BÁO CÁO KHOA HỌC: "ỨNG DỤNG PCR/RFLP ĐỂ ĐIỀU TRA PHÂN TÍCH KIỂU GEN GEN PROTEIN SỮA ( KAPPA - CASEIN b-LACTOGLOBULIN ) Ở BÒ SỮA VIỆT NAM" ppsx

Sử dụng các chỉ thị phân tử để kiểm tra, đánh giá chọn lọc di truyền trong lai tạo bò sữa đã được triển khai tại một số nước như Mỹ, Canada, Đan mạch, Nauy..... Người ta đã sử dụng biến

ỨNG DỤNG PCR/RFLP ĐỂ ĐIỀU TRA PHÂN TÍCH KIỂU GEN GEN PROTEIN SỮA ( KAPPA - CASEIN b-LACTOGLOBULIN ) Ở BÒ SỮA VIỆT NAM

Trịnh Thị Kim Thoa, Lê Thị Hằng, Phùng Thị Bích Thuỷ, Nguyễn Anh,

Viện Công nghệ Sinh học, 18 Hoàng Quốc Việt, Cầu giấy,

Hà nội

MỞ ĐẦU

Nhằm thúc đẩy ngành chăn nuôi bò sữa ở nước ta, các nhà chăn nuôi di truyền quần thể đã và đang tiến hành lai tạo ra đàn bò sữa thuần chủng, bò lai 1/2, 3/4 và 5/8 máu Hà lan thích nghi trong điều kiện chăn nuôi trang trại và bán trang trại ở Việt nam

Ngày nay bên cạnh phương pháp chọn giống phenotype, việc nghiên cứu, ứng dụng các chỉ thị gen vào chương trình giống động thực vật ngày càng phát triển [1, 2, 3, 4, 6, 7, 8,

9, 10] Sử dụng các chỉ thị phân tử để kiểm tra, đánh giá chọn lọc di truyền trong lai tạo bò sữa đã được triển khai tại một số nước như Mỹ, Canada, Đan mạch, Nauy Ở nước

ta hướng nghiên cứu này mới được đề cập trong vài năm gần đây [12, 13] Người ta đã sử dụng biến thể BB của gen Kappa - casein ( K-Cn ), -lactoglobulin (-Lg) là hai trong

số các gen được sử dụng như là một chỉ thị di truyền chọn giống bò sữa Thật vậy, các nhà nghiên cứu trước đây đã chứng minh được vai trò của chúng liên quan tới chất

lượng sữa, chất lượng và năng suất pho mát [1, 2] K-Cn còn được coi là tiêu chuẩn chọn lọc kinh tế quan trọng để nâng cao chất lượng sữa công nghiệp [ 9 ] Chính vì lẽ đó, chúng tôi đã tiến hành điều tra phân tích kiểu gen gen

hệ lai Hy vọng những kết quả nhận được sẽ đóng góp phần

nào vào chương trình cải tạo đàn bò sữa ở nước ta

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Chúng tôi tiến hành điều tra phân tích gen K-Cn và -Lg ở tinh trùng, máu của 45 bò sữa giống hạt nhân (Hà Lan, Sind) và 84 bò lai (1/2, 3/4 và 5/8 máu Hà Lan ) nuôi

dưỡng tại Trung tâm Tinh Moncada, Trung tâm Giống và Sữa Phù Đổng Hà Nội và Trung tâm nghiên cứu bò và đồng cỏ Ba vì - Hà Tây

- Tách chiết ADN từ máu bò theo phương pháp

- Cặp mồi 2 gồm 25 oligonucletide dùng để nhân -lg

Theo phương pháp của Sulimova có cải tiến [ 11 ], chúng tôi đã tiến hành PCR để nhân đoạn gen K-Cn - 228 bp Chu trình Thermal cycle : biến tính sơ bộ: 7 phút ở 940C, mẫu được nhân lên bởi 35 chu trình: biến tính 2 phút ở 940C, đính mồi 1 phút 30 giây ở 570C, kéo dài 4 phút ở 720C Hỗn hợp PCR : 50 l, ( nồng độ MgCl2 : 3 mM, Taq-

polymerase: 2,5 đơn vị, d NTP: 0,5 mM, nồng độ ADN từ 0,5 - 1,0 g/ l )

- 15 l sản phẩm PCR được cắt bằng 10 đơn vị của

enzym cắt Hind III hoặc pst I

Chúng tôi đã tiến hành PCR để nhân đoạn gen -Lg - 262

bp theo phương pháp của Medrano [ 7 ]:

Mẫu được nhân lên bởi 35 chu trình [ biến tính 45 giây ở

940C, đính mồi 1 phút ở 600C, và kéo dài 1 phút ở 720C ) Hỗn hợp PCR : 25 l ( MgCl2 50 mM, d NTP : 10 mM, mồi 10 pmol/ml, Taq- polymerase 1,25 đơn vị, ADN : 50 -

độ tương ứng 2%, 3% và được nhuộm bằng ethidium

bromide Điện di đồ được quan sát và chụp ảnh bằng máy Gen-Doc ( phrmacia )

III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Kết quả nhân lên sau PCR và phân loại kiểu gen của gen

K-Cn trong thí nghiệm được trình bày tại hình 1

Hình 1 Điện di đồ các mẫu sản phẩm ADN 228 bp đã được nhân lên sau PCR và các mẫu sản phẩm PCR sau khi

xử lý với các enzym giới hạn Hind III và Pst I trên gel

agarose 2%, 3% ( nhuộm bằng ethidium bromide )

a) Điện di đồ các mẫu sản phẩm ADN 228 bp: Giếng 1 - maker 50 base - pair ladđer;

Giếng 2,3,4,5,6 - sản phẩm ADN 228 bp nhân lên từ máu

bò giống HàLan

b) Điện di đồ các mẫu sản phẩm PCR sau khi xử lý với

enzym Hind III và Pst 1: Giếng 1 maker 1 kb; Giếng 2,3,4

sản phẩm ADN 228 bp nhân lên từ ADN máu bò Hà lan

sau khi xử lý với Hind III; Giếng 5,6 7 - sản phẩm ADN

228 bp nhân lên từ máu bò lai Hà lan sau khi xử lý với Pst

xử lý với các enzym cắt giới hạn Hind III và Pst I trên gel

agarose 2%, 3% ( nhuộm bằng ethidium bromide )

a) Điện di đồ các mẫu sản phẩm ADN 262 bp được nhân lên sau PCR: Giếng 1 Maker 50 base - pair ladđer; Giếng 2,3,4 đoạn ADN 262 bp nhân lên từ ADN máu bò Hàlan; Giếng 5,6,7,8 - đoạn ADN 262 bp nhân lên từ ADN máu

bò lai 3/4 và 5/8 máu Hà lan

b) Điện di đồ mẫu sản phẩm PCR khi xử lý với enzym Hae

III: Giếng 7 Maker 50 base - pair ladđer; Giếng 1,2,3 - đoạn ADN 262 bp nhân lên từ ADN máu bò Hà lan khi sử ly với

Hae III; Giếng 4,5,6 - đoạn ADN 262 bp nhân lên từ ADN

máu bò lai 3/4 và 5/8 máu Hà lan khi xử lý với Hae III

Kết quả điều tra, phân tích về các kiểu gen của gen ( K - Cn ), -Lg ở bò giống hạt nhân ( bố, mẹ ) Hà lan, sind được trình bày tại bảng 1

Bảng 1: Kết quả điều tra cơ bản về kiểu gen của -Lg ở bò

sữabgen K-Cn và

Kết quả phân tích cho thấy, tất cả 45 bò giống bố mẹ ở

nước ta đều mang biến thể di truyền AA K-Cn Còn biến

thể BB của gen K-Cn không thấy xuất hiện Trong khi đó

bò Hà lan tại các nước Mỹ, Canada và Nezaland chiếm từ 3

- 4% biến thể BB của gen K-Cn [ 1, 5] Biến thể AA -Lg

ở bò đực lớn hơn 2 lần biến thể AA -Lg ở bò cái ( -Lg ở

bò đực lạibbảng1) và chiếm tỷ lệ 57,14 % Ngược lại Biến

thể AB của gen thấp hơn biến thể AA -Lg ở bò cái gần 2

lần Biến thể B B của gen -Lg ở bò cái và bò đực chiếm tỷ

lệ gần như nhau và đạt : 28 % và 21,43% Như vậy qua

điều tra, phân tích kiểu gen của gen K-Cn và -Lg ở bò đực

, cái giống Hà lan tại một số trung tâm giống ở nước ta cho thấy, chất lượng bò giống của nước ta kém hơn chất lượng

bò giống của các nước Mỹ, Canada và Newzeland nếu dựa vào hai chỉ tiêu đã nêu trên

Bò lai hướng sữa ( 1/2, 3/4 và 5/8 máu Hà lan) ở nước ta được tạo ra từ bò cái lai sind ( bò vàng Việt nam x bò sind) với bò Hà lan thuần chủng Vì thế, chúng tôi tiến hành điều tra kiểu gen của gen K-Cn và -Lg ở bò đực Sind

Kết quả nghiên cứu cho thấy: tất cả 6 bò Sind được kiểm tra đều mang biến thể A A của gen K-Cn Có 4 đực mang biến thể BB của gen -Lg ( đạt 66,67 %) ( bảng 1) Như vậy biến thể BB của gen -Lg chiếm tỷ lệ khá cao ở bò đực Sind so với bò cái và bò đực giống Hà lan

Đồng thời với việc điều tra , phân tích kiểu gen gen K-Cn

và -Lg ở bò sữa bố mẹ, chúng tôi tiến hành điều tra, phân tích kiểu gen gen K-Cn và -Lg ở bò lai Kết quả điều tra phân tích kiểu gen gen K-Cn và -Lg ở bò lai được trình

bày tại bảng 2

Qua kiểm tra, phân tích gen protein sữa ở bò lai cho thấy, 91,67 % bò lai mang biến thể AA của gen K-Cn, chỉ có 8,33 % bò lai mang biến thể BB của gen K-Cn Như vậy biến thể BB gen K-Cn ở bò lai nước ta cao hơn biến thể BB gen K-Cn của bò Hà lan của nước ngoài ( 3-4%) Tuy kết quả phân tích kiểu gen của gen K-Cn ở một số bò bố mẹ không có con nào mang biến thể BB gen K-Cn, nhưng ở con lai lại có 7 con ( chiếm 8,33%) mang thể biến thể BB gen K-Cn Đây có lẽ do con lai được tạo ra bằng tinh trùng nhập ngoại chăng? Tỷ lệ biến thể AB của gen -Lg cao

nhất khi so sánh với biến thể AA và BB của gen -Lg Ở bò lai biến thể AB gen -Lg chiếm 48,8% Bảng 2 cho thấy biến thể BB của gen -Lg đạt 40,5 % Tỷ lệ này cao hơn so với tỷ lệ biến thể BB (25,64%) của gen -Lg ở bò Hà lan (bố, mẹ), nhưng lại thấp hơn so với tỷ lệ biến thể BB của gen -Lg ở bò sind (66,67 %) Kết quả nhận được cho thấy

ở con lai phần nào đã biểu hiện tính trội di truyển của bò Sind nên tỷ lệ biến thể BB của gen -Lg mới đạt tỷ lệ cao

như vậy

Bảng 2: Kết quả điều tra cơ bản về kiểu gen của gen K-Cn

và -Lg ở bò lai

Từ kết quả phân tích ở trên, cho thấy bằng công nghệ gen

có thể xác định đặc điểm di truyền sớm thông qua các gen

xác định trong công tác chọn giống Thật vậy, có thể xác

định kiểu gen gen K-Cn và gen -Lg trong các mẫu tinh

trùng hoặc mẫu máu bò tại các trung tâm giống một cách có

hệ thống trong quá trình chọn lọc lai tạo để góp phần thúc

đẩy cải tạo đàn bò sữa một cách nhanh chóng, đồng bộ về

mặt sản lượng lẫn chất lượng sữa

Kết quả nghiên cứu dấu hiệu di truyền sớm có ý nghĩa vô cùng quan trọng trong công tác giống Kết quả nghiên cứu của chúng tôi là những số liệu điều tra cơ bản đầu tiên về kiểu gen của một số gen K- Cn và - Lg ở bò giống Hà lan

và bò lai đang khai thác tại Trung tâm Tinh đông viên

Moncada, Trung tâm giống và sữa Phù đổng Hà nội và

Trung tâm nghiên cứu bò và đồng cỏ Ba vì - Hà Tây Vấn

đề này không chỉ có ý nghĩa khoa học mà còn có ý nghĩa thực tiễn, bởi lẽ lần đầu tiên chúng ta điều tra, thống kê về kiểu gen các gen có liên quan tới chất lượng sữa ở bò giống (bố mẹ) hạt nhân và kiểm tra ở thế hệ lai Vì rằng từ trước tới nay, chúng ta chỉ mới kiểm tra chất lượng giống thông qua phương pháp di truyền quần thể với thờì gian 6 - 7 năm

để theo dõi năng suất cũng như chất lượng sữa của các thế

hệ lai, do đó gặp nhiều khó khăn trở ngại, bởi phạm vi triển khai trên quy mô lớn cần phải có thời gian và kinh phí

nhiều Thực tế phát triển ngành chăn nuôi bò sữa ở nước ta hiện nay đòi hỏi các nhà khoa học phải tạo ra một đàn bò sữa vừa có năng suất cao lại có chất lượng sữa tốt là điều kiện đầu tiên cần thiết và quan trọng đối với nhà nông Chất

lượng sữa của đàn bò hướng sữa của nước ta hiện nay (hàm lượng lipit, protein ) còn thấp so với tiêu chuẩn sữa công nghiệp và tiêu chuẩn sữa quốc tế Vì vậy để nâng cao chất lượng sữa bò, song song với các biện pháp chọn giống theo

di truyền quần thể, chúng ta cần chú ý kiểm tra, đánh gía chất lượng giống theo phương pháp kiểu gen để bổ sung khả năng cho những tính trạng quan tâm, mới có thể thực hiện được 1 cách nhanh chóng và ở quy mô lớn

Sử dụng công nghệ gen trong chương trình giống sẽ cho phép chúng ta chọn lọc các cá thể giống tốt mà khi kiểm định phenotype ta có thể bỏ sót Song để thực hiện được vấn đề này đòi hỏi chúng ta cần phân tích mẫu với số lượng lớn, đồng thời kiểm tra cả thế hệ con cháu mới có thể thực hiện được mục tiêu của mình

VI KẾT LUẬN

Từ các kết quả nhận được ở trên, chúng tôi rút ra được một

số kết luận sau:

1 Đã điều tra, phân tích được kiểu gen gen K-Cn và gen

- Lg của 129 bò sữa ( gồm 45 bò giống thuần chủng Hà lan, Sind và 84 bò sữa lai (1/2, 3/4 và 5/8 ):

• Tất cả 45 bò giống thuần chủng Hà lan, Sind đều mang tần số A A gen K-Cn và đạt 100% Không có con nào mang tần số BB gen K-Cn Tần số A A gen -Lg đạt 31,11%, tần

số AB đạt 37,78% và tần số BB đạt 31,11 % ở 45 bò giống

bố mẹ thuần chủng Hà lan và Sind

• Trong số 84 bò sữa lai (1/2, 3/4 và 5/8) tần số BB gen K-Cn đạt 8,3 3%, tần số A A gen K-Cn đạt 91,57% Tần số

A A gen -Lg đạt 10,7%, tần số AB đạt 48,8% và tần số

BB đạt 40,5 % ở 84 cá thể bò lai

2 Tần số A A gen -Lg ở bò lai giảm đi 2,5 lần và tần số

BB gen -Lg ở bò lai gần tương đương so với bò Hà lan thuần chủng, đạt 40,5%

3 Các kết quả nhận được trên đây là cơ sở khoa học để

bổ sung giúp các nhà chăn nuôi trong lai tạo giống, song song với phương pháp chọn giống kinh điển theo

phenotype, cần tuyển chọn đàn bò bố mẹ và kiểm tra di truyền ở thế hệ lai theo kiểu gen để tạo ra đàn bò sưã có năng suất cao và chất lượng tốt

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Anne-Marie Bech et all, 1990 Milk protein

polymorphism in Danish dairy cattle and the influence of genetic variants on milk yeld J of dairy research, 57, p.53-

62

2 Bovenhuis H and Weller J I; 1994 Mapping and

analysis of dairy cattle quantitave trait loci by maixmum likelihood methodology using milk protein genes as genetic markers Genetics ( in America), 137, p.267-280

3 Chung -lactoglobuin locibE.R, Kim W.T et all, 1998 DNA genotyping of K-casein and in Korean Holstein AI bulls J Diry sci ( in Korean) 20(2),p 75-84

4 Henderson D.A and Marshall, 1996 Kappa-casein kiểu gen effects in a multiple breed beef cattle population

J of animal science, V 74, supplement

5 Hemy A E, 1989 PCR technology principles and

application for DNA amplification Chapter 17, p.221

6 Lien S, etal 1990 Milk protein mapping

Biotechnology J p 414-419

7 Medrano J F, 1990 Application of the PCR procedure for genetic evalution in cattle Procceding of the 4th the world congress on genetics applied to livestock production 23-27 July, p 71-74

8 Moody D E, et all, 1996 Characterization of DNA polymorphisms in three populations of hereford Cattle and their associations with growth and maternal EPD in line 1 Heefords J Anim Sci, 74, 1784-1793

9 Zadworny D and Kuhnlein, 1990 The identification

of the kappa-casein kiểu gen in Holstein dairy cattle using PCR Theo Appl.genet 1990, 80: 631-634

10 Pedersen J, 1991 Selection to increase frequency of K-casein variant B in dairy cattle J Anim, Breed Gee

108, 434-445

11 Sulimova G.E et all, 1991 PCR application of the PCR procedure for identification of K-casein alleles in

cattle Genetic (in Russian) T.17, N 12, p 2053-2062

12 Trinh Thi Kim Thoa, Dau Hung Anh, Le dinh luong,

1998 Identification of the Kappa-casein kiểu gen in dairy bulls by PCR Genetics and applications N 3 p 5-11

13 Trinh Thi Kim Thoa, HoangTuan Anh, 1999

Application of the PCR and RFLP technology for evalution

in dairy bulls in Vietnam J Genetics and applications N

4, p 30-34

SUMMARY

Using PCR/RLFP techniques for DNA genotyping of Kappa-casein and  -lactoglobulin loci in Vietnamese dairy cattle

Trinh Thi Kim Thoa, Le Thi Hang, Phung Thi Bich Thuy, Nguyen Anh

Institute of Biotechnology-18 Hoang Quoc Viet, Cau giay, Hanoi, Vietnam

The polymorphism of kappacasein (KCn) and 

-lactoglobulin ( -Lg) loci in sperm and blood samples from

127 cattle ( 20 bulls and 109 cows) of the Holland, Sind and Holland cross-breed cows were analyed by PCR/RLFP techniques The results were shown that, the dairy Holland and Sind cattle ( 47 cattle) in two breeding centre only

carry the AA allele Cn ( 100%) Frequency BB gene

K-Cn of those cattle did not founded While frequency BB gene K-Cn of cattle from American, Canadian and

Newzeland was 3-4%

Frequency AA, AB and BB of gene b -Lg were 25,64%, 35,9% and 38,46% for Holland, Sind cattle, respectively Like that, frequency AA gene  -Lg of bulls was higher than this frequency of cows It was 57,14% Contrary to the frequency AB gene  -Lg from bulls was lower than

frequency AB gene  -Lg from cows- two times The

frequency BB of  -Lg from Holland bulls and cows was equivalent It was 28% and 21,43 % respectively From those results were shown that, quality of Vietnamese cattle

is bad more than quality of cattle from American, Canadian and Newzeland

The Vietnamese cross-breed cattle have created from Sind cross-breed cows So we were determined genotype of gene K-Cn and  -Lg from Sind bulls Results were observed that, all six Sind bulls have carrying variant AA gene K-Cn Only four Sind were carrying variant BB gene  -Lg (66,67

%) Thus, so variant BB of gene  -Lg from Sind bulls

were higher than that from Holland bulls and cows

The polymorphism of K-Cn and  -Lg loci also was

determined from 84 cross-breed cows ( 1/2, 3/4 and 5/8 ) The homozygous AA and homozygous BB of K-Cn were observed at the frequency of 91,57% and 8,33%

respectively for cross-breed cows In the  -Lg system three genotypes were observed The AA, AB and BB variants were 10,7 %, 48,8% and 40,5 %, respectively

Like that, the homozygous AA  -Lg of cross-breed cows