Nghiên cứu đa dạng di truyền tập đoàn 48 giống ngô địa phương bằng chỉ thị SSR

Lê Thị Bích Thủy, Trưởng phòng Di truyền tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tận tình hướng dẫn, chỉ dạy em trong suốt thời gian thực

LỜI CẢM ƠN

Hoàn thành chương trình thực tập tốt nghiệp này, em xin gửi lời cảm ơn trân trọng đến thầy, TS Nguyễn Văn Huấn, trưởng Bộ môn Công nghệ sinh học, Viện Sinh – Nông, Trường Đại học Hải Phòng và cô, TS Lê Thị Bích Thủy, Trưởng phòng Di truyền tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm khoa học

và Công nghệ Việt Nam đã tận tình hướng dẫn, chỉ dạy em trong suốt thời gian thực tập, làm thí nghiệm, phân tích số liệu và viết Báo cáo này;

Xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến các thầy, các cô Viện Sinh – Nông, Trường Đại học Hải Phòng đã dạy dỗ, truyền đạt cho em những kiến thức cơ bản, chuyên môn sâu rộng thuộc lĩnh vực công nghệ sinh học;

Xin được gửi lời cảm ơn chân thành đến các anh, các chị công tác tại Phòng

Di truyền tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm khoa học và Công nghệ Việt Nam đã hướng dẫn, chỉ dạy, tạo điều kiện cho em thực tập, làm thí nghiệm, giúp em có được kết quả tốt cho Báo cáo này;

Xin gửi lời cảm ơn đến các bạn lớp CNSH K13, Viện Sinh – Nông, Trường Đại học Hải Phòng đã tích cực trao đổi, giúp đỡ tôi trong cuộc sống và học tập suốt thời gian qua dưới mái trường Đại học Hải Phòng;

Cuối cùng, con xin ghi lòng, tạc dạ, đời đời nhớ ơn bố mẹ và gia đình không chỉ có công sinh thành, dưỡng dục mà đã luôn quan tâm, động viên, lo lắng, trợ giúp con đầy đủ cả về tinh thần và vật chất để con có thể hoàn thành tốt chương trình học đại học.

Hải Phòng, tháng 4 năm 2016

VŨ VĂN HIẾN

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

AFLP : Amplified fragment length polymorphism

cM : Centimorgan

CTAB : Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide

DNA : Deoxyribonucleic Acid

dNTP : Deoxynucleoside triphosphate

EDTA : Ethylenediaminetetraacetic acid

PCR : Polymerase Chain Reaction

RAPD : Random Amplified Polymorphism DNA

RFLP : Restriction Flagment Polymorphism DNA

SSR : Simple Sequence Repeats

TBE : Tris- Boric acid- EDTA

EthBr : Ethidium bromide

TE : Tris – EDTA

Tris : Trioxymetylaminometan

MỤC LỤC

2

MỤC LỤC 3

PHẦN I: MỞ ĐẦU 8

1 1 ĐẶT VẤN ĐỀ 8

1.2 MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU 9

1.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 10

1.4 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 10

PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 11

2.1 NGUỒN GỐC, XUẤT XỨ VÀ PHÂN LOẠI CÂY NGÔ 11

2.2 ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT HỌC CÂY NGÔ 11

2.3 ỨNG DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ TRONG NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN Ở NGÔ 13

2.3.1 Chỉ thị phân tử 13

2.3.2 Nghiên cứu đa dạng di truyền của ngô 15

2.4 ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN VÀ ĐA DẠNG NGUỒN GEN CÂY NGÔ 16

2.5 VAI TRÒ CỦA CHỌN CẶP LAI TRONG CHỌN TẠO GIỐNG 17

PHẦN III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

3.1 VẬT LIỆU 21

3.1.1 Mẫu ngô nghiên cứu và mồi SSR 21

Bảng 3.1 Các giống ngô sử dụng trong nghiên cứu 21

Bảng 3.2 Các mồi SSR sử dụng trong nghiên cứu 22

3.1.2 Hóa chất và thiết bị 22

3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

3.2.1 Phương pháp tách chiết DNA genome 23

3.2.2 Phương pháp chạy PCR với các mồi SSR 25

Bảng 3.3 Hỗn hợp phản ứng PCR với các mồi SSR 25

3.2.3 Phương pháp điện di trên gel agarose 26

3.2.4 Phương pháp kiểm tra sản phẩm PCR trên gel polyacrylamide 27

2.2.3 Phương pháp phân tích số liệu 29

PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30

4.1 KẾT QUẢ TÁCH DNA GENOME 30

Hình 4.1 Điện di DNA genome của đại diện một số mẫu ngô 31

4.2 PHÂN TÍCH ĐA HÌNH DNA BẰNG KỸ THUẬT SSR 31

Hình 4.2 Ảnh điện di gel polyacrylamide sản phẩm PCR cặp mồi Phi333597 với 24 giống ngô, M: marker 100 bp (Biolabs) 31

Tên giống: Số 51-giống 09N03, 52-09N05, 53- CML161, 54-DF18, 31

55- DF18C, 56- H02, 57- H042, 58- H1, 59-H12, 60- H14, 61- H31, 62- H35, 63-H46, 64-H53, 65-H56, 66- H63, 67- H71, 68- H76, 69- H81, 70- H82, 31

71- H84, 72- H99, 73- H145 31

Hình 4.3 Ảnh điện di gel polyacrylamide sản phẩm PCR cặp mồi Umc1562 với 24 giống ngô, M: marker 100 bp (Biolabs) 32

Tên giống: Số 51- giống 09N03, 52- 09N05, 53- CML161, 54- DF18, 32

55- DF18C, 56- H02, 57- H042, 58- H1, 59- H12, 60- H14, 61- H31, 32

62- H35, 63- H46, 64- H53, 65- H56, 66- H63, 67- H71, 68- H76, 69- H81, 70-H82, 71- H84, 72- H99, 73-H145, 35-Cây kháng, 36- Cây mẫn cảm 32

Hình 4.4 Ảnh điện di gel polyacrylamide sản phẩm PCR cặp mồi Umc 1249 với 24 giống ngô, M: marker 100 bp (Biolabs) 32

Tên giống : Số 51 -giống 09N03, 52- 09N05, 53- CML161, 54- DF18, 55- DF18C, 56- H02, 57- H042, 58- H1, 59- H12, 60-H14, 61- H31, 62- H35, 63- H46, 64- H53, 65- H56, 66- H63, 67- H71, 68- H76, 69- H81, 70- H82, 71- H84, 72- H99, 73- H145, 35- Cây kháng, 36-Cây mẫn cảm 32

Hình 4.5 Ảnh điện di gel polyacrylamide sản phẩm PCR cặp mồi Umc1196 với 24 giống ngô, M: marker 100 bp (Biolabs) 33

Tên giống: Số 51-giống 09N03, 52- 09N05, 53- CML161, 54-DF18, 55-DF18C, 56-H02, 57- H042, 58-H1, 59- H12, 60- H14, 61- H31, 62- H35, 63- H46, 64- H53, 65- H56, 66- H63, 67- H71, 68- H76, 69- H81, 70- H82, 71- H84, 72- H99, 73- H145, 35- Cây kháng, 36- Cây mẫn cảm 33

Hình 4.7 Ảnh điện di gel polyacrylamide sản phẩm PCR cặp mồi Umc1908 với 24 giống ngô, M: marker 100 bp (Biolabs) 34

Tên giống: Số 51-giống 09N03, 52- 09N05, 53- CML161, 54-DF18, 55- DF18C, 56- H02, 57- H042, 58- H1, 59- H12, 60- H14, 61- H31, 62 H35, 63- H46, 64- H53, 65- H56, 66- H63, 67- H71, 68- H76, 69- H81, 70- H82, 71- H84, 72- H99, 73- H145, 35- Cây kháng,

36- Cây mẫn cảm 34

4.3 HỆ SỐ PIC TRÊN CÁC MỒI NGHIÊN CỨU 34

Bảng 4.1 Mức độ đa hình của 10 mồi SSR khi phân tích 48 giống ngô 35

4.4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA CÁC GIỐNG NGÔ 36

Hình 4.8 Biểu đồ quan hệ di truyền giữa 48 giống ngô nghiên cứu 37

4.5 LỰA CHỌN CẶP LAI PHỤC VỤ CHO VIỆC CHỌN TẠO GIỐNG NGÔ KHÁNG BỆNH MỐC HỒNG 39

Bảng 4.2 Hệ số tương đồng di truyền giữa các giống ngô trong tổ hợp lai 40

V KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41

5.1 KẾT LUẬN 41

5.2 KIẾN NGHỊ 41

TÀI LIỆU THAM KHẢO 42

44

PHẦN I: MỞ ĐẦU

1 1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Cây ngô có tên khoa học là Zea mays L Ngô được gieo trồng rộng khắp

thế giới với sản lượng hàng năm cao hơn bất kỳ cây lương thực nào Hoa Kỳ

là nước có sản lượng ngô lớn nhất thế giới, tiếp đến là các nước như TrungQuốc, Brasil, Mexico, Argentina, Ấn Độ, Pháp, Indonesia, Nam Phi và Italia.Sản lượng toàn thế giới năm 2003 là trên 600 triệu tấn - hơn cả lúa và lúa mì.Năm 2005, gần 33 triệu ha ngô đã được gieo trồng trên khắp thế giới, với sảnlượng 692 triệu tấn Đến năm 2009, diện tích trồng ngô thế giới đạt khoảng159,5 triệu ha, năng suất bình quân 51,3 tạ/ha, sản lượng 817,1 triệu tấn

Ở Việt Nam, ngô là cây lương thực quan trọng thứ hai sau cây lúa và làcây màu quan trọng nhất được trồng ở nhiều vùng sinh thái khác nhau, đadạng về mùa vụ gieo trồng và hệ thống canh tác Cây ngô không chỉ cung cấplương thực cho người, vật nuôi mà còn là cây trồng xóa đói giảm nghèo tạicác tỉnh có điều kiện kinh tế khó khăn Sản xuất ngô cả nước qua các nămkhông ngừng tăng về diện tích, năng suất, sản lượng: năm 2001 tổng diện tíchngô là 730.000 ha, đến năm 2005 đã tăng trên 1 triệu ha; năm 2010, diện tíchngô cả nước 1126,9 nghìn ha, năng suất 40,9 tạ/ha, sản lượng trên 4,6 triệutấn Song sản lượng ngô trong nước vẫn chưa đáp ứng đủ nhu cầu trong nước,

9 tháng đầu năm 2009, nước ta đã nhập hơn 0,8 triệu tấn ngô (Cục TrồngTrọt, 2009) Vì vậy, việc nghiên cứu tạo ra những giống ngô có năng suất cao

là một nhiệm vụ quan trọng và cấp bách

Hiện nay, với sự phát triển nhanh chóng của các chỉ thị phân tử cung cấpcông cụ hữu ích cho việc đánh giá đa dạng di truyền ở mức ADN trên đốitượng thực vật (Melcihnger and Gumber, 1988) Các chỉ thị RFLP, AFLP,

SSR, STS, SCAR, RAPD, là những chỉ thị được sử dụng rộng rãi trongnghiên cứu di truyền các giống cây trồng nói chung và cây ngô nói riêng Cácphương pháp này khắc phục được nhược điểm của phương pháp chọn giốngtruyền thống bởi đánh giá được hệ gen của cây trồng các chỉ thị dựa trên cơ

sở kỹ thuật PCR như RAPD, SCAR, SSR, STS hiệu quả và thuận lợi hơn sovới RFLP vì đơn giản và chỉ cần một lượng nhỏ ADN tách từ mẫu mô sửdụng cho phân tích Do vậy, việc chọn lọc có thể được tiến hành ngay từ giaiđoạn sớm Trong đó, SSR được xem như dấu vân tay ADN của các kiểu genngô vì mức độ đa hình cao đã được tìm thấy (Smith et al, 1997)

Ngoài việc đánh giá phân loại tập đoàn dựa trên đặc tính hình thái gần đâyngười ta sử dụng một số kỹ thuật sinh học phân tử trong nghiên cứu đa dạng

di truyền của tập đoàn ngô và cho kết quả tốt, có nhiều hứa hẹn: SSR, AFLP,

đa hình nucleotide đơn (SNP- single nucleotide polymorphisms), nhân bản đahình vùng quan tâm (TRAP- target region amplification polymorphism), trình

tự gen mục tiêu (EST- expressed sequence tags)

Để khai thác nguồn tài nguyên di truyền cây ngô có hiệu quả, trước hếtphải nghiên cứu đánh giá sự đa dạng và mối quan hệ di truyền của các dònggiống trong tập đoàn Trên cơ sở đó có thể xác định được nguồn thực hiệnlàm bố mẹ phục vụ tốt cho chương trình lai tạo giống Chính vì vậy, chúng tôi

thực hiện đề tài “Nghiên cứu đa dạng di truyền tập đoàn 48 giống ngô địa

phương bằng chỉ thị SSR” nhằm mục đích lựa chọn cặp lai bố mẹ phục vụ

cho việc chọn tạo giống ngô lai kháng bệnh mốc hồng

1.2 MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU

Đánh giá mức độ đa dạng di truyền của 48 giống ngô bằng chỉ thị SSRnhằm lựa chọn cặp lai bố mẹ phục vụ cho việc chọn tạo giống ngô lai khángbệnh mốc hồng

1.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

- Phân tích tập đoàn ngô địa phương Việt Nam với 10 chỉ thị SSR

- Đánh giá đa dạng di truyền của tập đoàn 48 giống ngô địa phương

-PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 NGUỒN GỐC, XUẤT XỨ VÀ PHÂN LOẠI CÂY NGÔ

Những nghiên cứu về nguồn gốc cây trồng của Vavilov (1926) đã chorằng Mexico và Peru là trung tâm phát sinh và đa dạng di truyền của ngô.Mexico là trung tâm thứ nhất, vùng Andet (Peru) là trung tâm thứ 2 - tại đâycây ngô đã trải qua quá trình tiến hóa nhanh chóng Nhận định này củaVavilov được nhiều nhà khoa học chia sẻ (Galinat, 1977; Wilkes, 1980; Kato,

1984, 1988) Năm 1893 Harshberger (theo Wilkes, 1988) đã kết luận ngô bắtnguồn từ một cây hoang dại ở miền Trung Mexico trên độ cao 1500m củavùng hạn hán có mưa mùa hè khoảng 350mm Các nhà khảo cổ học đã tìmthấy hóa thạch hạt phấn ngô ở Bellas Artes và mẫu hạt phấn ngô cổ nhất đượctìm thấy ở độ sâu 70m và xác định vào niên đại công băng, ít nhất cách đâykhoảng 60.000 năm Cây ngô đã gắn bó chặt chẽ với đời sống của người dânbản xứ Trung Mỹ; ngô được suy tôn như bậc thần thánh, được cúng tế lúcgieo trồng và khi thu hoạch (Ngô Hữu Tình, 1977)

Từ loài Zea mays L., dựa vào cấu trúc nội nhũ của hạt được phân thànhcác loài phụ Những loài phụ chính gồm có (theo Ngô Hữu Tình, 1997):

Zea mays subsp indurata sturt - ngô đá

Zea mays subsp indentata sturt - ngô răng ngựa

Zea mays subsp ceratina kulesh - ngô nếp

Zea mays subsp saccharata sturt - ngô đường

Zea mays subsp everta sturt - ngô nổ

Zea mays subsp amylacea sturt - ngô bột

Zea mays subsp tunecata sturt - ngô bọc

2.2 ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT HỌC CÂY NGÔ

Ngô có thân khá chắc, có đường kính từ 2-4cm tùy thuộc vào giống,điều kiện sinh thái và chăm sóc Thân có chiều cao khoảng 1,5-4m Thân

chính của cây ngô bắt nguồn từ chồi mầm, từ thân chính phát sinh ra nhánhhay thân phụ từ các đốt dưới đất Số nhánh dao động từ 1-10 Thân ngôtrưởng thành gồm nhiều lóng nằm giữa các đốt và kết thúc bằng bông cờ Sốlóng và chiều dài lóng là chỉ tiêu quan trọng trong việc phân loại các giốngngô Lóng mang bắp có một rãnh dọc cho phép bắp bám và phát triển bìnhthường

Lá ngô thường có hình dải, gồm có bẹ lá ôm lấy thân, phiến lá dạng bản(dải) và thìa lìa nằm giữa bẹ và phiến Các giống khác nhau có sự thay đổi về

số, chiều dài, chiều rộng, độ dày, lông tơ, mà sắc, góc lá và gân lá Số lá - mộtđặc điểm khá ổn định có quan hệ chặt chẽ với số đốt và thời gian sinh trưởng

Ngô có hệ rễ chùm tiêu biểu cho bộ rễ các cây họ Hòa thảo Ngô có baloại rễ: rễ mầm, rễ đốt và rễ chân kiềng

Ngô là loại cây có hoa đơn tính cùng gốc Cơ quan sinh sản đực là bông

cờ nằm ở đỉnh cây, cơ quan sinh sản cái (bắp ngô) phát sinh từ chồi nách,nhưng chỉ có 1-3 chồi khoảng giữa thân tạo thành bắp Hoa đực xếp theo hoachùm gồm một trục chính và nhiều nhánh Hoa đực mọc thành bông nhỏ(bông chét hay gié) Mỗi bông nhỏ mang hai hoa, đôi khi một hoặc ba hoa.Mỗi hoa có 3 nhị, mỗi nhị mang một bao phấn hai ô, mỗi ô phấn chứakhoảng 1000 - 2500 hạt phấn Mỗi bông cờ cho khoảng 10-30 triệu hạt phấn.Hoa tung phấn rộ vào khoảng 8-10 giờ sáng và 14-16 giờ chiều Bắp ngô làcụm hoa cái hình bông, được bao bọc trong một số lớp lá, và được các lá nàybao chặt vào thân đến mức chúng không lộ ra cho đến khi xuất hiện các râungô màu hung vàng từ vòng lá vào cuối của bắp ngô Trên trục (lõi ngô) đínhhoa cái, hoa mọc từn đôi bông nhỏ Mỗi bông nhỏ có hai hoa nhưng một hoathoái hóa, chỉ một hoa phát triển thành hạt Chính giữa hoa cái là bầu hoa,trên bầu hoa có vòi nhụy và núm nhụy vươn dài thành râu Trên râu có nhiềulông tơ và chất tiết làm cho hạt phấn bám vào và dễ nẩy mầm Thời gian phunrâu thường sau tung phấn 1-5 ngày thùy thuộc vào giống và điều kiện tựnhiên Hiện tương tung phấn trước râu thường gặp nhiều ở điều kiện ViệtNam, gọi là tính nhị chín trước Ngược lại phun râu trước tung phấn gọi là

tính nhụy chín trước Ở điều kiện nước ta râu phun trong khoảng thời gian

5-12 ngày Trên một bắp, hoa cái gần cuống phun râu trước rồi tiến dần lên đỉnhbắp Trên một cây ngô, bắp trên thường phun râu trước bắp dưới 2-3 ngày

Các hạt ngô là các dạng quả thóc (dĩnh) gồm năm phần chính: vỏ, lớpalơron, phôi, nội nhũ và chân hạt Vỏ là một lớp màng mỏng bao xung quanhhạt Lớp alơron nằm dưới vỏ hạt, bao lấy nội và phôi Nội nhũ là phần chínhcủa hạt chứa các tế bào dự trữ chất dinh dưỡng Phôi ngô chiếm gần 1/3 thểtích của hạt và gồm các phần: ngù - phần ngăn cách giữa nội nhũ và phôi; lámầm, trụ dưới lá mầm, rễ mầm và chồi mầm Các hạt ngô có kích thước cỡhạt đậu Hà Lan, và bám chặt thành các hàng tương đối đều xung quanh mộtlõi trắng để tạo ra bắp ngô Mỗi bắp ngô dài khoảng 10 - 25 cm, chứa khoảng

200 - 400 hạt Các hạt có màu như ánh đen, xám xanh, đỏ, trắng và vàng

2.3 ỨNG DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ TRONG NGHIÊN CỨU ĐA

DẠNG DI TRUYỀN Ở NGÔ

2.3.1 Chỉ thị phân tử

Khi nghiên cứu đa dạng di truyền của thực vật thường sử dụng một sốchỉ thị phân tử như: RAPD (random ampilified polymorphic DNA), AFLP(amplified fragment length polymorphism), SSR (simple sequence repeat)

2.3.1.1 Đa hình các đoạn DNA được nhân lên ngẫu nhiên (RAPD)

Kỹ thuật RAPD sử dụng mồi đơn, có trình tự ngẫu nhiên Mồi là nhữngoligonucleotide có độ dài từ 9 đến 12 nucleotide, thường có hơn 60 % G+C đểđạt liên kết đủ mạnh Các mồi ngẫu nhiên này ngắn cho nên khả năng tìmđược điểm gắn là không quá khó khăn Kết quả của phản ứng RAPD sẽ tạo ranhiều đoạn DNA khác nhau về độ dài và trình tự Ưu điểm của phương phápRAPD là nhanh, không đòi hỏi việc phân lập và đọc trình tự, có thể phát hiệnnhiều locus cùng một lúc, giá thành thấp, đơn giản Mỗi mồi cung cấp số liệu

từ nhiều vị trí trong hệ gen, vì vậy, những đa hình hiếm giữa các mẫu có quan

hệ gần gũi có thể được phát hiện nhanh hơn với phân tích locus đơn Tuy

nhiên RAPD là chỉ thị trội nên không phân biệt được cá thể đồng hợp và dịhợp Bên cạnh đó, sự phát sinh đa hình giả ảnh hưởng lên sự thể hiện của cácđoạn RAPD do không chắc chắn các đoạn cùng kích thước từ hai mẫu DNAkhác nhau có thực sự được tạo ra từ cùng một vị trí trên hệ gen hay không Kỹthuật này đòi hỏi phải nhác lại nhiều lần để kiểm tra độ tin cậy

2.3.1.2 Đa hình các đoạn DNA nhân chọn lọc (AFLP)

Đây là một kỹ thuật chỉ thị phân tử dựa vào nguyên lý của PCR để nhâncác đoạn cắt hạn chế Kỹ thuật này bao gồm nhiều bước, trước tiên DNA của

bộ gen được cắt bằng enzyme hạn chế endonuclease thành những đoạn DNAkhác nhau Các đoạn DNA mang các đầu mút như nhau sẽ gắn vào các đoạnnối (adaptor) cùng loại và một hay một số nucleotide chọn lọc Đây là cácoligonucleotide đã biết trình tự, dùng để đánh dấu các đoạn DNA và có vai tròkhuôn đối với các cặp mồi PCR, chúng cho phép ta có thể nhân đồng thời tất

cả các đoạn DNA có đoạn nối giống nhau Sự nhân chọn lọc được thực hiệnkhi sử dụng các mồi có chứa một hay nhiều hơn các nucleotide chọn lọc.Những nucleotide này giúp cho các mồi nhận ra các đoạn phân cắt đặc hiệu

mà có trình tự tương xứng hoàn toàn Trình tự của mồi bổ sung với trình tựcủa đoạn nối cộng thêm các nucleotide chọn lọc ở đầu 3’ Bằng cách làmgiảm số băng tách rời đủ để nghiên cứu đa hình Ưu điểm của AFLP là có độ

đa hình cao, nhận dạng tới cá thể Thông qua đó có thể tìm được những chỉ thịliên kết rất chặt

2.3.1.3 Các đoạn DNA lặp lại đơn giản (SSR)

Simple sequence repeat (SSR) là một chỉ thị phân tử quan trọng trongnghiên cứu đa dạng di truyền ở lúa Trong genome của Eukaryota tồn tại rấtnhiều các trình tự lặp lại rải rác như satellite, minisatellites, microsatellites.Các đoạn lặp lại đơn giản (SSR) hay còn gọi là vi vệ tinh (microsatellites) lànhững đoạn DNA ngắn gồm một số cặp nu liên tiếp, mỗi đơn vị có chiều dài

từ 4 đến 6 cặp base, số lượng đơn vị lặp lại thay đổi từ 1 đến 40 đơn vị

Những đoạn SSR phân bố ở đầu và cuối tâm động nhiễm sắc thể (NST) có tácdụng bảo vệ và liên quan đến sự di truyền của NST

Kỹ thuật SSR dựa trên nguyên lý PCR dùng các cặp mồi đặc hiệu đểnhân các đoạn trình tự SSR Sự khác nhau trong cấu trúc đơn vị lặp lại dẫnđến sự thay đổi độ dài đoạn lặp lại được nhân lên và xác định khi chạy điện ditrên gel agarose hoặc gel polyacrylamide Kỹ thuật này được sử dụng rộng rãitrong nghiên cứu đa dạng di truyền trên nhiều đối tượng khác nhau SSR pháttriển và được sử dụng rộng rãi do nó có khả năng phát hiện số lượng lớn cácđoạn trình tự lặp lại ở tất cả các cơ thể bậc cao, nó có tiềm năng cho đa hìnhcao hơn và đơn giản hơn so với các chỉ thị phân tử khác SSR là chỉ thị đồngtrội vì vậy nó chứa đựng thông tin cao Tuy nhiên, nhược điểm của phươngpháp này là quá trình thiết kế mồi rất tốn kém do phải thiết kế mồi đặc hiệucho từng locus SSR khác nhau, có bao nhiêu locus SSR thì cần bấy nhiêu mồi

mà mỗi loại mồi lại chỉ đặc trưng cho một loài Việc đọc trình tự SSR cũnggặp nhiều khó khăn Vì vậy, chỉ có một số loài được quan tâm như người, lúa,ngô được thiết kế mồi SSR

Kỹ thuật này được ứng dụng trong chuẩn đoán những quần thể cách ly,chọn lọc gen trong những gen biến nạp, trong lập bản đồ gen, nhận dạng cácgiống cây trồng, đánh giá quan hệ di truyền và đa dạng ở nhiều loài cây

Vì những ưu điểm trên, chúng tôi sử dụng chỉ thị SSR để nghiên cứu đadạng di truyền nhằm xây dựng cặp lai ngô kháng bệnh mốc hồng

2.3.2 Nghiên cứu đa dạng di truyền của ngô

2.3.2.1 Nghiên cứu trên thế giới

Hiện nay có nhiều phương pháp để đánh giá đa dạng di truyền nhưSSR, RAPD, AFLP, SLP… Trong đó kỹ thuật SSR được sử dụng phổ biến và

có hiệu quả cho đánh giá đa dạng di truyền nguồn gen

Yao và đồng tác giả (2007) đã nghiên cứu đa dạng nguồn gen của 54giống ngô ở phía bắc của Trung Quốc sử dụng 42 chỉ thị SSR đã tìm ra được

256 alen Mỗi một chỉ thị cho dao động từ 2 đến 9 alen, số alen trung bình là6,1 alen

Legesse và đồng tác giả (2007) tiến hành đánh giá đa dạng của cácgiống ngô Châu Phi Số lượng giống đánh giá là 56 giống với 27 chỉ thị SSR.Kết quả thu được 104 alen với mức độ trung bình 3,85 alen trên một locus, hệ

số PIC trung bình là 0,58

Sharma và đồng tác giả (2007) đã tiến hành nghiên cứu đánh giá đadạng di truyền của 48 giống ngô ở phía đông bắc dãy Himalayan sử dụng 42chỉ thị SSR Nghiên cứu cho thấy có chỉ thị cho 13 alen, hệ số PIC là 0,6

Bracco và đồng tác giả (2009) sử dụng 10 chỉ thị phân tử để đánh giácác giống ngô ở phía đông bắc Argentina Nghiên cứu tìm ra tổng số 65 alen,trung bình là 7,22 alen trên 1 locus, hệ số PIC là 0,37

2.3.2.2 Nghiên cứu ở Việt Nam

Ở Việt Nam việc đánh giá đa dạng các nguồn gen cây ngô cũng đượccác nhà khoa học quan tâm

Lê Thị Minh Thảo và đồng tác giả (2014) đánh giá đa dạng di truyềntrên 24 giống ngô nếp tự phối sử dụng 19 chỉ thị SSR thu được 75 alen Hệ sốPIC dao động trong phạm vi từ 0,36 đến 0,81 Số alen trung bình là 4alen/locus

Phan Xuân Hào (2013) đánh giá đa dạng di truyền trên 70 dòng ngômới dựa trên 35 chỉ thị phân tử SSR Kết quả nghiên cứu chỉ ra hệ số tươngđồng di truyền dao động từ 0,23 đến 1,00 Khoảng cách di truyền giữa cácdòng tương đối lớn cho thấy sự khác biệt nhau về vật chất di truyền

2.4 ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN VÀ ĐA DẠNG NGUỒN GEN CÂY NGÔ

Về mặt di truyền, bộ gen của cây ngô có 2n = 20 (n=10) Chiều dài tổngcộng của các nhiễm sắc thể là 1.500 cM Một số nhiễm sắc thể của ngô có cái

mà người ta gọi là "bướu nhiễm sắc thể": các vùng tạp sắc lặp đi lặp lại caovới vết màu sẫm Mỗi bướu riêng biệt là đa hình trong số các giống của cảngô lẫn cỏ ngô Barbara McClintock đã sử dụng các bướu này để chứng minhthuyết transposon của bà về các "gen thay đổi đột ngột", và với công trình này

bà đã đoạt giải Nobel năm 1983 trong lĩnh vực sinh lý học và y học Ngô vẫn

còn là sinh vật mẫu quan trọng cho di truyền học và sinh học phát triển ngàynay.

Tại Hoa Kỳ có một kho trung tâm các đột biến ở ngô, The Maize Genetics Cooperation - Stock Center, do Cục Nghiên cứu Nông nghiệp của Bộ Nông

của Đại học Illinois tại Urbana-Champaign Tổng cộng bộ sưu tập có gần80.000 mẫu Bộ sưu tập này bao gồm vài trăm gen đã đặt tên, cộng với các tổhợp gen bổ sung và các biến thể có thể di truyền khác Ở đây có khoảng 1.000sai lệch nhiễm sắc thể (chẳng hạn các hoán vị hay nghịch đảo) và các nguồnvới số nhiễm sắc thể bất thường (như các dạng tứ bội) Dữ liệu di truyền miêu

tả các nguồn đột biến ở ngô cũng như vô số các dữ liệu khác về di truyền họccủa ngô có thể truy cập tại MaizeGDB (Maize Genetics and GenomicsDatabase: Cơ sở dữ liệu di truyền học và bộ gen ngô)

Năm 2005, Quỹ Khoa học Quốc gia Hoa Kỳ (NSF), Bộ Nông nghiệp Hoa

Kỳ và Bộ Năng lượng Hoa Kỳ (DOE) đã xác định trình tự của ngô Việc giải

mã trình tự bộ gen ngô là khá khó khăn do kích thước lớn và cách sắp xếpphức tạp Bộ gen ngô có 50.000-60.000 gen nằm rải rác trong 2,5 tỷ bazơ (cácphân tử tạo ra ADN) trên 10 nhiễm sắc thể (Jeff Bennetzen et al, 2009)

2.5 VAI TRÒ CỦA CHỌN CẶP LAI TRONG CHỌN TẠO GIỐNG

Chọn cặp lai bố mẹ có vai trò rất quan trọng trong tạo giống cây trồng,

nó quyết định sự thành công của công tác lai Cặp bố mẹ được chọn phải đảmbảo có khả năng kết hợp, khả năng tạo ra thế hệ con lai tốt, khả năng truyềnđạt tính trạng tốt của bố mẹ vào con lai

Việc chọn cặp lai bố mẹ cần theo những nguyên tắc sau:

Nguyên tắc khác nhau về kiểu sinh thái địa lý: do kiểu hình của mộtdạng thực vật là kết quả tương tác giữa kiểu gen và môi trường Các giống vàcác dạng thực vật trong quá trình chọn lọc tự nhiên hay chọn lọc nhân tạo

được hình thành, thích nghi với một điều kiện khí hậu, đất đai nhất định Bất

cứ cây trồng nào trên trái đất cũng có nhiều giống và dạng được hình thànhtrong các điều kiện sinh thái, địa lý khác nhau Khi chọn không nên chỉ dựavào loại hình sinh thái vì có khi xa nhau về điều kiện địa lý nhưng lại cùngloại hình sinh thái Khi chọn loại hình sinh thái nên chọn giống địa phương vì

nó có khả năng thích nghi cao, ổn định năng suất và khả năng truyền đạt ditruyền mạnh Điều kiện sinh thái càng phức tạp, càng khắc nghiệt thì khi sửdụng giống địa phương làm mẹ sẽ dễ dàng tạo ra các giống có tính thích ứngcao Muốn thành công trong chọn bố mẹ về loại hình sinh thái cần: nguồn vậtliệu sinh thái phong phú, bố mẹ cần được xác định chính xác, số lượng tổ hợplai lớn và sử dụng phương pháp chọn lọc cá thể chuẩn xác

Nguyên tắc khác nhau về các yếu tố cấu thành năng suất: nếu xét năngsuất của một cây trồng thì năng suất trên một đơn vị diện tích do năng suấttừng cá thể và số cá thể trên đơn vị diện tích đó quyết định Năng suất cá thểcao và trồng được nhiều cá thể trên đơn vị diện tích là mục tiêu phấn đấu củacác nhà chọn giống Năng suất cá thể được tạo nên bởi các yếu tố cấu thànhnăng suất Khi chọn bố mẹ nhằm nâng cao năng suất ở các thế hệ lai thì bố và

mẹ phải có sự khác nhau về các yếu tố cấu thành năng suất Sự khác nhau trêncần có khả năng bổ sung lẫn nhau, phối hợp với nhau để tạo ra giống mớihoàn chỉnh hơn

Chọn cặp lai bố mẹ căn cứ vào giai đoạn phát dục: do nhu cầu của sảnxuất mà đòi hỏi phải tạo ra các giống có thời gian sinh trưởng khác nhau từngắn, trung bình đến dài Để tăng vụ, tránh các điều kiện thời tiết bất lợi gâythiệt hại cho mùa màng, cần có các giống ngắn đến cực ngắn, song năng suấtcần đạt yêu cầu Để phát huy tối đa tự do tổ hợp của các kiểu gen quyết địnhcác pha sinh trưởng của cây nhằm tạo ra giống mới có thời gian sinh trưởngtheo ý muốn thì bố và mẹ dùng trong phép lai cần có cấu trúc, thời gian cácgiai đoạn sinh trưởng khác nhau Tương tự như nguyên tắc khác nhau về các

yếu tố cấu thành năng suất, người ta có thể tạo ra các giống có thời gian sinhtrưởng ngắn hơn từ hai dạng bố mẹ có cùng thời gian sinh trưởng nếu các giaiđoạn sinh trưởng làm nên thời gian sinh trưởng của bố mẹ khác nhau

Nguyên tắc khác nhau về tính chống chịu: các giống khác nhau có phổchống chịu khác nhau Bố mẹ khác nhau sẽ bổ khuyết cho nhau về khả năngchống chịu Cây trồng vốn có tính chống chịu sâu bệnh nhờ thừa hưởng tính

di truyền của tổ tiên chúng, song tính chống chịu này đã yếu đi nhiều do có sựbảo vệ của con người trong quá trình canh tác Chọn tạo ra các giống vừa chonăng suất cao, vừa chống chịu tốt với các loài sâu bệnh gây hại là mục tiêucủa bất kì chương trình chọn tạo giống nào Mặt khác, ở mỗi vùng sinh tháiđặc thù thì tuy cùng là một loại bệnh nhưng ở mỗi vùng có các giống khácnhau Vì thế một giống có thể hoàn toàn kháng bệnh ở vùng này nhưng khichuyển sang vùng khác lại bị nhiễm bệnh Một số cây có phổ kháng sâu bệnhrộng, cùng lúc có thể chống được nhiều nòi sinh lý khác nhau Khi chọn cácdạng bố mẹ cần chú ý sự khác nhau về tính kháng bệnh ngang để tổ hợp đượcphổ kháng sâu bệnh rộng vào giống tương lai

Chọn cặp bố mẹ cần phải bổ sung cho nhau những tính trạng cần thiết,đặc biệt là tính trạng năng suất, chất lượng và khả năng chống chịu Giốngcây trồng là sản phẩm của toàn thể loài người Một giống cây trồng tốt sẽđược con người nhân rộng ra nhiều vùng địa lý khác nhau Nhờ đặc điểm này

mà một số giống tốt được tạo ra không có bó hẹp trong một khu vực Nhậpnội giống cây trồng các tính trạng tốt là phương pháp nhanh đưa giống vàosản xuất Tuy nhiên, các giống cây mới tạo ra khi di chuyển từ vùng này sangvùng khác tỏ ra còn khiếm khuyết ở một số sinh trạng quan trọng nào đó nhưkém chịu rét, chống đổ không tốt, chất lượng chưa cao Nói chung, các giốngmới được tạo ra theo các phương pháp tạo giống hiện đại đều là các kiểu gentốt, nhưng chúng chỉ còn thiếu một số tính trạng mà nếu được bổ sung thì sẽ

là một giống hoàn chỉnh

Khi lai xa, cần lưu ý chọn cặp lai bố mẹ thường là cây dại chiếm ưu thếnên chọn cây trồng làm mẹ

Trong chọn cặp lai bố mẹ đối với cây có củ, cần quan tâm đến động tháisinh trưởng thân lá, động thái khác nhau cho kết quả khác nhau

Như vậy, để xây dựng cặp lai bố mẹ cần tuân thủ nguyên tắc khác nhau

về sinh thái - địa lý, năng suất, khả năng chống chịu, giai đoạn ra hoa lànhững đặc điểm nông học của giống Bản chất sự khác nhau này chính là khácnhau về kiểu gen Những giống có hệ số tương đồng di truyền càng thấp thì

sự khác nhau về hình thái cũng như đặc điểm sinh lý càng khác nhau Nghiêncứu đa dạng di truyền là một phương pháp cho kết quả chính xác trong thờigian ngắn và kết quả có thể kết hợp với đặc điểm nông học của các giống lúa

để xây dựng cặp lai phù hợp

PHẦN III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 VẬT LIỆU

3.1.1 Mẫu ngô nghiên cứu và mồi SSR

Nguyên liệu thực vật: 48 giống ngô của tập đoàn nghiên cứu do Việnnghiên cứu Ngô cung câp

Bảng 3.1 Các giống ngô sử dụng trong nghiên cứu

Trình tự 10 cặp mồi SSR sử dụng để phân tích được thể hiện trên bảng

3.2 (Robertson - Hoyt et al., 2006; Chen et al., 2012).

Bảng 3.2 Các mồi SSR sử dụng trong nghiên cứu

1 Umc1594 CACGCAACCCACTCATCACTC CTCACCGCTCTGCTCTGCTATC

2 Umc1524 GCCGTCAACGGGCTTAAACT GCCTCCAGCTCTCTCGTCTCTT

3 Umc1562 TAGCTGCCCCTCTTCCGTCT GTCGTGGCGTAGAGACTAGGGAT

4 Umc1935 ATTGGAAGGATCTGCGTGAC CAGCTGGTGGACTGCATCTA

5 Phi333597 CAACGGAAGTGGCTGTAGAGTTTT ACAGAGCATGTCAGGTATTTGCAG

6 Umc1908 GAAAGTCGATCGAGAGACCCTG CCCTCTCTTCACCCCTTCCTT

7 Umc 1060 CAGGAAAACGAAAACCCAGA CTACGCGGGTCTCATCTCAT

8 Umc1511 TCAGTGCTTTCATTGTAACGA ATAAACATCTTGCCAGCAAA

9 Umc1489 TTAATAGCTACCCGCAACCAAGAA CTGAGCCACAGTACCTTGCTGTT

10 Umc1085 TACTGTGATGTGGCGGTGCT GCCACCTCTCACAGGTCTCAC

Hóa chất thực hiện phản ứng PCR bao gồm buffer PCR 1X của Quiagenhoặc Invitrogen; dNTPs (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) của Fermentas; mồi,Taq polymerase của Fermentas, H2O được khử ion

Hóa chất điện di bao gồm các loại như: Bromophenol blue, ethidiumbromide, agarose, polyacrylamide, methylene bis-acrylamide, APS, TEMED,urea, Tris base, boric acid, EDTA, HCl, marker 1 kb; marker 100 bp của hãngFermentas

Thiết bị

Máy điện di gel agarose Msmidi (Cleaver Scientific, Mỹ)

Máy điện di gel polyacrylamide (Bio - Rad, Mỹ)

Máy PCR PTC-100 (MJ Research Inc, Mỹ)

Máy ly tâm thường và lạnh