BÁO CÁO KHOA HỌC: "ỨNG DỤNG MARKER PHÂN TỬ ĐÁNH DẤU GEN MÙI THƠM TRÊN LÚA" pptx

ỨNG DỤNG MARKER PHÂN TỬ ĐÁNH DẤU GEN MÙI THƠM TRÊN LÚA Nguyễn thị Lang & Bùi Chí Bửu Viện lúa Đồng bằng Sông Cửu Long I MỞ ĐẦU Mùi thơm được tách từ nhựa (resine), dầu hương dầu (baldams) thực vật xem như thành phần của mùi thơm được đánh dấu bằng một chỉ thị là mùi. Mùi thơm hay còn gọi là bột thơm khi nấu cơm mùi vị bốc hơi cho thấy một hợp chất chính của formaldehydes, ammonia và hydrogen sulfide. Một số nhà nghiên cứu cho rằng có sự gia tăng chất propanol, pentanal, và hexanal trong thời gian dự trữ. Hơn 100 thành phần chất bột như hydrocarbons, alcohols, aldehydes, ketones, acids, esters, phenols, pyridines, pyrazines, và thành phân khác khi nấu cơm . Chứng minh chất 2-acetyl-1-pyrroline trong giống hai giống lúa Basmati 370 và Jamine có liên quan đến mùi thơm. Emmanual 1993 đã báo cáo thông qua đánh HPLC thông qua cách đánh gía của gạo IR 64, Azucena, và Basmati, chứng minh pentanol, hexanol, benzaldehyde, va 2-acetyl-1 pyrroline, 2-acetyl-1 pyrroline là thành phần chính trong mùi thơm của gạo. Nghiên cứu di truyền của mùi thơm trên lúa cho thấy rằng gen mùi thơm được kiểm chứng bởi một gen lặn ( Berner v ctv 1989) . Ahn et al 1992 báo cáo rằng marker ADN liên kết với gen mùi thơm .Đoạn nhiễm sắc thể từ ( Della)dùng làm donor được tách bởi kỹ thuật RFLP,thông qua phát triển dòng đẳng gen ( NILs) . Dùng RFLP cho thấy sự liên kết đơn gen với RG 28 trên nhiễm sắc thể số 8 ở khoản cách gần 4.5cM( Ahn va ctv 1992). Mới đây bản đồ fine mapping được Lang và ctv 2002 thiết kế với khoảng cách di truyền là 1,8cM .Nhờ marker phân tử liên kết rất chặt với mùi thơm và từ đó có thể phát hiện đồng hợp tử và dị hợp tử giai đoạn thế hệ ban đầu, rút ngắn thời gian cải tiến trong chọn giống Lang và ctv 2002. Trong bài nầy áp dụng marker để đánh giá các giống có mùi thơm nhầm phục vụ cho mục tiêu chọn giống luùa có hương vị . II. VẬT LIỆU & PHƯƠNG PHÁP II.1. Vật liệu Sử dụng mẫu giống lúa bản địa từ Ngân Hàng gen của VLĐBSCL và nhóm lúa cao sản được thu thập bao gồm: 217 giống lúa mùa đa dạng hóa nguồn gen và dùng 7 giống lúa có phẩm chất ngon để phát triển quần thể (bảng 1) Bảng 1: Đặc điểm các giống được sử dụng làm vật liệu lai II.2. Phương pháp II.2.1. Đánh gía kiểu hình về tính trạng phẩm chất lúa Đánh giá mùi thơm Hạt của cây (cá thể của BC 2 F 3 ) được bóc võ trấu bằng tay. Mười hạt của mỗi cá thể BC 2 F 3 được nghiền bằng máy Wil grinder, tốc độ trung bình. Bột gạo của mỗi hạt được đặt trong một hộp plastic 5x5 cm. Mỗi hộp, chúng tôi cho vào 500l alkali pha loãng (1,7%) và đậy lại. Mẫu đã xử lý được đặt trong điều kiện nhiệt độ của phòng thí nghiệm trong 30 phút. Các hộp được mở ra từng cái theo thứ tự, rồi đánh giá mùi thơm bằng phương pháp ngữi. Những cá thể dị hợp tử được ghi nhận trên cơ sở biểu hiện mùi thơm hoặc không thơm của hạt ở BC 2 F 3 . Chọn 10 hạt của 10 cá thể BC 2 F 3 individual được xem như đồng hợp đối với tính trạng thơm. Sự thể hiện mùi thơm và không thơm ở BC 2 F 3 cho thấy tính chất dị hợp tử của cá thể nghiên cứu. Do tính chất quan trọng và mức độ chính xác của đánh giá kiểu hình, đặc biệt là trong phân tích con lai trồng dồn (bulk segregants), chúng tôi phân tích thêm 30 hạt cho mỗi kiểu gen đồng hợp thơm và đồng hợp không thơm. Nó phải đảm bảo độ chính xác cao trong qui trình MAS. Do yêu cầu chính xác trong đánh giá kiểu hình phục vụ trong marker phaân tõ chúng tôi thu thập mẫu lá ở giai đoạn đẻ nhánh. Mỗi cá thể, chúng tôi thu 10 lá và cắt ra thừng mẫu có chiều dài 5mm, rồi đặt chúng vào lọ thủy tinh có nấp đậy, rồi tồn trữ trong điều kiện -20oC trước khi đánh giá mùi thơm. Mỗi giờ, chúng được cho điểm đối với từng mẫu lá được ướp lạnh, đặt trong ống nghiệm có nấp đậy, và trộn với 5ml dung dịch 1.7 % KOH trong 10 phút ở 50oC. Bốn đến năm người cho điểm theo cảm quan bằng phương pháp ngữi mùi. II.2.2.Phát triển quần thể Phương pháp lai : hồi giao (Backcross), từ các tổ hợp lai: IR64/ Hoa Lài, IR64/Khao Dawk Mali 105,IR64/Nàng thơm Chợ Đào, IR64/OM 1706, IR64/Jasmine 85 II.2.3.Phương pháp phân tích "PCR-based MAS" Tách chiết ADN Phân tử ADN phục vụ cho yêu cầu phân tích PCR được chuẩn bị theo qui trình simplified miniscale. Một mẫu lá tươi, non (2 cm) được thu và đặt trong ống nghiệm ly tâm 1,5ml có đánh dấu, trong đá lạnh. Lá được nghiền trong cối và chày (Spot Test Plate -Thomas Scientific) sau khi đã thêm vào 400 l dung dịch đệm (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 25mM EDTA, 300mM NaCl and 1% SDS). Nghiền mẫu đến khi dung dịch đệm có màu xanh lá cây. Thêm 400l dung dịch đệm rồi trộn đều. Chuyển 400 l lysate vào ống nghiệm có mẫu lá ban đầu. Lysate sẽ kích hoạt phản ứng tách protein nhờ cho vào 400l chloroform. Vật thể nổi (supernatant) được chuyển vào ống nghiệm mới (1.5 ml) và ADN được kết tụ nhờ sử dụng cồn ethanol. Mẫu ADN được làm khô nhờ gió và ngưng kết trong 50l dung dịch đệm TE (10mM Tris-HCl pH 8.0, 1mM EDTA pH 8.0). Chúng tôi sử dụng aliquot 1l cho phân tích PCR. Mẫu ADN được tồn trữ trong tủ lạnh sâu -20 o C để sử dụng. primer Trình tự của RG28 (Ricegenes) được thiết kế từ RFLP điều khiển tính trạng mùi thơm (Lang et al 2004) RG28.F 5'-GATCTCACTCCAAGTAAACTCTGAC-3' RG28.R 5'-ACTGCCATTGCTTCTGTTCTC-3' Hơn 31 microsatellite marker t trông Cornel cua Hoa Ky được sử dụng để phân tích đa dạng nguồn gen Xét nghiệm microsatellite Khuếch đại PCR được thực hiện trong 10mM Tris-HCL (pH 8), 50mM KCl, 1.5mM MgCl 2 .1 đơn vị của TAKARA Taq, 4 nmol dNTP, 10pmol primer và 50ng ADN hệ gen. Chu kỳ PCR: tách dây đôi ở 95 o C trong 5 phút, theo sau là 35 chu kỳ 94 o C trong 60 giây, 55 o C trong 30 giây và 72 o C trong 60 giây. Qúa trình kéo dài dây sau cùng là 72 o C trong 5 phút. Cho thêm vào 13l dung dịch đệm (98% formamide, 10mm EDTA, 0.025% bromophenol blue, 0.025% xylene cyanol) sau khi PCR. Đa hình trong sản phẩm PCR được phát hiện nhờ thuốc nhuộm ethidium bromide sau khi điện di trên 5% agarose gel. Cho điểm microsatellite và phân tích liên kết gen Marker được cho điểm căn cứ sự có hoặc không có của băng theo hai băng chuẩn: con lai phân ly (segregant) có mùi thơm và không có mùi thơmtheo bố mẹ. Những băng khác nhau như vậy được cho điểm 1 (aroma) hoặc 2 (non- aroma). Liên kết giữa SSR marker và gen fgr được ước đoán theo bản đồ liên kết gen trong phần mềm MAPMARKER (Lander 1989) Phân cắt sản phẩm PCR với enzym giới hạn tương ứng Nếu số band hiện trên màn ảnh là đơn hình (monomorphic) , bắt buộc chúng ta tiếp tục bước tiếp theo là dùng enzyme để tiêu hóa. Các enzyme có chiều dài từ 4- 8 bp cho thấy kiểu băng đơn hình. Sau khi thử nghiệm với enzyme tương ứng chúng sẽ biểu hiện đa hình. Phân tích phông sai kieu hình va he di truyeàn theo Bu va Lang 2003 III. KếT QUả III.1 Điều tra nguồn vật liệu Điều tra nguồn vật liệu cung cấp tính trạng mục tiêu được chuẩn bị để phục vụ cho công tác lai tạo sau này. Mẫu giống có tính trạng mùi thơm cấp 2 chiếm tỉ lệ rất thấp (8%) III.2. Phân tích đa dạng di truyền : áp dụng mô hình phân nhóm di truyền và phân tích khoảng cách di truyền bằng marker phân tử, microsatelite để phân nhóm di truyền 38 mẫu giống lúa mùa tại 31 loci khác nhau. Các primer cho nhiều alen là RM180, RM183. Kết quả ghi nhận có 5 nhóm chính (cluster) và nhiều nhóm phụ (subclusters). ( bảng 2, hình 2) Bảng 2: Kết qủa phân nhóm của 38 mẫu giống tại 31 loci Phân nhóm di truyền áp dụng phần mềm “PopGene” để phân tích, các nhóm di [...]... trạng thơm và không thơm Kết quả cho thấy 118 cây không thơm, 33 cây thơm nhẹ, 37 cây thơm, và 12 rất thơm Dựa vào thang điểm không thơm = 1, thơm nhẹ = 2, thơm = 3 và rất thơm = 4, cho thấy rằng tính chất thơm rất phức tạp (hình 4) Hình 4: đánh gía kiểu hình trên quần thể BC2 F3 KhadawMali 105 và OM 1490 Đối với STS marker, đa hình giữa giống KhaoDawk Mali và OM1490 trên RG28 biểu thị khá rõ Bản đồ gen. .. liên kết gen của mùi thơm được thiết lập trên hai marker RG28 và RM223 cho thấy khoảng cách di truyền với gen fgr là 1,8cM và 13,2 cM trên nhiễm sắc thể số 8, theo thứ tự (Lang va ctv 2003) Marker RG28 cho đa hình giữa hai nhóm thơm và không thơm với độ lớn phân tử sau khi chạy điện di biến động trong quãng 90 và 190bp Đối với KhaoDawkMali 105 (thơm) và OM1490 (không thơm) , kích thước phân tử của KDM... giữa kiểu gen và môi trường (GxE) trong hầu hết các tính trạng của phẩm chất hạt Qua bảng 3 cũng khẳng định rằng nếu đánh gía quần thể trên F2 cho thấy mùi thơm tương tác với môi trường rất cao trên cà 4 tổ hợp lai Bảng 3: Hệ số di truyền và phương sai của vài tổ hợp, phân tích quần thể F2 III.4 Phân tích di truyền gen điều khiển mùi thơm Biến thiên kiểu gen Bản đồ gen điều khiển tính trạng mùi thơm được... và mùi thơm OM1490 là giống cải tiến, ngắn ngày không thơm Khao Dawk Mali, OM1490, Jasmine (thơm) , và 250 cá thể BC2 F3 được sử dụng để đánh giá mùi thơm Phân ly 71 dòng thơm : 179 dòng không thơm ở BC2 F3 cho thấy sự biểu hiện của một gen lặn fgr đáp ứng theo định luật di truyền Mendel với tỉ lệ 1:3 Trong 250-BC2 F3 của tổ hợp lai Khao Dawk Mali x OM1490, có một sự biến thiên khá lớn về tính trạng mùi. .. dùng marker phân tử khẳng định lại đánh gía các tính trạng thông qua kiểu gen và không bị ảnh hưởng tác động điều kiện môi trường Thực hiện marker RG 28F- R cho kết qủa liên kết giữa marker và gen mục tiêu với khoảng cách di truyền khá gần là trong quần thể KDM/OM1490, và ước đoán mức độ chính xác là 92% Với marker nầy có thể áp dụng chọn lọc và phục vụ chọn giống lúa mùi thơm SUMMARY APPLY MOLECULAR MARKER. .. trạng mùi thơm Phân bố tần suất của thơm : không thơm trong quần thể BC2 F3 có tính chất liên tục Mùi thơm của Khao Dawk Mali đạt điểm 2, của OM1490 đạt điểm 0 Có khoảng 39.66% cá thể BC2 F3 có mùi thơm như Khao Dawk Mali và 61.30% không có mùi thơm như OM1490 Điều này cho thấy một sự tái tổ hợp rất tốt về tính trạng aroma trong quần thể này Phân tích hạt của quần thể BC2 F3 để kiểm tra độ phân ly tính... điều khiển tính trạng mùi thơm được thiết lập trên cơ sở marker RG28 (Lang và ctv 2002) Việc thiết kế các primer, chuyển đổi từ RFLP thành STS để đánh giá kiểu gen mùi thơm thông qua marker phân tử với chuỗi trình tự như sau: RG28FL: GATGGGGTAGACTAGACCAT RG28RL:CTCCAGTGGTATTAATTGCC 28FB: CTCCAGTGGTATTAATTGCC RG28RB:GCTGTTACGAGTTACGATG Dùng marker RG28FB-RB thử trên quần thể IR64/Khao Dawk Mali 105 cho... fine mapping of SSR marker linked to fgr gene of rice, omonrice 10: 16-22 Nguyễn Thị Lang , Nguyễn Thị Tâm, Trịnh Thị Lũy và Bùi Chí Bửu , 2004 ứng dụng marker phân tử trong chọn tạo giống lúa phẩm chất gạo tốt amylose trung bình và mùi thơm Báo cáo đề tài cấp Bộ 44 trang Lander ES, D Botstein 1989 Mapping Mendelian factors underlying quantitative traits using RFLP linkage map Genetics 121:185-199... 28F-R Phân tích giá trị dự đoán kết quả so sánh giữa kiểu gen và kiểu hình để khuyến cáo MAS (marker assited selection) trong chọn giống lúa có gen thơm với RG28F-R cho kết qủa rất cao 92% (Bảng 4) Bảng 4: Ước đoán mức độ chính xác trên quần thể BC2 F3 từ Khao DawMali 105/ OM 1490 IV Kết luận Đối với cây lúa, sau mục tiêu năng suất, phẩm chất hạt là một yêu cầu vô cùng quan trọng, đặc biệt là mùi thơm Mùi. .. lượng amylose 20-22%, có mùi thơm (cấp 2) Nàng thơm Chợ Đào: giống lúa thơm cổ truyền, nguồn gốc từ làng Mỹ Lệ, Long An, có hàm lượng amylose trung bình (24,0%), mùi thơm cấp 2 Giống Jasmine 85 có nguồn gốc từ Mỹ, và IRRI, có hàm lượng amylose trung bình và mùi thơm (cấp 2) Giống lúa có khả năng làm vật liệu tái tục (recurrent parent) và amylose trung bình như IR64 được sử dụng để phát triển quần thể . di truyền của mùi thơm trên lúa cho thấy rằng gen mùi thơm được kiểm chứng bởi một gen lặn ( Berner v ctv 1989) . Ahn et al 1992 báo cáo rằng marker ADN liên kết với gen mùi thơm .Đoạn nhiễm. ỨNG DỤNG MARKER PHÂN TỬ ĐÁNH DẤU GEN MÙI THƠM TRÊN LÚA Nguyễn thị Lang & Bùi Chí Bửu Viện lúa Đồng bằng Sông Cửu Long I MỞ ĐẦU Mùi thơm được tách từ nhựa (resine),. tổ hợp, phân tích quần thể F2 III.4. Phân tích di truyền gen điều khiển mùi thơm Biến thiên kiểu gen Bản đồ gen điều khiển tính trạng mùi thơm được thiết lập trên cơ sở marker