Bài viết sử dụng chỉ thị phân tử DNA để phát hiện gen mùi thơm trong tập đoàn các giống lúa địa phương. Thí nghiệm thực hiện trên 81 giống lúa đã được thu thập ở nhiều địa phương khác nhau. Sử dụng hai cặp mồi ESP và IFAP nhằm xác định gen quy định mùi thơm - là gen lặn, ký hiệu FGR, định vị trên NST số 8 liên kết chặt chẽ với marker RG28.
TẠP CHÍ KHOA HỌC TRƢỜNG ĐẠI HỌC HỒNG ĐỨC - SỐ 49.2020 SỬ DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ ĐỂ XÁC ĐỊNH GEN KIỂM SỐT MÙI THƠM (FGR) TRONG TẬP ĐỒN CÁC GIỐNG LÚA ĐỊA PHƢƠNG Nghiêm Thị Hƣơng1, Nguyễn Thị Vân2 TÓM TẮT Nghiên cứu sử dụng thị phân tử DNA để phát gen mùi thơm tập đồn giống lúa địa phương Thí nghiệm thực 81 giống lúa thu thập nhiều địa phương khác Sử dụng hai cặp mồi ESP IFAP nhằm xác định gen quy định mùi thơm - gen lặn, ký hiệu FGR, định vị NST số liên kết chặt chẽ với marker RG28 Kết nghiên cứu cho thấy phát thấy giống lúa chứa gen mùi thơm fgr là: 10102, 10059, 10089, 10096 10063-1 Điều có ý nghĩa quan trọng việc tạo nguồn vật liệu khởi đầu cho trình chọn tạo giống lúa có chất lượng cao Từ khóa: Cây lúa, gen FGR, mùi thơm ĐẶT VẤN ĐỀ Việt Nam nôi lúa nƣớc, đ nguồn gen lúa phong phú, đ ng vai trò quan trọng việc chọn tạo giống lúa c chất lƣợng cao Tuy nhiên nhiều giống lúa địa phƣơng bị thoái hoá c nguy hẳn (do việc sản xuất giống lúa yêu cầu chi phí sản xuất cao, suất thấp kh tiêu thụ) Trƣớc thực trạng đ nhà khoa học cho đ đến lúc phải trọng công tác thu thập, bảo tồn đánh giá nguồn gen để c hƣớng sử dụng hợp lí Mặc dù nƣớc xuất gạo hàng đầu giới nhƣng giá gạo xuất Việt Nam thị trƣờng giới thƣờng thấp so với gạo xuất từ nƣớc nhƣ Mỹ, Thái Lan, Ấn Độ Một nguyên nhân chất lƣợng gạo nƣớc ta chƣa tốt Đặc tính mùi thơm lúa đƣợc ngƣời tiêu dùng đánh giá cao Chính việc chọn tạo giống lúa mới, c mùi thơm kết hợp đƣợc số tính trạng tốt nhƣ chất lƣợng gạo, khả chống chịu sâu bệnh chiến lƣợc nông nghiệp Hiện nay, giới đ c nhiều nghiên cứu gen mùi thơm lúa Tại Đại học Cornell, Ahn et al đ sử dụng marker để nghiên cứu gen điều khiển tính trạng mùi thơm, theo đ gen quy định mùi thơm gen lặn, ký hiệu fgr, định vị NST số liên kết chặt chẽ với marker RG28 Theo nghiên cứu Brabury et al, 2005 đ phát giống lúa thơm có gen mã hóa cho Betaine aldehyde dehydrrogenase (BAD2) nằm NST số Dựa kết trên, Braury et al đ sử dụng phƣơng pháp ASA (Allele Specific Amplification) với cặp mồi ESP, EAP, IFAP INSP Giúp phân biệt kiểu gen giống lúa đồng hợp tử thơm (cho băng 257bp), dị hợp tử (cho băng dài 355bp 257bp) không thơm (cho băng dài 355bp) Để tạo nguồn vật liệu cho công tác chọn tạo giống lúa có chất lƣợng cao mang gen mùi thơm, nghiên cứu đ sử dụng hai cặp mồi ESP IFAP nhằm xác định gen quy định mùi thơm (fgr) tập đoàn giống lúa địa phƣơng 1,2 Khoa Nông - Lâm - Ngư nghiệp, Trường Đại học Hồng Đức 83 TẠP CHÍ KHOA HỌC TRƢỜNG ĐẠI HỌC HỒNG ĐỨC - SỐ 49.2020 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu Thí nghiệm thực 81 giống lúa thu thập nhiều địa phƣơng khác Sử dụng đối chứng giống lúa Bắc Thơm 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1 hương pháp chiết tách DNA Chuẩn bị dịch chiết tách DNA:TrisHCl 50Mm PH=8, EDTA 0,25mM PH=8, Nacl 300 mM H2O Chuẩn bị dung dịch TE dùng để bảo quản DNA: Tris HCl 10Mm, EDTA 1mM, PH=8 H2O Quy trình tách chiết Lá lúa non, khoẻ thu từ sáng sớm (khi đ chƣa quang hợp, chiết tách DNA không bị lẫn tinh bột), cho vào ống nghiệm ghi tên giống ống nghiệm Cối, chày sứ đƣợc khử trùng, đặt đá lạnh Cắt cm mẫu lúa thành mẫu nhỏ kéo vô trùng vào cối Cho 400µl dung dịch chiết xuất DNA, nghiền nhỏ dung dịch chuyển sang màu xanh, chứng tỏ tế bào đ vỡ diệp lục đƣợc giải phóng Đổ thêm 400µl dung dịch chiết xuất DNA vào trộn lẫn chuyển 400µl dung dịch vào ống eppendort đ đánh dấu tên giống sau đ lại đặt vào đá lạnh Thêm 700µl dung dịch Phenol: Chloroform:Isoamylancohol (25:24:1) vào ống eppendort ly tâm khoảng phút, 13000 vòng nhiệt độ 15 - 210C Chuyển phần dung dịch phía vào ống eppendort đ ghi tên giống, thêm 600µl dung dịch Chloroform: Isoamylancohol (24:1) ly tâm phút, 13000 vòng nhiệt độ 15 - 210C Chuyển phần dung dịch phía sang ống eppendort đ đánh dấu tên giống, sau đ cho 800µl ethanol vào ly tâm phút, 13000 vòng nhiệt độ 15 - 210C, để kết tủa DNA Bỏ phần dung dịch phía trên, giữ lại phần kết tủa dƣới, để khô tự nhiên cách úp ngƣợc ống nghiệm giấy thấm Hồ tan kết tủa DNA 50µl TE, bảo quản nhiệt độ -200C 2.2.2 Nhân CR phát gen mùi thơm Vị tr nhân gen mùi thơm IFAP ESP 577 257 EAP 84 TẠP CHÍ KHOA HỌC TRƢỜNG ĐẠI HỌC HỒNG ĐỨC - SỐ 49.2020 Trình tự mồi dùng CR (Louis MT Bradbury el al 2005 Tên mồi Trình tự External Sense Primer (ESP) TTG TTT GGA GTC TGC TGA TG Internal Fragrant Antisense Primer (IFAP) CAT AGG AGC AGCTGA AAT ATA TACC Thành phần phản ứng PCR với thể tích mẫu 25 µl gồm: 0,2 µl Taq DNA Polymerase; 2,5 µl Taq Buffer 10 X; µl MgCl2 25Mm; 0,5 µl dNTP 10mM; 2,5 µl ESP primer ; 2,5 µl IFAP primer; 13,8 µl nuclerase free water µl DNA tổng số Thiết lập chu kì hoạt động: 940C phút 32 chu kỳ 940C 30 giây; 560C 30 giây; 720C 30 giây 720C phút 2.2.3 Điện di sản phẩm nhuộm màu phát gen Sản phẩm sau chạy PCR đƣợc điện di gel agarose 1%, 65V 45 phút Nhuộm Ethymium bromide 10mg/ml 10 phút chụp ảnh máy chụp UV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết kiểm tra độ tinh DNA tách chiết Để kiểm tra độ tinh DNA, sau tách chiết ch ng tiến hành điện di DNA tách chiết Giếng Bắc thơm Giếng IR64 Giếng Jasmine Giếng 10136 Giếng 10143 Giếng 10261 Giếng 10062 Giếng 10707 Hình Kết điện di DNA tổng số Điện di sản phẩm chiết tách giống lúa thí nghiệm cho thấy vệt băng DNA tất giống rõ, tập trung nhƣng chƣa gọn, điều chứng tỏ DNA nguyên v n nhƣng chƣa tinh Nhƣng thực phản ứng PCR với mồi đặc hiệu nên DNA tách chiết giống thực cho phản ứng PCR 3.2 Ứng dụng thị phân tử xác định gen quy định mùi thơm 3.2.1 Kết kiểm tra độ ch nh xác mồi Trong nghiên cứu đ sử dụng mồi đơn ESP IFAP để nhân lên đoạn DNA nhận biết cho tính trạng mùi thơm Khi chạy PCR với giống thơm c chứa đột biến 85 TẠP CHÍ KHOA HỌC TRƢỜNG ĐẠI HỌC HỒNG ĐỨC - SỐ 49.2020 8bp 3SNPs trình tự gen quy định cho vạch băng dài 257bp, cịn với giống khơng mang gen thơm không c băng DNA dài 257bp đƣợc nhân lên Tiến hành kiểm tra độ xác mồi Phản ứng PCR đƣợc thực giống đối chứng thơm không thơm, kết thu đƣợc sau điện di sản phẩm PCR cho thấy với giống đối chứng c hƣơng thơm: Bắc thơm Jasmine xuất vạch băng 257bp, với giống đối chứng khơng thơm IR64 khơng c vạch băng đƣợc nhân lên Nhƣ vậy, sử dụng mồi ESP IFAP cho kết phát gen xác 100% 3.2.2 Kết xác định gen mùi thơm tập đoàn giống l a địa phương Sử dụng hai mồi ESP IFAP để xác định có mặt gen mùi thơm tập đồn giống lúa địa phƣơng Kết điện di thể hình 2 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 257bp 300bp 200bp Hình Kết điện di xác định gen mùi thơm Giếng Ladder Giếng 10081 Giếng 11 10740 Giếng 16 10120 Giếng Bắc thơm Giếng 10102 Giếng 12 10266 Giếng 17 10700 Giếng IR64 Giếng 10059 Giếng 13 10089 Giếng 18 10160 Giếng 10252 Giếng 10063-1 Giếng 14 10703 Giếng 19 10294 Giếng 10290 Giếng 10 10130 Giếng 15 10096 Nhận xét: Phát thấy giống chứa gen fgr : 10102, 10059, 10089, 10096, 10063-1 Bảng Kết chạy PCR phát gen mùi thơm Các giống lúa địa phƣơng 10102 10109 10111 10113 10117 10120 10121 10122 10123 86 Gen fgr + - Các giống lúa địa phƣơng 28 10250 29 10251 30 10252 31 10254 32 10255 33 10256 34 10259 35 10260 36 10261 Gen fgr - Các giống lúa địa phƣơng 55 10703 56 10706 57 10707 58 10708 59 10709 60 10710 61 10711 62 10715 63 10718 Gen fgr - TẠP CHÍ KHOA HỌC TRƢỜNG ĐẠI HỌC HỒNG ĐỨC - SỐ 49.2020 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 10125 10130 10135 10136 10143 10154 10160 10162 10164 10166 10177 10180 10235 10240 10241 10243 10247 10249 - 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 10266 10269 10272 10290 10294 10059 10062 10066 10067 10081 10085 10087 10088 10089 10091 10096 10097 10700 + + + - 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 10721 10722 10724 10729 10733 10737 10740 10741 10745 10746 10748 10126-1 10126-2 10138-2 10182-1 10185-1 10185-2 10063-1 + KẾT LUẬN Khi sử dụng mồi ESP IFAP để xác định có mặt gen mùi thơm tập đoàn giống lúa địa phƣơng đ phát giống chứa gen mùi thơm fgr là: 10102, 10059, 10089, 10096 10063-1 Cần khảo sát đánh giá lại giống đ phát có gen mùi thơm c hƣớng sử dụng giống đ phát gen thơm công tác chọn tạo giống nhằm tạo giống lúa thơm TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] [2] [3] [4] [5] [6] Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang (2008), Một số vấn đề cần biết gạo xuất khẩu, Nxb Nơng nghiệp thành phố Hồ Chí Minh Nguyễn Thị Lang, Bùi Chí Bửu (2004), Ứng dụng marker phân tử đánh dấu gen mùi thơm l a, Tạp chí Di truyền Ứng dụng, số Phạm Văn Phƣợng (2006), Ứng dụng kỹ thuật điện di protein SDS - AGE để nghiên ứu đặc điểm di truyền chọn giống lúa, Luận án Tiến sĩ Nông nghiệp, Trƣờng Đại học Cần Thơ Juliano B.O (1990), Rice grain quality: problems and challenges, Cereal food world 35, page 245-253 Louis M.T Bradburry, Robert J Henry, Qing Sheng Jin, Russell F Reink, Daniel L E, (2005), Waters - A perfect marker for fragrange genotyping in rice - Molecular Breeding 16: pape 279 - 283 Khush G.S and N.Dela Cruz (2014), Developing Basmati srizes with high yiel potential, Chaper Speciallity rice of the world 87 TẠP CHÍ KHOA HỌC TRƢỜNG ĐẠI HỌC HỒNG ĐỨC - SỐ 49.2020 USING MOLECULAR MARKER TO DETECT AROMATIC CONTROLLING GENES (FGR) OF LOCAL RICE VARIETIES Nghiem Thi Huong, Nguyen Thi Van ABSTRACT This study focused on the application of DNA molecular marker to detect genes for fragrance in local rice varieties 81 rice varieties, which were collected in different locations were studied Two pairs of primers, ESP and IFAP were used to identify genes for fragrance which were recessive genes, FGR symbol, located on chromosome closely linked to the RG28 marker The results indicated that genes for fragrance (FGR gene) presented in rice varieties including 10102, 10059, 10089, 10096 and 10063-1 This information plays an important role in creating the initial material for high quality rice breeding Keywords: Rice, FGR genes, fragrance * Ngày nộp bài: 30/3/2018; Ngày gửi phản biện: 26/4/2018; Ngày duyệt đăng: 4/3/2020 88 ... 3.2 Ứng dụng thị phân tử xác định gen quy định mùi thơm 3.2.1 Kết kiểm tra độ ch nh xác mồi Trong nghiên cứu đ sử dụng mồi đơn ESP IFAP để nhân lên đoạn DNA nhận biết cho tính trạng mùi thơm Khi... với giống đối chứng khơng thơm IR64 khơng c vạch băng đƣợc nhân lên Nhƣ vậy, sử dụng mồi ESP IFAP cho kết phát gen xác 100% 3.2.2 Kết xác định gen mùi thơm tập đoàn giống l a địa phương Sử dụng. .. Khi sử dụng mồi ESP IFAP để xác định có mặt gen mùi thơm tập đồn giống lúa địa phƣơng đ phát giống chứa gen mùi thơm fgr là: 10102, 10059, 10089, 10096 10063-1 Cần khảo sát đánh giá lại giống