Nghiên cứu đa dạng di truyền tập đoàn 48 giống ngô địa phương bằng chỉ thị SSR

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Vũ Văn Hiến Lớp: Công nghệ sinh học k13 LỜI CẢM ƠN Hoàn thành chương trình thực tập tốt nghiệp này, em xin gửi lời cảm ơn trân trọng đến thầy, TS Nguyễn Văn Huấn, trưởng Bộ môn Công nghệ sinh học, Viện Sinh – Nông, Trường Đại học Hải Phòng cô, TS Lê Thị Bích Thủy, Trưởng phòng Di truyền tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm khoa học Công nghệ Việt Nam tận tình hướng dẫn, dạy em suốt thời gian thực tập, làm thí nghiệm, phân tích số liệu viết Báo cáo này; Xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến thầy, cô Viện Sinh – Nông, Trường Đại học Hải Phòng dạy dỗ, truyền đạt cho em kiến thức bản, chuyên môn sâu rộng thuộc lĩnh vực công nghệ sinh học; Xin gửi lời cảm ơn chân thành đến anh, chị công tác Phòng Di truyền tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm khoa học Công nghệ Việt Nam hướng dẫn, dạy, tạo điều kiện cho em thực tập, làm thí nghiệm, giúp em có kết tốt cho Báo cáo này; Xin gửi lời cảm ơn đến bạn lớp CNSH K13, Viện Sinh – Nông, Trường Đại học Hải Phòng tích cực trao đổi, giúp đỡ sống học tập suốt thời gian qua mái trường Đại học Hải Phòng; Cuối cùng, xin ghi lòng, tạc dạ, đời đời nhớ ơn bố mẹ gia đình công sinh thành, dưỡng dục mà quan tâm, động viên, lo lắng, trợ giúp đầy đủ tinh thần vật chất để hoàn thành tốt chương trình học đại học Hải Phòng, tháng năm 2016 VŨ VĂN HIẾN ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Vũ Văn Hiến Lớp: Công nghệ sinh học k13 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT AFLP : Amplified fragment length polymorphism cM : Centimorgan CTAB : Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide DNA : Deoxyribonucleic Acid dNTP : Deoxynucleoside triphosphate EDTA : Ethylenediaminetetraacetic acid PCR : Polymerase Chain Reaction RAPD : Random Amplified Polymorphism DNA RFLP : Restriction Flagment Polymorphism DNA SSR : Simple Sequence Repeats TBE : Tris- Boric acid- EDTA EthBr : Ethidium bromide TE : Tris – EDTA Tris : Trioxymetylaminometan ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Vũ Văn Hiến Lớp: Công nghệ sinh học k13 MỤC LỤC MỤC LỤC PHẦN I: MỞ ĐẦU 1 ĐẶT VẤN ĐỀ .8 1.2 MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU 1.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU .10 1.4 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU .10 PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 11 2.1 NGUỒN GỐC, XUẤT XỨ VÀ PHÂN LOẠI CÂY NGÔ 11 2.2 ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT HỌC CÂY NGÔ 11 2.3 ỨNG DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ TRONG NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN Ở NGÔ 13 2.3.1 Chỉ thị phân tử 13 2.3.2 Nghiên cứu đa dạng di truyền ngô 15 2.4 ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN VÀ ĐA DẠNG NGUỒN GEN CÂY NGÔ 16 2.5 VAI TRÒ CỦA CHỌN CẶP LAI TRONG CHỌN TẠO GIỐNG 17 PHẦN III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 3.1 VẬT LIỆU 21 3.1.1 Mẫu ngô nghiên cứu mồi SSR 21 Bảng 3.1 Các giống ngô sử dụng nghiên cứu 21 Bảng 3.2 Các mồi SSR sử dụng nghiên cứu 22 3.1.2 Hóa chất thiết bị .22 3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 3.2.1 Phương pháp tách chiết DNA genome 23 3.2.2 Phương pháp chạy PCR với mồi SSR 25 Bảng 3.3 Hỗn hợp phản ứng PCR với mồi SSR .25 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Vũ Văn Hiến Lớp: Công nghệ sinh học k13 3.2.3 Phương pháp điện di gel agarose 26 3.2.4 Phương pháp kiểm tra sản phẩm PCR gel polyacrylamide 27 2.2.3 Phương pháp phân tích số liệu .29 PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .30 4.1 KẾT QUẢ TÁCH DNA GENOME .30 Hình 4.1 Điện di DNA genome đại diện số mẫu ngô 31 4.2 PHÂN TÍCH ĐA HÌNH DNA BẰNG KỸ THUẬT SSR 31 Hình 4.2 Ảnh điện di gel polyacrylamide sản phẩm PCR cặp mồi Phi333597 với 24 giống ngô, M: marker 100 bp (Biolabs) .31 Tên giống: Số 51-giống 09N03, 52-09N05, 53- CML161, 54-DF18, .31 55- DF18C, 56- H02, 57- H042, 58- H1, 59-H12, 60- H14, 61- H31, 62- H35, 63-H46, 64H53, 65-H56, 66- H63, 67- H71, 68- H76, 69- H81, 70- H82, 31 71- H84, 72- H99, 73- H145 31 Hình 4.3 Ảnh điện di gel polyacrylamide sản phẩm PCR cặp mồi Umc1562 với 24 giống ngô, M: marker 100 bp (Biolabs) .32 Tên giống: Số 51- giống 09N03, 52- 09N05, 53- CML161, 54- DF18, 32 55- DF18C, 56- H02, 57- H042, 58- H1, 59- H12, 60- H14, 61- H31, 32 62- H35, 63- H46, 64- H53, 65- H56, 66- H63, 67- H71, 68- H76, 69- H81, 70-H82, 71H84, 72- H99, 73-H145, 35-Cây kháng, 36- Cây mẫn cảm .32 Hình 4.4 Ảnh điện di gel polyacrylamide sản phẩm PCR cặp mồi Umc 1249 với 24 giống ngô, M: marker 100 bp (Biolabs) .32 Tên giống : Số 51 -giống 09N03, 52- 09N05, 53- CML161, 54- DF18, 55- DF18C, 56H02, 57- H042, 58- H1, 59- H12, 60-H14, 61- H31, 62- H35, 63- H46, 64- H53, 65- H56, 66- H63, 67- H71, 68- H76, 69- H81, 70- H82, 71- H84, 72- H99, 73- H145, 35- Cây kháng, 36-Cây mẫn cảm 32 Hình 4.5 Ảnh điện di gel polyacrylamide sản phẩm PCR cặp mồi Umc1196 với 24 giống ngô, M: marker 100 bp (Biolabs) .33 Tên giống: Số 51-giống 09N03, 52- 09N05, 53- CML161, 54-DF18, 55-DF18C, 56-H02, 57- H042, 58-H1, 59- H12, 60- H14, 61- H31, 62- H35, 63- H46, 64- H53, 65- H56, 66H63, 67- H71, 68- H76, 69- H81, 70- H82, 71- H84, 72- H99, 73- H145, 35- Cây kháng, 36- Cây mẫn cảm 33 Hình 4.7 Ảnh điện di gel polyacrylamide sản phẩm PCR cặp mồi Umc1908 với 24 giống ngô, M: marker 100 bp (Biolabs) .34 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Vũ Văn Hiến Lớp: Công nghệ sinh học k13 Tên giống: Số 51-giống 09N03, 52- 09N05, 53- CML161, 54-DF18, 55- DF18C, 56- H02, 57- H042, 58- H1, 59- H12, 60- H14, 61- H31, 62 H35, 63- H46, 64- H53, 65- H56, 66H63, 67- H71, 68- H76, 69- H81, 70- H82, 71- H84, 72- H99, 73- H145, 35- Cây kháng, 36- Cây mẫn cảm 34 4.3 HỆ SỐ PIC TRÊN CÁC MỒI NGHIÊN CỨU 34 Bảng 4.1 Mức độ đa hình 10 mồi SSR phân tích 48 giống ngô 35 4.4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA CÁC GIỐNG NGÔ .36 Hình 4.8 Biểu đồ quan hệ di truyền 48 giống ngô nghiên cứu .37 4.5 LỰA CHỌN CẶP LAI PHỤC VỤ CHO VIỆC CHỌN TẠO GIỐNG NGÔ KHÁNG BỆNH MỐC HỒNG 39 Bảng 4.2 Hệ số tương đồng di truyền giống ngô tổ hợp lai 40 V KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41 5.1 KẾT LUẬN 41 5.2 KIẾN NGHỊ 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO 42 44 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Vũ Văn Hiến Lớp: Công nghệ sinh học k13 DANH MỤC BẢNG BIỂU HÌNH VẼ Bảng 3.1 Các giống ngô sử dụng nghiên cứu Error: Reference source not found Bảng 3.2 10 mồi SSR sử dụng nghiên cứu Error: Reference source not found Bảng 3.3 Hỗn hợp phản ứng PCR với mồi SSR Error: Reference source not found Bảng 4.1 Mức độ đa hình 10 mồi SSR phân tích 48 giống ngô Error: Reference source not found Bảng 4.2 Hệ số tương đồng di truyền giống ngô tổ hợp lai Error: Reference source not found ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Vũ Văn Hiến Lớp: Công nghệ sinh học k13 DANH MỤC HÌNH VẼ Hình 4.1 Điện di DNA genome đại diện số mẫu ngô Error: Reference source not found Hình 4.2 Ảnh điện di gel polyacrylamide sản phẩm PCR cặp mồi Phi333597 với 24 giống ngô Error: Reference source not found Hình 4.3 Ảnh điện di gel polyacrylamide sản phẩm PCR cặp mồi Umc1562 với 24 giống ngô Error: Reference source not found Hình 4.4 Ảnh điện di gel polyacrylamide sản phẩm PCR cặp mồi Umc 1249 với 24 giống ngô Error: Reference source not found Hình 4.5 Ảnh điện di gel polyacrylamide sản phẩm PCR cặp mồi Umc1196 với 24 giống ngô Error: Reference source not found Hình 4.7 Ảnh điện di gel polyacrylamide sản phẩm PCR cặp mồi Umc1908 với 24 giống ngô Error: Reference source not found Hình 4.8 Biểu đồ quan hệ di truyền 48 giống ngô nghiên cứu Error: Reference source not found ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Vũ Văn Hiến Lớp: Công nghệ sinh học k13 PHẦN I: MỞ ĐẦU 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Cây ngô có tên khoa học Zea mays L Ngô gieo trồng rộng khắp giới với sản lượng hàng năm cao lương thực Hoa Kỳ nước có sản lượng ngô lớn giới, tiếp đến nước Trung Quốc, Brasil, Mexico, Argentina, Ấn Độ, Pháp, Indonesia, Nam Phi Italia Sản lượng toàn giới năm 2003 600 triệu - lúa lúa mì Năm 2005, gần 33 triệu ngô gieo trồng khắp giới, với sản lượng 692 triệu Đến năm 2009, diện tích trồng ngô giới đạt khoảng 159,5 triệu ha, suất bình quân 51,3 tạ/ha, sản lượng 817,1 triệu Ở Việt Nam, ngô lương thực quan trọng thứ hai sau lúa màu quan trọng trồng nhiều vùng sinh thái khác nhau, đa dạng mùa vụ gieo trồng hệ thống canh tác Cây ngô không cung cấp lương thực cho người, vật nuôi mà trồng xóa đói giảm nghèo tỉnh có điều kiện kinh tế khó khăn Sản xuất ngô nước qua năm không ngừng tăng diện tích, suất, sản lượng: năm 2001 tổng diện tích ngô 730.000 ha, đến năm 2005 tăng triệu ha; năm 2010, diện tích ngô nước 1126,9 nghìn ha, suất 40,9 tạ/ha, sản lượng 4,6 triệu Song sản lượng ngô nước chưa đáp ứng đủ nhu cầu nước, tháng đầu năm 2009, nước ta nhập 0,8 triệu ngô (Cục Trồng Trọt, 2009) Vì vậy, việc nghiên cứu tạo giống ngô có suất cao nhiệm vụ quan trọng cấp bách Hiện nay, với phát triển nhanh chóng thị phân tử cung cấp công cụ hữu ích cho việc đánh giá đa dạng di truyền mức ADN đối tượng thực vật (Melcihnger and Gumber, 1988) Các thị RFLP, AFLP, ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Vũ Văn Hiến Lớp: Công nghệ sinh học k13 SSR, STS, SCAR, RAPD, thị sử dụng rộng rãi nghiên cứu di truyền giống trồng nói chung ngô nói riêng Các phương pháp khắc phục nhược điểm phương pháp chọn giống truyền thống đánh giá hệ gen trồng thị dựa sở kỹ thuật PCR RAPD, SCAR, SSR, STS hiệu thuận lợi so với RFLP đơn giản cần lượng nhỏ ADN tách từ mẫu mô sử dụng cho phân tích Do vậy, việc chọn lọc tiến hành từ giai đoạn sớm Trong đó, SSR xem dấu vân tay ADN kiểu gen ngô mức độ đa hình cao tìm thấy (Smith et al, 1997) Ngoài việc đánh giá phân loại tập đoàn dựa đặc tính hình thái gần người ta sử dụng số kỹ thuật sinh học phân tử nghiên cứu đa dạng di truyền tập đoàn ngô cho kết tốt, có nhiều hứa hẹn: SSR, AFLP, đa hình nucleotide đơn (SNP- single nucleotide polymorphisms), nhân đa hình vùng quan tâm (TRAP- target region amplification polymorphism), trình tự gen mục tiêu (EST- expressed sequence tags) Để khai thác nguồn tài nguyên di truyền ngô có hiệu quả, trước hết phải nghiên cứu đánh giá đa dạng mối quan hệ di truyền dòng giống tập đoàn Trên sở xác định nguồn thực làm bố mẹ phục vụ tốt cho chương trình lai tạo giống Chính vậy, thực đề tài “Nghiên cứu đa dạng di truyền tập đoàn 48 giống ngô địa phương thị SSR” nhằm mục đích lựa chọn cặp lai bố mẹ phục vụ cho việc chọn tạo giống ngô lai kháng bệnh mốc hồng 1.2 MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU Đánh giá mức độ đa dạng di truyền 48 giống ngô thị SSR nhằm lựa chọn cặp lai bố mẹ phục vụ cho việc chọn tạo giống ngô lai kháng bệnh mốc hồng ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Vũ Văn Hiến Lớp: Công nghệ sinh học k13 1.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU - Phân tích tập đoàn ngô địa phương Việt Nam với 10 thị SSR - Đánh giá đa dạng di truyền tập đoàn 48 giống ngô địa phương Việt Nam 1.4 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU - Thời gian: từ tháng 12/2015 - tháng 5/2016 - Địa điểm: Đề tài thực phòng Di truyền tế bào thực vật Viện Công nghệ sinh học - Viện Khoa học công nghệ Việt Nam ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Vũ Văn Hiến Lớp: Công nghệ sinh học k13 PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 KẾT QUẢ TÁCH DNA GENOME DNA nguyên liệu ban đầu cho hầu hết kỹ thuật sinh học phân tử, cụ thể thực nghiệm công nghệ gen ứng dụng nghiên cứu đa dạng di truyền Tách chiết DNA tổng số thành công coi khâu định tính xác nghiên cứu tiếp DNA genome tách chiết cần đảm bảo độ tinh độ nguyên vẹn cấu trúc, không lẫn RNA, protein hay tạp chất khác Trong nghiên cứu này, chọn phương pháp CTAB Saghai Maroof cộng (1984) có cải tiến để tách chiết DNA genome từ giống lúa nghiên cứu Nguyên lý phương pháp sử dụng chất CTAB, chất có khả hòa tan chất giải phóng từ tế bào sau màng chúng bị phá vỡ CTAB khả hòa tan đường, thành phần có nhiều mô thực vật, loại đường khỏi dịch chiết tách DNA Sau đó, tiến hành biến tính protein phenol choloroform để loại bỏ protein chứa dịch tách, loại bỏ RNA nhờ RNase sau kết tủa DNA cồn Tủa sau thu hòa tan lại dung dịch TE để sử dụng cho nghiên cứu DNA genome thu sau tách chiết tiến hành kiểm tra chất lượng DNA phương pháp đo OD bước sóng 260 280 nm để xác định độ tinh nồng độ DNA, pha loãng để đạt nồng độ 25 ng/μl, điện di gel agarose % Tỉ lệ OD 260 nm /OD280 nm nằm khoảng 1,8 - 2,0 Điện di DNA genome 48 mẫu ngô cho thấy băng sáng, gọn, sắc nét, không tạo dải sáng mờ dấu hiệu đứt gẫy DNA lẫn RNA (Hình 1) Như vậy, khẳng định DNA không bị đứt gẫy, có độ tinh cao, đủ tiêu chuẩn dùng cho phản ứng PCR ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Vũ Văn Hiến Lớp: Công nghệ sinh học k13 Hình 4.1 Điện di DNA genome đại diện số mẫu ngô (số 1-25 ảnh tương ứng với giống có thứ tự bảng từ mẫu 1-25) 4.2 PHÂN TÍCH ĐA HÌNH DNA BẰNG KỸ THUẬT SSR DNA dòng ngô tách chiết với độ nguyên vẹn tinh cao đạt yêu cầu cho phản ứng PCR với cặp mồi SSR Sản phẩm PCR-SSR chạy gel polyacrylamide 5%, cố định acid acetic nhuộm bạc Kết phân tích đa hình cho thấy 10 mồi phân tích cho đa hình Sản phẩm điện di gel polyacrilamide mồi SSR thể hình 4.2 đến 4.7 Hình 4.2 Ảnh điện di gel polyacrylamide sản phẩm PCR cặp mồi Phi333597 với 24 giống ngô, M: marker 100 bp (Biolabs) Tên giống: Số 51-giống 09N03, 52-09N05, 53- CML161, 54-DF18, 55- DF18C, 56- H02, 57- H042, 58- H1, 59-H12, 60- H14, 61- H31, 62- H35, 63-H46, 64-H53, 65-H56, 66- H63, 67- H71, 68- H76, 69- H81, 70- H82, 71- H84, 72- H99, 73- H145 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Vũ Văn Hiến Lớp: Công nghệ sinh học k13 Hình 4.3 Ảnh điện di gel polyacrylamide sản phẩm PCR cặp mồi Umc1562 với 24 giống ngô, M: marker 100 bp (Biolabs) Tên giống: Số 51- giống 09N03, 52- 09N05, 53- CML161, 54- DF18, 55- DF18C, 56- H02, 57- H042, 58- H1, 59- H12, 60- H14, 61- H31, 62- H35, 63- H46, 64- H53, 65- H56, 66- H63, 67- H71, 68- H76, 69- H81, 70-H82, 71- H84, 72- H99, 73-H145, 35-Cây kháng, 36- Cây mẫn cảm Hình 4.4 Ảnh điện di gel polyacrylamide sản phẩm PCR cặp mồi Umc 1249 với 24 giống ngô, M: marker 100 bp (Biolabs) Tên giống : Số 51 -giống 09N03, 52- 09N05, 53- CML161, 54- DF18, 55DF18C, 56- H02, 57- H042, 58- H1, 59- H12, 60-H14, 61- H31, 62- H35, 63- H46, 64- H53, 65- H56, 66- H63, 67- H71, 68- H76, 69- H81, 70H82, 71- H84, 72- H99, 73- H145, 35- Cây kháng, 36-Cây mẫn cảm ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP M Vũ Văn Hiến Lớp: Công nghệ sinh học k13 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 35 36 Hình 4.5 Ảnh điện di gel polyacrylamide sản phẩm PCR cặp mồi Umc1196 với 24 giống ngô, M: marker 100 bp (Biolabs) Tên giống: Số 51-giống 09N03, 52- 09N05, 53- CML161, 54-DF18, 55DF18C, 56-H02, 57- H042, 58-H1, 59- H12, 60- H14, 61- H31, 62- H35, 63- H46, 64- H53, 65- H56, 66- H63, 67- H71, 68- H76, 69- H81, 70H82, 71- H84, 72- H99, 73- H145, 35- Cây kháng, 36- Cây mẫn cảm M 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 35 36 Hình 4.6 Ảnh điện di gel polyacrylamide sản phẩm PCR cặp mồi Umc1060 với 24 giống ngô, M: marker 100 bp (Biolabs) Tên giống: số 51-giống 09N03, 52- 09N05, 53- CML161, 54- DF18, 55DF18C, 56- H02, 57- H042, 58- H1, 59- H12, 60- H14, 61- H31, 62- H35, 63- H46, 64- H53, 65- H56, 66- H63, 67- H71, 68- H76, 69- H81, 70- H82, 71- H84, 72- H99, 73- H145, 35- Cây kháng, 36- Cây mẫn cảm ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP M Vũ Văn Hiến 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 Lớp: Công nghệ sinh học k13 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 35 36 Hình 4.7 Ảnh điện di gel polyacrylamide sản phẩm PCR cặp mồi Umc1908 với 24 giống ngô, M: marker 100 bp (Biolabs) Tên giống: Số 51-giống 09N03, 52- 09N05, 53- CML161, 54-DF18, 55DF18C, 56- H02, 57- H042, 58- H1, 59- H12, 60- H14, 61- H31, 62 H35, 63- H46, 64- H53, 65- H56, 66- H63, 67- H71, 68- H76, 69- H81, 70H82, 71- H84, 72- H99, 73- H145, 35- Cây kháng, 36- Cây mẫn cảm 4.3 HỆ SỐ PIC TRÊN CÁC MỒI NGHIÊN CỨU Theo Smith cộng (1997), hệ số PIC (Polymorphic Information Content) coi thước đo tính đa dạng di truyền allen locus Còn theo Weir cho rằng, giá trị PIC hiểu đa dạng di truyền locus gen nghiên cứu Dựa kết phân tích hệ số PIC thị phân tử đánh giá mức độ phức tạp đối tượng nghiên cứu (số allen locus) mức độ đa dạng di truyền đối tượng (Pan et al 2010) Trong thí nghiệm này, sử dụng 10 mồi SSR cho đa hình để phân tích đa dạng di truyền 48 giống ngô tập đoàn, hệ số PIC số allen thị phân tử nghiên cứu thể bảng 4.1 Vũ Văn Hiến ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Lớp: Công nghệ sinh học k13 Bảng 4.1 Mức độ đa hình 10 mồi SSR phân tích 48 giống ngô TT Tên mồi Số Giá trị Umc1594 Umc1249 Umc1524 Umc1562 Umc1935 alen PIC 0,7286 0,5783 0,7153 0,7648 0,6665 TT 10 Tên mồi Số Giá trị Phi333597 Umc1908 Umc1196 Umc1060 Umc1511 alen PIC 0,7272 0,6131 0,8088 0,6450 0,7337 Khi phân tích độ đa hình cặp mồi thu nhận tổng số 42 alen Số alen cặp mồi dao động từ đến alen, giá trị trung bình 4,2 alen/ locus Trong cặp mồi Umc1562 cặp mồi Umc1196 cho số alen nhiều alen; cặp mồi Umc1249, Umc1908, Umc1060 cho số alen thấp alen Giá trị trung bình 4,2 alen/ locus cho thấy dòng ngô nghiên cứu cho độ đa hình cao So sánh với nghiên cứu khác nhận thấy: kết nghiên cứu cao Lê Thị Minh Thảo đồng tác giả (2014) (4 alen/locus), Legesse đồng tác giả (2007) (3,85 alen/locus); thấp nghiên cứu Bracco đồng tác giả (2009) (7,22), Yao đồng tác giả (2007) (6,1 alen/locus) Kết bảng 4.1 cho thấy hệ số PIC 10 thị đa hình tập đoàn giống ngô nghiên cứu thay đổi từ giá trị PIC cặp mồi Umc1196 cao (0.8088) đên cặp mồi Umc1249 thấp (0,5783) Khi so sánh giá trị PIC trung bình nghiên cứu với nghiên cứu khác nhận thấy: giá trị PIC nghiên cứu cao so với Legesse đồng tác giả (2007) (0,58), Sharma đồng tác giả (2007) (0,6), Bracco đồng tác giả (2009) (0,37) ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Vũ Văn Hiến Lớp: Công nghệ sinh học k13 4.4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA CÁC GIỐNG NGÔ Đa dạng di truyền phương thức tồn loài qua hàng ngàn năm tiến hóa Đa dạng di truyền cần thiết quan trọng sinh vật để trì khả sinh sản hữu thụ, tính bền vững trước yếu tố đe doạ Nó có vai trò quan trọng đến khả đề kháng với loại dịch bệnh khả thích nghi cá thể loài với thay đổi môi trường Sự đa dạng di truyền trồng vật nuôi có giá trị đặc biệt có ý nghĩa lớn chương trình lai tạo giống phục vụ sản xuất nông lâm nghiệp Sự khác biệt gen quần thể xác định số gen quần thể gen số alen gen Sự khác biệt gen cho phép loài thích ứng với thay đổi môi trường Để nghiên cứu mức độ đa dạng di truyền người ta thường dựa vào ba hệ số bản: Hệ số Nei Li (1979), hệ số Jaccard (1908), hệ số SM (Sokal Michener, 1958) Để phân tích nhóm so sánh ma trận tương đồng với nhau, người ta dùng số phương pháp ma trận khác UPGMA (Sokal Michener, 1958), ma trận giống WPGMA (Sneath Sokal, 1973), liên kết đơn (Lance Williams, 1976) liên kết hoàn toàn (Lance Williams, 1976) Việc chọn sử dụng phương pháp tuỳ thuộc vào đối tượng mục đích nghiên cứu Nhiều nghiên cứu sử dụng hệ số tương đồng di truyền Jaccard phương pháp tính UPGMA cho nghiên cứu đa dạng di truyền phù hợp Hệ số tương đồng di truyền Jaccard cho ta biết mối tương quan mặt di truyền mẫu phân tích Trị số Jaccard tiến mức độ tương đồng di truyền mẫu thấp ngược lại, tiến mức độ tương đồng di truyền cao Số liệu thu từ thỉ qua phản ứng PCR kết hợp với điện di đưa vào xử lý phần mềm ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Vũ Văn Hiến Lớp: Công nghệ sinh học k13 NTSYSpc version 2.02 để tính hệ số tương đồng di truyền xây dựng biểu đồ quan hệ di truyền mẫu ngô quần thể (hình 4.8) Hình 4.8 Biểu đồ quan hệ di truyền 48 giống ngô nghiên cứu Qua biểu đồ quan hệ di truyền hình 4.8 cho thấy khoảng cách di truyền giống ngô xa nhau, mẫu ngô nghiên cứu có hệ số tương đồng di truyền Jaccard dao động khoảng 0,1 – 1,0 Trong đó, giống H245, DF18C TQM có quan hệ xa so với giống lại Trong số giống có quan hệ gần (gần xuất xứ) ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Vũ Văn Hiến Lớp: Công nghệ sinh học k13 với hệ số tương đồng di truyền 1,00 hai giống TQ2 X16 hay X24 X128 Biểu đồ quan hệ di truyền xây dựng sở hệ số tương đồng di truyền 48 giống ngô nghiên cứu cho thấy rõ khác biệt mối quan hệ di truyền giống nghiên cứu Trên biểu đồ di truyền nhận thấy tập đoàn giống ngô nghiên cứu chia làm nhóm khác khoảng cách di truyền Nhóm I: nhóm có giống H245, DF18C TQM có hệ số tương đồng di truyền so với nhóm lại khoảng 0.10 Giống quan hệ gần gũi với giống tập đoàn giống nghiên cứu Nhóm II Nhóm gồm 15 giống: T03, X122, 09N05, X128, X124, H665, H411, H822, H42, H46, H14, H2, T60Q H1 Hệ số tương đồng di truyền với nhóm lại 0,19 Được chia làm phân nhóm Hệ số tương đồng di truyền hai giống X128, X124 (gần phân nhóm) 1,0 Nhóm III Đây nhóm gồm 15 giống có số lượng lớn biểu đồ quan hệ di truyền Nhóm III chia làm phân nhóm Hệ số tương đồng di truyền phân nhóm 0,25 + Phân nhóm có giống H145, H34, X127, 09N03, H675, H262, H264 H56 + Phân nhóm gồm giống: DF18, H159, H162, H306, H71 Hệ số tương đồng giống phân nhóm 0.30 + Phân nhóm gồm giống: H76, H54 Hệ số tương đồng giống phân nhóm 0.31 Nhóm IV: có tất giống, H171, H32 H55 Nhóm V gồm 10 giống chia làm phân nhóm Hệ số tương đồng di truyền phân nhóm 0,28 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Vũ Văn Hiến Lớp: Công nghệ sinh học k13 + Phân nhóm có giống H3A1, X1211, X1210, X126 T02 Hệ số tương đồng giống gần phân nhóm 0.82 Trong X126 T02 có xuất xứ + Phân nhóm có giống H259, H84 H82 + Phân nhóm giống lại ( X1214 T05) 4.5 LỰA CHỌN CẶP LAI PHỤC VỤ CHO VIỆC CHỌN TẠO GIỐNG NGÔ KHÁNG BỆNH MỐC HỒNG Căn vào kết nghiên cứu đa dạng di truyền tập đoàn ngô kết thí nghiệm đánh giá tính kháng bệnh tập đoàn giống Viện Bảo vệ thực vật cung cấp (phụ lục), tiến hành xây dựng cặp lai phục vụ cho việc chọn tạo giống ngô kháng bệnh mốc hồng Theo kết đánh giá tính kháng bệnh, chọn hai nhóm ngô sử dụng cho việc xây dựng cặp lai: nhóm có khả kháng bệnh tốt gồm có giống, nhóm mẫn cảm với bệnh gồm giống liệt kê dòng cột bảng 4.2 Căn vào hệ số tương đồng di truyền giống ngô nghiên cứu có khả kháng bệnh tốt kém, xác định 10 cặp lai có hệ số tương đồng di truyền từ 0.5 đến 0.7 nghiên cứu để sử dụng cho lai giống Hệ số tương đồng di truyền giống ngô tập đoàn tương đối xa nên chọn giống có hệ số tương đồng vừa phải Khoảng cách di truyền 0,5 đến 0,7 không gần xa nhằm mục đích tổ hợp lai có ưu lai phù hợp Nếu gần khác biệt, xa lai khó khăn, không đảm bảo lai có sức sống tốt ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Vũ Văn Hiến Lớp: Công nghệ sinh học k13 Bảng 4.2 Hệ số tương đồng di truyền giống ngô tổ hợp lai Giống chất lượng H06 H171 H46 Giống H162 3A1 HGO M H71 TQ1 Kháng H07 0.286 0.250 0.133 0.133 0.700 0.333 0.417 0.700 H145 0.538 0.417 0.267 0.267 0.267 0.385 0.357 0.308 H159 0.250 0.091 0.077 0.273 0.273 0.300 0.273 0.273 H56 0.583 0.231 0.200 0.286 0.286 0.308 0.286 0.286 H81 0.385 0.154 0.214 0.308 0.308 0.231 0.417 0.308 H76 0.500 0.250 0.417 0.417 0.214 0.333 0.308 0.214 H2 0.286 0.500 0.214 0.308 0.308 0.333 0.700 0.308 H675 0.333 0.545 0.357 0.267 0.357 0.200 0.267 0.357 TMQ 0.267 0.231 0.059 0.125 0.500 0.417 0.500 0.500 Trong số 10 cặp lai xem xét trên, khuyến cáo nên tiếp tục chọn cặp lai có đa hình di truyền hai bố mẹ mồi liên kết để thuận lợi cho việc chọn lọc thị phân tử phục vụ cho việc chọn tạo giống kháng bệnh suất cao ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Vũ Văn Hiến Lớp: Công nghệ sinh học k13 V KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN Khi phân tích 10 mồi SSR với tập đoàn ngô cho thấy 10 mồi cho đa hình, hệ số PIC trung bình cặp mồi cao 0,698 Qua biểu đồ di truyền giống ngô cho thấy tương đồng di truyền giống ngô xa nhau, dao động từ 0,1 đến 1,0 Dựa vào biểu đồ quan hệ di truyền, 48 giống ngô nghiên cứu chia làm nhóm chính, khác khoảng cách di truyền Đã chọn được 10 cặp lai phục vụ cho việc chọn tạo giống ngô kháng bệnh mốc hồng 5.2 KIẾN NGHỊ Cần tiếp tục thực đánh giá đa dạng di truyền với nhiều mồi SSR để tăng tính tin cậy ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Vũ Văn Hiến Lớp: Công nghệ sinh học k13 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Lê Thị Minh Thảo, Nguyễn Thị Ảnh, Trần Thanh Tân, Phạm Quang Tuân, Vũ Văn Liết (2014) “Phân tích đa dạng di truyền dựa kiểu hình thị phân tử SSR đánh giá khả chịu hạn dòng ngô nếp tự phối phục vụ phát triển giống ngô nếp cho tỉnh miền núi phía bắc” Tạp chí khoa học phát triển 12(3): 285 – 297 Ngô Hữu Tình (1997) “Cây ngô” (giáo trình cao học nông nghiệp) Nhà Xuất Nông nghiệp, Hà Nội Ngô Hữu Tình, Bùi Mạnh Cường, Ngô Minh Tâm (2002), “Xác định khoảng cách di truyền - nhóm ưu lai - cặp lai suất cao thị RAPD” Tạp chí nông nghiệp phát triển nông thôn, 4: 289 - 291 Nguyễn Đức Thành (2014) “Các kỷ thuật thị DNA nghiên cứu chọn lọc thực vật” Tạp chí sinh học 36(3): 265-294 Tài liệu tiếng Anh Bracco M, Lia VV, Gottlieb, Hernández JC, Poggio L (2009) “Genetic disversity in maize landraces from indigenous settlements of Northeastern Argentina” Genetica 135: 39 – 49 Chen J, Ding J, Li H, Sun X, Li J, Wang R, Dai X, Dong H, Song W, Chen W, Xia Z, Wu J (2012) “Detection and verification of quantitative trait loci for resistance to Fusarium ear rot in maize” Mol Breeding 30(4): 1649-1656 Fan Z, Xue QW, Guang TP (2006) “QTL mapping of Fusarium moniliforme ear rot resistancein maize Map construction with microsatellite and AFLP markers” J Appl Genet 47(1): 9-15 Hendricks, K (1999) “Fumonisins and neural tube defects in south Texas” Epidemiology 10:198–200 Kuhlman EG (1982) “Varieties of Gibberella fujikuroi with anamorphs in Fusarium section Liseola” Mycologia 74: 759 - 768 Vũ Văn Hiến ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Lớp: Công nghệ sinh học k13 10 Legesse BW, Myburg AA, Pixley KV, Bothe AM (2007) “Genetic diversity of African inbred lines revealed by SSR markers” Hereditas 144(1): 10 – 11 Leilani A Robertson-Hoyt, Michael P Jines, Peter J Balint-Kurti, Don G White, Gary A Payne, Chris M Maragos, Terence L Molnar, and James B Holland (2006) “QTL Mapping for Fusarium Ear Rot and Fumonisin Contamination Resistance in Two Maize Population” Crop Sci 46: 1734–1743 12 Nankam C, Pataky JK (1996) “Resistance to kernel infection by Fusarium moniliforme in the sweet corn inbred IL 125b” Plant Disease 80: 593-598 13 Rey JI, Cerono J, Lúquez J (2009) “Identification of quantitative trait loci for resistant to maize ear rot caused by Fusarium moniliforme Sheldon and common rust caused by Puccinia sorghi in Argentinian maize germplasm” Revista de la Facultad de Agronomía, La Plata 108(1): 1-8 14 Robertson HLA, Jines MP, Balint-Kurti PJ, Kleinschmidt CE, White DG, Payne GA, Maragos CM, Molná TL, Holland JB (2006) “QTL Mapping for Fusarium Ear Rot and Fumonisin Contamination Resistance in two Maize Populations” Crop Sci 46:1734–1743 15 Saal B, Wricke (1999) “Devolopment of simple sequence repeat makers in rye (Secale cereale L.)” Genome 42(5): 964 - 972 16 Saghai-Maroof MA, Soliman KM, Jorgensen RA, Allard RW (1984) “Ribosomal DNA spacer-length polymorphisms in barley: Mendelian inheritance, chromosomal location, and population dynamics” Proc Natl Acad Sci USA 81: 8014-8018 17 Sergio tadeu sibov, Claudio Lopes de Souza Jr, Antonio Augusto Franco Garcia, Alexandre Franco Garcia, Adelmo Rezende Silva (2003) “Molecular mapping in tropical maize (Zea mays L.) using microsatellite markers Map construction and localization of loci showing distorted segregation” Hereditas 139: 96-106 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Vũ Văn Hiến Lớp: Công nghệ sinh học k13 18 Sharma L, Prasanna BM, Raesh B (2010) ”Analysis of phenotypic and microsatellite-based diversity of maize landraces in India, especially from the North East Himalayan region” Genetica 138(6): 619-31 19 Tautz D, Renz M (1984) “Simple sequences are ubiquitous repetitive components of eukaryotic genomes” Nucleic Acids Res 12(10):4127-4138 20 Williams JGK, Kubelik AR, Livak KJ et al., (1990) “DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers” Nucleic Acids Res 18: 6531-6535 21 Yao Q, Yang K, Pan G, Rong T (2007) “Genetic diversity of maize (Zea mays L.) Landraces from Southwest China based on SSR Data” Journal of genetics and genomis 34(9): 851 – 860 [...]... mốc hồng 2.3.2 Nghiên cứu đa dạng di truyền của ngô 2.3.2.1 Nghiên cứu trên thế giới Hiện nay có nhiều phương pháp để đánh giá đa dạng di truyền như SSR, RAPD, AFLP, SLP… Trong đó kỹ thuật SSR được sử dụng phổ biến và có hiệu quả cho đánh giá đa dạng di truyền nguồn gen Yao và đồng tác giả (2007) đã nghiên cứu đa dạng nguồn gen của 54 giống ngô ở phía bắc của Trung Quốc sử dụng 42 chỉ thị SSR đã tìm ra... khoa học quan tâm Lê Thị Minh Thảo và đồng tác giả (2014) đánh giá đa dạng di truyền trên 24 giống ngô nếp tự phối sử dụng 19 chỉ thị SSR thu được 75 alen Hệ số PIC dao động trong phạm vi từ 0,36 đến 0,81 Số alen trung bình là 4 alen/locus Phan Xuân Hào (2013) đánh giá đa dạng di truyền trên 70 dòng ngô mới dựa trên 35 chỉ thị phân tử SSR Kết quả nghiên cứu chỉ ra hệ số tương đồng di truyền dao động từ... LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 VẬT LIỆU 3.1.1 Mẫu ngô nghiên cứu và mồi SSR Nguyên liệu thực vật: 48 giống ngô của tập đoàn nghiên cứu do Viện nghiên cứu Ngô cung câp Bảng 3.1 Các giống ngô sử dụng trong nghiên cứu TT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 Tên giống 09N03 09N05 CML161 DF18 DF18C H02 H042 H1 H12 H14 H31 H35 H46 H54 H56 H63 TT 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 Tên giống. .. hạt ngô có kích thước cỡ hạt đậu Hà Lan, và bám chặt thành các hàng tương đối đều xung quanh một lõi trắng để tạo ra bắp ngô Mỗi bắp ngô dài khoảng 10 - 25 cm, chứa khoảng 200 - 400 hạt Các hạt có màu như ánh đen, xám xanh, đỏ, trắng và vàng 2.3 ỨNG DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ TRONG NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN Ở NGÔ 2.3.1 Chỉ thị phân tử Khi nghiên cứu đa dạng di truyền của thực vật thường sử dụng một số chỉ. .. et al 2010) Trong thí nghiệm này, chúng tôi sử dụng 10 mồi SSR cho đa hình để phân tích đa dạng di truyền của 48 giống ngô của tập đoàn, hệ số PIC và số allen trên mỗi chỉ thị phân tử nghiên cứu được thể hiện trong bảng 4.1 Vũ Văn Hiến ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Lớp: Công nghệ sinh học k13 Bảng 4.1 Mức độ đa hình của 10 mồi SSR khi phân tích 48 giống ngô TT 1 2 3 4 5 Tên mồi Số Giá trị Umc1594 Umc1249 Umc1524... vậy, chỉ có một số loài được quan tâm như người, lúa, ngô được thiết kế mồi SSR Kỹ thuật này được ứng dụng trong chuẩn đoán những quần thể cách ly, chọn lọc gen trong những gen biến nạp, trong lập bản đồ gen, nhận dạng các giống cây trồng, đánh giá quan hệ di truyền và đa dạng ở nhiều loài cây Vì những ưu điểm trên, chúng tôi sử dụng chỉ thị SSR để nghiên cứu đa dạng di truyền nhằm xây dựng cặp lai ngô. .. chỉ thị cho dao động từ 2 đến 9 alen, số alen trung bình là 6,1 alen Legesse và đồng tác giả (2007) tiến hành đánh giá đa dạng của các giống ngô Châu Phi Số lượng giống đánh giá là 56 giống với 27 chỉ thị SSR Kết quả thu được 104 alen với mức độ trung bình 3,85 alen trên một locus, hệ số PIC trung bình là 0,58 Sharma và đồng tác giả (2007) đã tiến hành nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền của 48 giống. .. giống ngô ở phía đông bắc dãy Himalayan sử dụng 42 chỉ thị SSR Nghiên cứu cho thấy có chỉ thị cho 13 alen, hệ số PIC là 0,6 Bracco và đồng tác giả (2009) sử dụng 10 chỉ thị phân tử để đánh giá các giống ngô ở phía đông bắc Argentina Nghiên cứu tìm ra tổng số 65 alen, trung bình là 7,22 alen trên 1 locus, hệ số PIC là 0,37 2.3.2.2 Nghiên cứu ở Việt Nam Ở Việt Nam việc đánh giá đa dạng các nguồn gen cây ngô. .. Information Content) được coi là thước đo tính đa dạng di truyền của các allen ở từng locus Còn theo Weir cho rằng, giá trị PIC có thể được hiểu như là sự đa dạng di truyền của locus gen nghiên cứu Dựa trên kết quả phân tích hệ số PIC của các chỉ thị phân tử có thể đánh giá được mức độ phức tạp của đối tượng nghiên cứu (số allen trên một locus) mức độ đa dạng di truyền của đối tượng (Pan et al 2010) Trong... cộng thêm các nucleotide chọn lọc ở đầu 3’ Bằng cách làm giảm số băng tách rời đủ để nghiên cứu đa hình Ưu điểm của AFLP là có độ đa hình cao, nhận dạng tới cá thể Thông qua đó có thể tìm được những chỉ thị liên kết rất chặt 2.3.1.3 Các đoạn DNA lặp lại đơn giản (SSR) Simple sequence repeat (SSR) là một chỉ thị phân tử quan trọng trong nghiên cứu đa dạng di truyền ở lúa Trong genome của Eukaryota tồn