PHẦN III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.2.1. Phương pháp tách chiết DNA genome
DNA genome được tách từ các mẫu lá theo phương pháp CTAB (Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide) của Saghai Maroof và cộng sự (1984) có cải tiến cho phù hợp với việc tách chiết DNA tổng số của các mẫu lúa. Quy trình thực hiện như sau:
Lá của các giống ngô được cắt làm mẫu. Nghiền mẫu lá trong Nitơ lỏng bằng cối chày sứ. Bột đã nghiền cho vào ống eppendorf 1,5 ml. Thêm 0,7 ml đệm CTAB đã làm ấm ở 650C trong 10 phút.
Để các ống trong bể ổn nhiệt ở điều kiện 650C trong 90 phút, lắc nhẹ nhàng nhưng dứt khoát 15 phút một lần để việc tách có hiệu quả.
Chuyển các ống ở bể ổn nhiệt ra để ở nhiệt độ phòng 5 phút. Thêm 0,7 ml dung dịch Chloroform/ Isoamyl alcohol (24: 1), lắc ống nhẹ nhàng 10 phút. Ly tâm 10.000 vòng/ phút trong 10 phút ở nhiệt độ phòng.
Dùng pipetman hút lớp trên cùng sang ống eppendorf 1,5 ml mới. Bổ sung hỗn hợp Phenol/ Chloroform/ Isoamyl alcohol (25: 24: 1) theo tỉ lệ 1: 1, lắc nhẹ trong 10 phút. Ly tâm với tốc độ 10.000 vòng/ phút.
Hút phần dịch trên sang ống eppendorf 1,5 ml mới, thêm 0,5 ml dung dịch Chloroform/ Isoamyl alcohol (24: 1), lắc ống nhẹ nhàng 10 phút. Ly tâm với tốc độ 10.000 vòng/ phút trong 10 phút.
Hút dịch nổi sang ống mới. Thêm Isopropanol theo tỉ lệ 1: 1. Sau đó xoay ống nhẹ nhàng vài phút. Để mẫu ở tủ - 200C trong 1 giờ. Ly tâm tốc độ 10.000 vòng/ phút trong 10 phút.
Bỏ phần dịch phía trên thu lấy tủa. Rửa rủa bằng cồn 70 % lạnh. Sau đó, thổi khô và hoà tan tủa bằng 0,5 ml TE pH 8,0.
Bổ sung RNase đã được đun cách thuỷ trong 20 phút, sau đó ủ ở 370C trong 180 phút.
Thêm cồn tuyệt đối lạnh theo tỉ lệ cồn: mẫu (2: 1), bổ sung 15 μl NaCl 5 M sau đó lắc nhẹ. Ly tâm 10.000 vòng/ phút trong 10 phút. Bỏ phần dịch nổi phía trên, thu tủa và rửa tủa bằng cồn 70 % lạnh. Thổi khô tủa trong 20 phút ở Laminar. Sau đó hoà tan tủa bằng TE. Giữ mẫu trong tủ 40C.
DNA genome sau khi tách chiết sẽ xác định hàm lượng và độ tinh sạch bằng quang phổ hấp phụ. Phương pháp này được tiến hành như sau: đo OD ở bước sóng 260 nm và 280 nm trên máy quang phổ kế UV-1601. Dựa vào sự hấp thụ mạnh ở bước sóng 260 nm của các base purine và pyrimidine của phân tử DNA mạch kép và mạch đơn, người ta sẽ đo được giá trị mật độ quang ở bước sóng 260 nm (OD260 nm - Optical Density 260 nm) của các mẫu.
Ở bước sóng 280 nm, các protein có mức hấp thụ cao nhất, đồng thời cũng hấp thụ ở bước sóng 260 nm như các axit nucleic và gây nên sự sai lệch giá trị thật khi tính nồng độ acid nucleic.
Nồng độ DNA được tính theo công thức sau CDNA (àg/àl) = OD260 x 50 x hệ số pha loóng.
Độ sạch DNA = OD260 /OD280 (OD260, OD280 là chỉ số đo được ở bước sóng 260 nm và 280 nm)
Một dung dịch acid nucleic được coi là sạch (không lẫn protein) khi tỉ số OD260 nm /OD280 nm nằm trong khoảng 1,8 - 2,0.
Các bước tiến hành
Lấy 1 ml dung môi hoà tan DNA (TE pH 8,0 hoặc nước khử ion vô trùng) cho vào cuvette đo làm đối chứng. Cho 5 μl dung dịch DNA cần đo nồng độ vào 995 μl dung môi hoà tan DNA (pha loãng 200 lần). Sau đó cho vào cuvette và đo OD ở bước sóng 260 nm và 280 nm. Từ kết quả đo được, tính nồng độ DNA theo công thức trên.
Dựa vào nồng độ để pha loãng DNA ra nồng độ 25 ng/ μl bằng nước để chuẩn bị chạy PCR với các mồi SSR theo công thức
N1 × V1 = N2 × V2
Trong đó N1: Nồng độ DNA ban đầu V1: Thể tích cần lấy để pha N2: Nồng độ DNA cần pha V2: Thể tích cần pha
Kiểm tra DNA tách chiết đã được pha loãng bằng cách điện di trên gel agarose 1 %. Gel agarose được nhuộm trong ethidium bromide và chụp ảnh dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 254 - 260 nm trên máy chụp ảnh gel CLS - Microdoc (Cleaver Scientific Ltd, Mỹ).
3.2.2. Phương pháp chạy PCR với các mồi SSR
* Hỗn hợp phản ứng PCR 20 μl (Bảng 3.3)
Bảng 3.3. Hỗn hợp phản ứng PCR với các mồi SSR
STT Thành phần Thể tớch (àl)
1 H2O 13,4 àl
2 Buffer 10xPCR 2,0 àl
3 dNTP (1 mM) 2,5 àl
4 Mồi xuụi (50 ng/μl) 0,5 àl
5 Mồi ngược (50 ng/ àl) 0,5 àl
6 Enzyme Taq polymerase (5 U/μl) 0,1 àl
7 DNA genome (25 ng/àl) 1 àl
8 Tổng 20 àl
Chu trình nhiệt bao gồm các bước : 940C – 4 phút; 940C – 1 phút; Ta tùy theo từng mồi – 1 phút; 720C – 2 phút; lặp lại 35 chu kỳ từ bước 2 đến bước 4; 720C – 7 phút; giữ nhiệt độ ở 40C.
3.2.3. Phương pháp điện di trên gel agarose Các bước tiến hành:
Chuẩn bị gel agarose 1 %
Dùng ống đong lấy 40 ml dung dịch đệm TBE cho vào bình tam giác.
Cân 0,4 g agarose cho vào bình tam giác trên. Đun hỗn hợp trên trong lò vi sóng khoảng 2 phút cho agarose tan hoàn toàn trong dung dịch. Chuẩn bị khay điện di và lược cài thăng bằng. Để dung dịch agarose nguội đến 600C, đổ vào khay điện di, tránh tạo bọt, sau đó chờ khoảng 30 phút cho gel đông lại. Đặt khay vào bể điện di, đổ dung dịch đệm 1X TBE ngập gel khoảng 0,5 cm rồi rút lược.
Chạy điện di
Trộn mẫu DNA cần điện di với dung dịch đệm tra mẫu (Loading buffer) theo tỉ lệ 2: 1. Tra mẫu vào các giếng điện di. Tra maker để xác định độ dài các băng DNA. Điện di với hiệu điện thế 60 V - 80 V, DNA sẽ di chuyển từ cực âm sang cực dương của điện trường. Dựa vào vị trí của vạch màu để ngừng quá trình điện di.
Nhuộm mẫu
Sau khi điện di xong, lấy bản gel ra và ngâm vào dung dịch có Ethidium bromide ở nồng độ 30 μl/ l. Nhuộm trong 20 phút, để trên máy lắc nhẹ. Lấy bản gel ra, rửa bằng cách ngâm trong nước 2 phút - 3 phút.
Quan sát và chụp ảnh
Bản gel được xem dưới ánh sáng tử ngoại của máy soi DNA. Chụp ảnh bằng hệ thống chụp ảnh CLS (Micro Cleaver Scientific LTD, Mỹ).
3.2.4. Phương pháp kiểm tra sản phẩm PCR trên gel polyacrylamide Chuẩn bị bản gel polyacrylamide
Bản gel có kích thước 19 x 50 cm gồm hai tấm kính, tấm kính ngắn không bám bản gel và tấm kính dài được gắn bản gel. Rửa sạch hai tấm kính trên 3 lần bằng nước cất 2 lần. Sau đó lau khô bằng giấy lụa mềm, tiếp theo lau lại bằng giấy Kimwipe cho khô và sạch bụi. Trên tấm kính ngắn sử dụng dung dịch bôi trơn là Rain X thấm trên giấy Kimwipe, chờ từ 15 - 20 phút cho khô. Trên tấm kính dài sử dụng dung dịch dính gồm 1 ml hỗn hợp với 95 % cồn tuyệt đối, 0,5 % acetic acid và 3,0 μl bind silance. Để từ 15 - 20 phút cho khô. Đặt hai tấm spacer vào hai bên mép tấm kính rồi ghép hai tấm kính lại với nhau để tạo khuôn đúc gel, khi đó khuôn đúc có độ dày đúng bằng độ dày của thanh spacer.
Chuẩn bị gel chạy điện di
Dùng ống đong lấy 55 ml dung dịch polyacrylamide 5 %, bổ sung thêm 55 μl TEMED và 165 μl APS 10 %, trộn đều. Dùng xylanh 140 ml hút và bơm từ từ vào khoảng trống giữa hai tấm kính qua một lỗ ở đáy của hệ thống của bản gel. Khi thấy gel chảy ra gần mét ngoài, lắp lược và gel, chờ từ 2 - 3 giờ cho gel đông lại. Trong trường hợp giữ gel qua đêm ở nhiệt độ phòng cần bịt đầu có lược bằng màng plastic.
Tiến hành điện di
Sau khi gel đông, lắp bản gel vào hệ thống chạy điện di. Cho chạy thông gel trước khi tra mẫu trong 20 - 30 phút ở công suất 75 W trong dung dịch đệm 0,5X TBE. Đệm tra mẫu gồm 2,5 mg Bromophenol blue; 2,5 mg Xylene cyanlo FF; 0,4 g sucrose, thêm nước cất vừa đủ 1 ml. Tra mẫu: sản phẩm chạy SSR thu được thêm 7 μl đệm tra mẫu, trộn đều. Biến tính ở 940C trong từ 8 đến 10 phút rồi cho ngay vào khay đá. Lấy 5 μl hỗn hợp đã biến tính lần lượt tra vào các giếng. Thường tra marker 100 đầu tiên hoặc cuối cùng với một lượng khoảng 4 μl. Để tăng hiệu quả sử dụng cả gel, có thể tra mẫu nhiều lần, mỗi bản gel có thể tra từ 2 - 3 lần. Công suất chạy gel là 75 W, sau 1 - 2 giờ tắt máy, gỡ bản gel ra khỏi máy, tách bản kính không dính ra rồi tiến hành nhuộm bạc.
Chuẩn bị các dung dịch để nhuộm gel
Dung dịch cố định (1 lít) bao gồm 250 ml CH3COOH, thêm nước cất cho đủ một lít, dung dịch này dùng được 2 lần. Dung dịch hiện (1 lít) bao gồm 30 gam sodium cacbonat, thêm vào 1,5 ml HCHO, thêm nước cất cho đủ 1 lít.
Đưa vào tủ lạnh, dung dịch hiện chỉ dùng được một lần và chỉ phát huy tác dụng khi được giữ lạnh. Dung dịch nhuộm (1 lít), bao gồm 1 gam AgNO3, 1,5 ml HCHO, thêm nước cất vừa đủ 1 lít, dung dịch dùng được hai lần.
Tiến hành nhuộm bản gel
Sau khi tách bản kính, đưa vào dung dịch cố định đặt lên máy lắc trong 30 phút, đến khi không còn thấy các vạch nhuộm màu nữa. Rửa bản gel 2 lần bằng nước cất, mỗi lần 3 phút. Nhuộm gel bằng dung dịch nhuộm trong 30 phút trên máy lắc. Rửa bản gel đã nhuộm thật nhanh bằng nước cất, rửa không quá 10 giây. Cho bản gel đã rửa vào dung dịch hiện đã được làm lạnh ở 100C. Đặt lên máy lắc từ 5 đến 10 phút, cho đến khi thấy nổi rõ các băng điện
di. Cố định gel bằng dung dịch cố định trong 3 - 5 phút, kết thúc phản ứng nhuộm. Rửa lại bản gel bằng nước cất và để khô ở nhiệt độ phòng.
2.2.3. Phương pháp phân tích số liệu
Kết quả được thống kê dựa vào sự xuất hiện hay không xuất hiện của các băng DNA (các allele). Xác định hệ số tương đồng di truyền, lập biểu đồ hình cây để so sánh hệ số tương đồng di truyền giữa 48 giống theo phương pháp Nei và Li. Số liệu được xử lý bằng chương trình NTSYSpc 2.1.
Hệ số đa dạng gen (PIC) hay còn gọi là hàm lượng thông tin tính đa hình của từng locus (Polymorphic Information Content) được tính theo công thức của Saa và Wricke (1999):
PICi =1 - ΣPij2
Trong đó, Pij là tần số xuất hiện của allen thứ j của kiểu gen i được kiểm tra. Phạm vi giá trị PIC từ 0 (không đa hình) tới 1 (đa hình hoàn toàn).