83 (giếng 23), KT3 (giếng 24, 25), Solara (giếng 26), 129 (giếng 28), 113 (giếng 31), 115 (giếng 32) 119 (giếng 34) mang đoạn gen liên kết với thị LP3 xác định khả kháng bệnh mốc sương nấm Phytophtora infestans gây Hình 3.8 Kết điện di sản phẩm PCR sử dụng Marker LP3 Giếng – dòng 1-18; giếng – dòng 1-87; giếng – dòng 1-93; giếng – dòng 1104; giếng – dòng 1-112; giếng – dòng 1-128; giếng – dòng 1-187; giếng – dòng 2-11; giếng – dòng 3-18; giếng 10 – dòng 3-213; giếng 11 – dòng 3-234; giếng 12 – dòng 4-35; giếng 13 – dòng 4-64; giếng 14 – dòng 4-66; giếng 15 – dòng 4-187; giếng 16 – dòng 6-77;giếng 17 – dòng 6-130; giếng 18 – dòng 6-162; giếng 19 – dòng 7-28; Nguyễn Thị Duyên – K18.1101 Khoa Công Nghệ Sinh Học Viện Đại học Mở Hà Nội giếng 20 – dòng 7-54; giếng 21 – dòng 8-33; giếng 22 – dòng 10-41; giếng 23 – dòng 1083; giếng 24, 25, 39 – giống KT3; giếng 26, 38 – giống Solara; giếng 27, 34 – dòng 119; giếng 28, 36 – dòng 129; giếng 29 – dòng 47; giếng 30 – dòng 106; giếng 31 – dòng 113; giếng 32 – dòng 115; giếng 33 – dòng 116; giếng 35 – dòng 124; giếng 37 – dòng 140; giếng 40 – giống PO3; M – Gene Ruler Kb plus Tổng hợp kết phân tích hình ảnh điện di sản phẩm PCR tất thị phân tử nghiên cứu trên, thu thông tin đầy đủ thể bảng 3.5,bảng 3.6dưới Nguyễn Thị Duyên – K18.1101 Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa Công Nghệ Sinh Học Bảng 3.5 Tổng hợp kết điện di sản phẩm PCR Các dòng/giống khoai tây Marker 47 106 113 115 116 119 124 129 140 Solara KT3 PO3 R3b-378 - - - - - - - - - + - + RB-629 - - - + - - - - - - + - R1-1205 - - - - - - + - + - + - LP3-610 - - + + - + - + - + + - SSTO-448 + - + + + + - + - + + + 510 - - - - - - - - - - - - Ghi chú: + xuất băng gen; - Không xuất băng gen Nguyễn Thị Duyên – K18.1101 Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa Công Nghệ Sinh Học Bảng 3.6 Tổng hợp kết điện di sản phẩm PCR Các dòng khoai tây Marker 1- 1- 1- 1- 3- 3- 4- 6- 6- 10 10 1- 1- 1- 10 11 12 18 2- 3- 21 23 4- 4- 4- 18 6- 13 16 7- 7- 8- - - 18 87 93 11 18 35 64 66 77 28 54 33 41 83 R3b-378 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - + + RB-629 + + - - + - - - - + - - + + + + + - + - + - - R1-1205 - + - + + - - + - + + - - + - + + + - + + - - R1-1400 - + - + + - - + - + + - - + - + + + - + + - - LP3-610 - + + + - - + + + + + + - + + + + + + - + - + SSTO- + - - + - - + - - - + - - + + - + + + - + + + - - - - - - - - - - - - - + + - + - - - + - - 448 510 Ghi chú: + xuất băng gen; - Không xuất băng gen Nguyễn Thị Duyên – K18.1101 Khoa Công Nghệ Sinh Học Viện Đại học Mở Hà Nội Trong quần thể dịng/giống khoai tây chúng tơi phân tích, phần lớn dòng/giống mang gen kháng bệnh mốc sương như: gen R1 nằm nhiễm sắc thể số 5, gen R3b nằm nhiễm sắc thể số 11, gen RB/Rpi-blb1 nằm nhiễm sắc thể số Trong đó: • Dòng 47, 116, mang đoạn gen liên kết với thị SCAR SSTO-448; • Dịng 106 khơng mang gen kháng bệnh mốc sương; • Dịng 113 mang đoạn gen liên kết với thị SNP LP3, SCAR SSTO-448; • Dòng 115 mang gen RB/Rpi-blb1 đoạn gen liên kết với thị SNP LP3, SCAR SSTO-448; • Dòng 119, 129, mang đoạn gen liên kết với thị SNP LP3, SCAR SSTO448; • Dịng 124, 140, mang gen R1; • Giống Solara mang gen R3b đoạn gen liên kết với thị SNP LP3, SCAR SSTO-448; • Giống KT3 mang gen R1, RB/Rpi-blb1 đoạn gen liên kết với thị SNP LP3, SCAR SSTO-448; • Giống PO3 mang gen R3b đoạn gen liên kết với thị SCAR SSTO-448; • Dịng 1-18 mang gen R1, RB/Rpi-blb1 đoạn gen liên kết với thị SCAR SSTO-448; • Dịng 1-87, 3-213, 6-77 mang gen R1, RB/Rpi-blb1 đoạn gen liên kết với thị SNP LP3; • Dịng 1-93, 4-35 mang đoạn gen liên kết với thị SNP LP3; • Dịng 1-104 mang gen R1, đoạn gen liên kết với thị SNP LP3, SCAR SSTO-448; • Dòng 1-112 mang gen R1, RB/Rpi-blb • Dòng 1-128 khơng mang gen kháng bệnh mốc sương; • Dịng 1-187 mang đoạn gen liên kết với thị SNP LP3, SCAR SSTO-448; • Dịng 2-11 mang gen R1, đoạn gen liên kết với thị SNP LP3; Nguyễn Thị Duyên – K18.1101 Khoa Công Nghệ Sinh Học Viện Đại học Mở Hà Nội • Dịng 3-18 mang đoạn gen liên kết với thị SNP LP3; • Dòng 3-324 mang gen R1, đoạn gen liên kết với thị SNP LP3, SCAR SSTO-448; • Dịng 4-64 mang gen RB/Rpi-blb1; • Dịng 4-66, 8-33, mang gen R1, RB/Rpi-blb1 đoạn gen liên kết với thị SNP LP3, SCAR SSTO-448; • Dịng 4-187 mang gen RB/Rpi-blb1 đoạn gen liên kết với thị SNP LP3, SCAR SSTO-448; • Dịng 6-130 mang gen R1, RB/Rpi-blb1 đoạn gen liên kết với thị SNP LP3, SCAR SSTO-448, SCAR Sdms-523; • Dịng 6-132 mang gen R1, RB/Rpi-blb1 đoạn gen liên kết với thị SNP LP3, SCAR SSTO-448; • Dịng 7-28 mang gen RB/Rpi-blb1 đoạn gen liên kết với thị SNP LP3, SCAR SSTO-448; • Dịng 7-54 mang gen R1; • Dịng 10-41 mang gen R3b, đoạn gen liên kết với thị SCAR SSTO-448; • Dịng 10-83 mang gen R3b, đoạn gen liên kết với thị SNP LP3, SCAR SSTO-448 Sử dụng thị SCAR R1-1205 thiết kế cho gen R1, SCAR R3b-378 thiết kế cho gen R3b, SCAR RB-629 thiết kế cho gen RB/Rpi-blb1 cho phép xác định cá thể mang R-gen kháng bệnh mốc sương, tạo vật liệu khởi đầu phục vụ cho công tác chọn tạo giống khoai tây Nguyễn Thị Duyên – K18.1101 Khoa Công Nghệ Sinh Học Viện Đại học Mở Hà Nội CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 KẾT LUẬN Qua thí nghiệm đồng ruộng, thu thập đánh giá số đặc điểm nông sinh học mẫu giống khoai tây có nguồn gốc xuất xứ khác Chúng tơi nhận thấy giống mẫu giống có thời gian phát triển trung bình từ 85-90 ngày, sức sinh trưởng tốt, số thân/khóm cao, cho suất chất lượng củ tốt Trong mấu giống KT3 mang đặc điểm trội cả, dùng làm mẫu đối chứng Tổng hợp kết phòng thí nghiệm, chúng tơi nhận thấy ngồi mẫu 106 1-128 không mang gen kháng bệnh mốc sương, mẫu giống lại mang gen mang đoạn gen liên kết với thị phân tử kháng bệnh mốc sương Trong đó, mẫu giống KT3, 4-66, 8-33, 6-130, 6-132, 7-28 mang gen R1, RB/Rpi-blb1 đoạn gen liên kết với thị LP3, SSTO-448 Sử dụng thị SCAR R1-1205 thiết kế cho gen R1, SCAR R3b-378 thiết kế cho gen R3b, SCAR RB-629 thiết kế cho gen RB/Rpi-blb1 cho phép xác định cá thể mang R-gen kháng bệnh mốc sương, tạo vật liệu khởi đầu phục vụ cho công tác chọn tạo giống khoai tây 4.2 KIẾN NGHỊ Trong thí nghiệm nghiên cứu thị phân tử để xác định dòng lai phục vụ cho chọn tạo giống khoai tây mốc sương Thời gian tới, nghiên cứu thêm nhiều thị phân tử để xác định dòng khoai tây mang gen kháng bệnh mốc sương, phục vụ cho chọn tạo giống Mẫu giống KT3, 4-66, 8-33, 6-130, 6-132, 7-28 mang gen R1, RB/Rpi-blb1 đoạn gen liên kết với thị LP3, SSTO-448, lại có mức độ sinh trưởng tốt, số thân lớn, suất cao Đề nghị đưa mẫu giống vào thử nghiệm diện rộng tỉnh thuộc Đồng sông Hồng Nguyễn Thị Duyên – K18.1101 Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa Cơng Nghệ Sinh Học TÀI LIỆU THAM KHẢO • Tài liệu nước Tạ Thu Cúc (2000), Giáo trình trồng rau, Nxb Đại học THCN Đường Hồng Duật (2004) Cây khoai tây kỹ thuật thâm canh tăng suất, Nxb Lao động – xã hội Lê Bạch Lan, Nguyễn Văn Khâm, Phùng Huy (1979) Hỏi đáp kỹ thuật trồng khoai tây, Nxb Thanh Hóa, Tr 23 Tạ Thu Cúc (1979), Giáo trình trồng rau, Nxb Đại học TCCN, Tr 25 – 148 Đỗ Kim Chung (2003), Thị trường khoai tây Việt Nam, Nxb Văn hóa-Thơng tin Hà Nội Viện bảo vệ thực vật (1975), Kết điều tra bệnh 1967-1968 Vũ Hoan (1973) Nghiên cứu hình thái nấm Phytophthora infestans (Mont) de Bary gây bệnh mốc sương cà chua Tạp chí KHKTNN số 129, tr 178-183 Vũ Triệu Mân, Lê Lương Tề (1998), Bệnh nơng nghiệp, NXB Nơng nghiệp Hà Nội Hồng Thị Mỹ (1956), Luận khảo bệnh thường hại cối miền Nam Việt Nam 10 Ngô Thị Xuyên, Lê Hồng Vĩnh, Burger Hermansen (2005), Nghiên cứu đặc điểm nấm Phytophthora infestans Việt Nam 11 Ngô Thị Xuyên Hoàng Văn Thọ (2003), Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy nấm thuôc Metalaxyl đến sinh trưởng, phát triển nấm Phytophthora infestans (Mont.) de Bary số giống cà chua, khoai tây Tạp chí KHKTNN Tập 1, số 3, tr 197-202 • Tài liệu nước Apichai N (1998), Microtuber production of potato in vitro, Journal of the National reseach council of Thailan Van der Zaag, D E (1976), Potato production and utilization in the world, Am.J Potato Res 19, pp.37-72 Nguyễn Thị Duyên – K18.1101 Khoa Công Nghệ Sinh Học Viện Đại học Mở Hà Nội FAO (1991), Potato Production and consumption in developing countries, Rome 1991 FAO (2005), FAO statistic database Lommen W.J.M.Struik P.C (1993) , Hypothesis describing the production of minitubers by repeated harvesting, Abtracts EAPR 1993 Nosberger J and Humphru E C (1965), “the influence of removing tubers on dry matter production and assimilatuon rate of potato plants”, Ann.Bot 29, page 879885 Drenth A., Sendall B (1996), Practice guide to detection and identification Phytophthora, CRC for the Tropical Plant Protection, P 12-39 University of Wisconsin-Madison, Finding rewrites the evolutionary history of the origin of potatoes (2005) • Tài liệu nguồn internet Hijmans, RJ; Spooner, DM (2001) “Geographic distribution of wild potato species”.American Journal of Botany (Botanical Society of America) China - World Potato Atlas - CIP-collab India - World Potato Atlas - CIP-collab Nguyễn Thị Duyên – K18.1101