Bài viết tiến hành nghiên cứu tiềm năng tái sinh của các giống lúa Việt Nam và tiến tới hoàn thiện các quy trình nuôi cấy in vitro trên các giống lúa có khả năng tái sinh cao phục vụ công tác chuyển gien thực vật.
30(3): 141-147 9-2008 Tạp chí Sinh học Nghiên cứu khả tái sinh lúa từ phôi tập đoàn giống lúa Việt Nam nhằm phục vụ cho công tác chuyển gien Cao Lệ Quyên, Lê Kim Hoàn, Lê Huy Hàm, Phạm Xuân Hội Viện Di truyền nông nghiệp Trong tình hình dân số ngày gia tăng, diện tích đất canh tác ngày thu hẹp thay đổi khí hậu toàn cầu diễn biến theo chiều hớng xấu cho việc phát triển nông nghiệp Định hớng chuyển gen thực vật giải pháp nhằm tăng suất, chất lợng, sức chống chịu trồng; giảm công lao động, chi phí sử dụng thuốc trừ sâu hóa học, cải thiện môi trờng tăng cờng sức khoẻ loài ngời [5] Một trở ngại làm giảm hiệu định hớng chun gen thùc vËt lµ chóng ta ch−a cã nhiỊu quy trình nuôi cấy in vitro giống đối tợng trồng khác Ngay lúa đợc xem đối tợng trồng dễ tái sinh hầu hết nghiên cứu hoàn thiện quy trình nuôi cấy in vitro giới chØ tËp trung vµo mét sè gièng nh− Nipponbare, Tainung 67, Azucena, Kasalath, IR8, IR24, IR36, IR64, IR72, Nan Jin, Xin Qing, Pusa Basmati [3, 4, 6, 8, 9] Việt Nam, từ năm cuối kỷ 20 có nhiều nghiên cứu nuôi cấy in vitro giống lúa với mục đích tạo dòng ứng dụng cho định hớng chuyển gen phơng pháp bắn gen [1, 2] Tuy nhiên, nghiên cứu không tiếp tục phát triển đặc biệt năm gần đây, mà định hớng chuyển gen vào lúa thông qua vi khuẩn phát huy hiệu nhiều nghiên cứu chuyên sâu lĩnh vực Cha có nghiên cứu thăm dò tổng thể khả tái sinh tập đoàn giống lúa Việt Nam Vì vậy, việc hoàn thiện quy trình nuôi cấy in vitro giống lúa Việt Nam có khả tái sinh cao rÊt cã ý nghÜa gióp chóng ta chun trùc tiÕp gen quý vào đối tợng giống trồng mà không cần phép lai sau trình chuyển gen từ tăng cờng hiệu định h−íng chun gen thùc vËt Xt ph¸t tõ thùc tÕ trên, tiến hành nghiên cứu tiềm tái sinh giống lúa Việt Nam tiến tới hoàn thiện quy trình nuôi cấy in vitro giống lúa có khả tái sinh cao phục vụ công tác chuyển gen thực vật i Phơng pháp nghiên cứu Vật liệu a Giống lúa Để thực nghiên cứu tiến hành nghiên cứu tiềm tái sinh tâp đoàn 59 giống lúa Việt Nam Tất giống có lý lịch đợc cung cấp Trung tâm Tài nguyên Thực vật Viện Khoa học nông nghiệp Việt Nam đợc chia thành nhãm: nhãm gièng phỉ biÕn s¶n xt (tõ đến 26), nhóm giống chịu hạn (từ 27 đến 53), nhóm giống chất lợng cao (từ 54 đến 59) Danh sách giống cụ thể đợc trình bày bảng b Môi trờng tạo callus Sử dụng hai loại môi trờng bản: N6-D (Chu cs., 1975) MS (Murashige and Skoog, 1962) [7] víi nång ®é 2,4-D dao ®éng tõ 1,5 - 2,5 mg/l, tØ lƯ mi MS dao ®éng tõ 0,5 - 1,5 Cơ thĨ nh− sau: N6-D: N6-D + mg/l 2,4-D + 0,8% aga + 3% saccharose; MS1: MS + 1,5 mg/l 2,4-D + 0,8% aga + 3% saccharose; MS2: MS + 1,7 mg/l 2,4-D + 0,8% aga + 3% saccharose; MS3: MS + mg/l 2,4-D + 0,8% aga + 3% saccharose; MS4: 1xMS + 2,5 mg/l 2,4-D + 0,8% aga + 3% saccharose; MS5: 1/2xMS + mg/l 2,4-D + 0,8% aga + 3% saccharose; MS6: 3/2xMS + 2mg/l 2,4-D + 0,8% aga + 3% saccharose c Môi trờng tái sinh Sư dơng m«i tr−êng MS bỉ sung BAP, 141 kinetine (0,5; mg/l), casein (0,1 mg/l), thĨ nh− sau: MS7: MS + mg/l BAP + 0,5 mg/l kinetine + 0,7% aga + 3% saccharose + 15% n−íc dõa; MS8: MS + 2mg/l BAP + 0,5 mg/l kinetine+ 0,7% aga + 3% saccharose + 15% n−íc dõa + 0,1 mg/l casein; MS9: MS + 0,5 mg/l BAP + 2mg/l kinetine + 0,7% aga + 3% saccharose + 15% n−íc dõa; MS10: MS + 0,5 mg/l BAP + 0,5 mg/l kinetine + 0,7% aga + 3% saccharose + 15% n−íc dừa Bảng Danh sách tập đoàn giống lúa Việt nam đợc khảo sát nghiên cứu Giống STT Gièng STT Gièng STT IR 64 21 C70 41 Cu cong VN 10 22 C71 42 Kh¸u chăm lợng Q5 23 ĐV108 43 Khí gia Tấm ấp bẹ 24 Nếp 9603 44 Pê đớ Xi23 25 ĐB 45 Lốc nghệ Khang dân 18 26 ĐB06 46 Lúa đỏ Nghệ An Nếp IR 352 27 KhÊu le 47 AC5 LT 28 Tẻ đỏ 48 Cờm dạng LC 93-1 29 Lúa tẻ nơng 49 Cờm dạng 10 LC 93-4 30 Lóa ®åi 50 Lóa ngoi 11 Bp 31 Lúa lốc đỏ (tẻ) 51 Ngoi tía 12 Nếp 87 32 Hẻo dạng 52 Gz-1368 13 Nếp 97 33 Trì trì đỏ 53 Chành trụi 14 DT10 34 Lúa đá dạng 54 Hơng Thơm số 15 DT13 35 Mi pờ lê la 55 Bắc thơm số 16 X21 36 Ble mạ mùa 56 Tám xoan 17 NX30 37 Ble xá 57 Tám tiêu 18 13/2 38 Mång lu 58 T¸m xoan 19 Méc tun 39 Ngä m−¬ng måi 59 Bao thai lïn Phơng pháp Hạt lúa bóc vỏ đợc xử lý cách rửa nớc cất lần, ngâm lắc nhẹ cån 70% thêi gian phót, H2O2 15% thêi gian 15 phót, sau ®ã rưa b»ng n−íc cÊt khử trùng 4-5 lần Hạt khử trùng đợc đa nuôi môi trờng tạo callus tối 28oC Sau tuần nuôi cấy, callus đợc chuyển sang môi Tỷ lệ tạo callus (%) = callus tạo thành mẫu đa vào Từ kết đánh giá định lợng khả hình thành callus giống, chia khả hình thành callus thành cấp độ khác nhau: không tạo callus (-), tỷ lệ tạo callus d−íi 30% (+), tû lƯ t¹o callus d−íi 60% (++), tỷ lệ tạo callus dới 80% (+++) tỷ lệ tạo callus Tỷ lệ hình thành chồi (%) = 142 trờng tái sinh nuôi điều kiện nhiệt ®é 25oC, ®é Èm 50-70%, thêi gian chiÕu s¸ng 16 h/ngày cờng độ 3000 lux Việc đánh giá khả hình thành callus tập đoàn giống lúa khảo sát đợc tiến hành sau tuần nuôi cấy môi trờng tạo callus Từng giống lúa đợc đánh giá định lợng theo tiêu sau: ì 100% 80% (++++) Việc đánh giá khả tái sinh tập đoàn giống khảo sát đợc tiến hành sau - tuần nuôi cấy môi trờng tái sinh Từng giống lúa đợc đánh giá định lợng theo công thức sau: hình thành chồi callus đa vào ì 100% Từ kết đánh giá định lợng khả tái sinh giống, đa cấp độ khác khả tái sinh cây: tỷ lệ tái sinh 30% (+), tỷ lệ tái sinh 60% (++), tỷ lệ tái sinh 80% (+++) ii Kết thảo luận Khả hình thành callus tập đoàn 59 giống lúa Việt Nam Kết thí nghiệm đánh giá khả tạo callus tập đoàn giống lúa Việt Nam môi trờng N6-D môi trờng MS đợc trình bày cụ thể bảng Bảng Khả hình thành callus tập đoàn 59 gièng lóa ViƯt Nam MT MT N6-D MS1 MS2 MS3 MS4 Gièng 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 N6-D MS1 MS2 MS3 MS4 - + + + +++ +++ ++++ + + - + + + +++ ++ +++ + + - + + + ++ ++ ++ ++ + + + ++++ ++ +++ ++ ++ - + + + ++ ++ + + + - Gièng - + + + + + + + + + + + + + - + + + + + + + + + + + + + - ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ + + ++ ++ ++ + ++ ++ + - + + + + + + + + + + + + + - Trong tổng số 59 giống đợc nghiên cứu có 32 giống có khả hình thành callus 27 giống không hình thành callus Trong số 32 giống có khả hình thành callus, 19 giống có tỷ lệ hình thành callus từ 30 - 60%, mét tû lÖ 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 hoµn toµn cã thĨ tèi −u hãa thµnh quy trình nuôi cấy in vitro để chuyển gen trực tiếp; đặc biệt có giống (Lúa ngoi Chành trụi) có tỉ lệ hình thành callus tơng ứng 98% 91%, tỷ lệ đợc xem cao so với tỷ lệ đợc công 143 bố Điều thú vị tỷ lệ giống có khả hình thành callus đợc phân bố đồng c¶ nhãm gièng Cơ thĨ, nhãm gièng phỉ biÕn sản xuất 15 số 26 giống, nhóm chịu hạn 15 số 27 giống nhóm chất lợng cao giống Với tỷ lệ 52% số giống tập đoàn giống khảo sát có khả hình thành callus phân bè tû lƯ ë nhãm nh− trªn cho ta ®i ®Õn kÕt luËn: Genotype ¶nh h−ëng trùc tiÕp ®Õn khả hình thành callus v việc nghiên cứu quy trình nuôi cấy in vitro cho giống lúa phục vụ định hớng chuyển gen có ý nghĩa việc tăng cờng hiệu định hớng chuyển gen thực vật Rất nhiều nghiên cứu nớc sử dụng môi trờng N6-D cho việc hình thành callus, đặc biệt với giống lúa Japonica [6, 8, 9] Trong nghiên cứu này, tập đoàn giống lúa khảo sát có giống Japonica Indica nhng thí nghiệm khảo sát giống có khả hình thành callus môi trờng N6-D Từ kết nghiên cứu kết hợp với kết nghiên cứu trớc Việt Nam môi trờng sử dụng nghiên cứu tạo callus, đến khuyến cáo sử dụng môi trờng MS việc tạo callus với giống lúa Việt Nam Hầu hết giống lúa có khả hình thành callus cho tỉ lệ hình thành callus cao nồng độ 2,4-D mg/l Tuy nhiên, số giống nhóm giống lúa chịu hạn cho tỉ lệ hình thành callus cao nồng độ 2,4-D 1,5 mg/l (vÝ dơ gièng Ngoi tÝa vµ gièng Chµnh trơi - h×nh 1) A B H×nh Sù h×nh thành Callus sau 12 ngày cấy hai loại môi trờng N6-D MS A Giống Lốc nghệ môi trờng N6-D; B Giống Lúa ngoi Chành trụi môi trờng MS Đối với trồng, chất vô đóng vai trò quan trọng Muối khoáng thành phần thiếu môi trờng nuôi cấy mô tế bào thực vật Hàm lợng khoáng môi trờng ảnh hởng tới hoạt động sinh lý mô Để tìm hiểu công thức môi trờng 144 khoáng phù hợp cho hình thành callus tập đoàn giống khảo sát, sử dụng công thức môi trờng khoáng với thành phần muối khoáng 1/2xMS, 1xMS 3/2xMS Kết đợc trình bày bảng Bảng Sự ảnh hởng hàm lợng muối đến hình thành callus số giống lúa ViÖt Nam MT Gièng MS5 MS3 MS6 + + + + + + + + + + + ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ + + + + + + + + + + + 14 15 16 20 21 22 Tất 32 giống có khả hình thành callus tập đoàn giống khả sát cho tỉ lệ hình thành callus cao nồng độ muối khoáng 1xMS Vì vậy, môi trờng tạo callus chứa 1xMS MT Gièng MS5 MS3 MS6 + ++ + ++ ++ ++ ++ ++ + + ++ ++ ++ ++ ++ ++++ ++ +++ ++ ++ + ++ + ++ ++ ++ ++ ++ + + 26 27 37 45 46 50 51 53 54 55 đợc xem tối u cho tập đoàn 59 giống lúa Việt Nam sử dụng nghiên cứu Khả tái sinh callus tập đoàn giống lúa Việt Nam Bảng Khả tái sinh từ callus tập đoàn giống lúa Việt Nam MT MS7 Gièng + + + ++ + 14 ++ 15 + 16 ++ 17 ++ 18 + 20 + 21 22 23 26 27 MT MS7 Gièng 29 + 33 + 34 + 36 ++ 37 ++ 38 + 45 + 46 + 47 + MS8 MS9 MS10 ++ ++ ++ + ++ + ++ + ++ + + + + + + + + + + + + + + + ++ + + + ++ ++ ++ + + + + + + 48 49 50 ++ ++ + + + ++ ++ ++ + + + + + + + + 51 53 54 55 MS8 MS9 MS10 ++ ++ + + ++ ++ + + + + + + + + + + + + + + + ++ + + + + + + + + ++ ++ + + + + + + + +++ ++ + ++ ++ +++ ++ +++ + + + + ++ ++ + + 145 Tập đoàn 32 giống lúa có khả hình thành callus đợc tiếp tục nghiên cứu khả tái sinh môi trờng MS có bổ sung BAP, kinetine (0,5; mg/l), casein (0,1 mg/l) ë nồng độ khác nhau, kết trình bày bảng Tất giống lúa có khả hình thành callus có khả tái sinh Cụ thĨ tỉng sè 32 gièng nghiªn cøu, 24 gièng cho khả tái sinh 60%, đặc biệt có giống: Ngoi tía, Chành trụi Bắc thơm số cho khả tái sinh tơng ứng 82%, 85% 81% Chứng tỏ định hớng tối u quy trình nuôi cấy in vitro cho giống lúa có khả tái sinh hoàn toàn thực thi định hớng chuyển gen Cả môi trờng sử dụng nghiên cứu có khả tái sinh Tuy nhiên, hầu hết giống lúa (22/27 giống) cho tỉ lệ tái sinh cao (trên 60%) với m«i tr−êng MS8 (MS + mg/l BAP + 0,5 mg/l kinetine + 0,7% aga + 3% saccharose + 15% n−íc dõa + 0,1 mg/l casein) tỉng sè 27 giống cho tỉ lệ tái sinh cao (trên 60%) môi trờng MS7 (MS + mg/l BAP + 0,5 mg/l kinetine + 0,7% aga + 3% saccharose + 15% n−íc dõa) A B Hình Cây tái sinh từ callus số giống lúa có tiềm A Sau 17 ngày tái sinh: Giống Bắc thơm số 7; Gièng Lèc nghƯ; Gièng Khang d©n; B Sau 22 ngày tái sinh: Giống Bắc thơm số 7; Gièng Lèc nghƯ; Gièng Khang d©n Iii KÕt ln Ngoại trừ hai giống nhóm giống lúa chịu hạn (Ngoi tía Chành trụi) cho tỉ lệ hình thành callus cao nồng độ 2,4-D 1,5 mg/l Còn với giống khác, sử dụng môi trờng muối 1xMS có bổ sung hàm lợng 146 mg/l 2,4-D cho khả tạo callus tối u tập đoàn 59 giống lúa Việt Nam Môi trờng MS có bæ sung mg/l BAP; 0,5 mg/l kinetine; 0,1 g/l casein 15% nớc dừa cho khả tái sinh cao 59 giống lúa khảo sát Mặt khác, có giống nhóm giống lúa phổ biến sản xuất giống nhóm giống lúa chịu hạn cho khả tái sinh cao víi m«i tr−êng MS cã bỉ sung mg/l BAP, 0,5 mg/l kinetine vµ 15% n−íc dõa Hai gièng lóa chịu hạn (Lúa ngoi Chành trụi) giống lúa chất lợng cao (Bắc thơm số 7) có tỉ lệ tạo callus tái sinh cao đợc tiếp tục nghiên cứu để hoàn thiện quy trình chuyển gen trực tiếp vào giống lúa Tài liệu tham khảo Đặng Thị Minh Trang cs., 2000: Những vấn đề nghiên cứu khoa học sống: 695-695 Nxb Nông nghiệp, H Nội Trần Bích Lan cs., 1997: Kết nghiên cứu khoa học 1997-1998: 344-347 Nxb Nông nghiệp, Hà Nội Aldemita R R & Hodges T K., 1996: Planta, 199: 612-617 Amitabh Mohanty, N.P Sarma, Akhilesh K Tyagi, 1999: Plant Science, 147: 127-137 James C., 2005: Global status of commercialized bitech/MG crops ISAAA briefs 34 ISAAA: Ithaca, NY Seiichi Toki et al., 2006: The Plant Journal, 47: 969-976 Swapan K et al., 1997: Production and molecular evaluation transgenic rice plants International rice reseach institute Yukoh Hiei and Toshihiko Komari, 2006 Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 85: 271-283 Yukoh Hiei, Toshihiko Komari & Kumashiro T., 1994: Plant J., 6: 271-282 Study on plant regeneration from embryo of a group Indica and Japonica varieties of Vietnamese rice for transformation approach Cao Le Quyen, Le Kim Hoan Le Huy Ham and Pham Xuan Hoi Summary Although, a highly efficient gene transfer method mediated by Agrobacterium tumefaciens was developed for both Japonica and Indica rice However, highly efficient transformation apporoach is now facing with difficulty in in vitro system as there are not many tissue culture protocols for different Vietnamese rice varieties Here, we report the callus forming potency and plant regeneration capacity of 59 vietnamese rice varieties including 26 common varieties, 27 droupt resistance varieties and high quality varieties At least, 32 rice varieties in a total of 59 surveyed varieties have callus forming potency Among them, 19 rice varieties have callus formation rate of 40 - 60%, a variety has callus formation rate of 71% and two varieties have callus formation rate of above 90% The 1xMS medium supplementented with a range of 1.5-2 mg/l 2,4D seem to be optimal for callus forming All 32 calus forming rice varieties showed plant regeneration capacity Out of wich, 24 rice varieties have regeneration score above 60%, specially three rice varieties have regeneration score of above 80% The 1xMS medium supplementented with 2mg/l BAP, 0.5 mg/l kinetine, 0.1mg/l casein seem to be optimal for plant regeneration The result is opening a posibility for transformation protocol development for Vietnamese rice varieties Ngµy nhËn bµi: 11-12-2007 147 ... 54 55 đợc xem tối u cho tập đoàn 59 giống lúa Việt Nam sử dụng nghiên cứu Khả tái sinh callus tập đoàn giống lúa Việt Nam Bảng Khả tái sinh từ callus tập đoàn giống lúa ViÖt Nam MT MS7 Gièng +... in vitro cho giống lúa có khả tái sinh hoàn toàn thực thi định hớng chuyển gen Cả môi trờng sử dụng nghiên cứu có khả tái sinh Tuy nhiên, hầu hết giống lúa (22/27 giống) cho tỉ lệ tái sinh cao... 0,1 g/l casein 15% nớc dừa cho khả tái sinh cao 59 giống lúa khảo sát Mặt khác, có giống nhóm giống lúa phổ biến sản xuất giống nhóm giống lúa chịu hạn cho khả tái sinh cao nhÊt víi m«i tr−êng