BÁO CÁO KHOA HỌC: "ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR KHẢO SÁT SƠ BỘ TẦN SUẤT PHÂN BỐ CÁC ALEN CỦA LOCUS D7S820 Ở NGƯỜI VIỆT NAM" pot

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR KHẢO SÁT SƠ BỘ TẦN SUẤT PHÂN BỐ CÁC ALEN CỦA LOCUS D7S820 Ở NGƯỜI VIỆT NAM Nghiêm Xuân Dũng, Trần Minh Đôn,Lương Thị Yến, Lê thị Bích Trâm.. Tại Phòng Thí nghiệm

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR KHẢO SÁT SƠ BỘ

TẦN SUẤT PHÂN BỐ CÁC ALEN CỦA LOCUS

D7S820 Ở NGƯỜI VIỆT NAM

Nghiêm Xuân Dũng, Trần Minh Đôn,Lương Thị Yến,

Lê thị Bích Trâm

Cục Kỹ thuật Hóa-Sinh và Tài liệu nghiệp vụ, Tổng cục KHKT & CN- Bộ Công an

Nhận dạng cá thể bằng kỹ thuật phân tích ADN trong công tác hình sự là một phương pháp được quan tâm và đi sâu nghiên cứu từ nhiều năm nay bởi các nhà khoa học ở nhiều nước trên thế giới So với các phương pháp trước đây,

phương pháp này có nhiều ưu điểm nổi bật như khắc phục được tình trạng số lượng mẫu quá ít, mẫu bị suy giảm

nghiêm trọng do tác động của môi trường và sự che dấu của thủ phạm Mặt khác, phương pháp phân tích ADN còn cho kết quả với độ chính xác cao, nếu sử dụng từ 6 đến 9 đoạn gen sẽ cho một kết quả gần như tuyệt đối [9]

Ở Việt Nam đã có những nghiên cứu về các locus gen đa hình như D1S80 [1], TH01 [1,4], TPOX [3], D17S5 và

ApoB [1] Trên thế giới, khoảng 12 locus đã được sử dụng rộng rãi trong y học hình sự như TH01, TPOX, D5S818, D7S820 Các locus được lựa chọn này đều mang các alen

có trình tự lặp lại ngắn (kích thước cách nhau 4bp) So với các đoạn ADN có trình tự lặp lại dài, đoạn lặp lại ngắn có khả năng ít bị biến tính nên rất có ích lợi trong công tác giám định

Tại Phòng Thí nghiệm Sinh học phân tử - Cục Kỹ thuật Hoá-Sinh và Tài liệu nghiệp vụ-Tổng cục VI-Bộ Công an, chúng tôi tiến hành nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR khảo sát sơ bộ tần suất phân bố các alen của locus D7S820

ở một nhóm cá thể người Việt Nam phục vụ công tác nhận dạng cá thể

I Phương pháp nghiên cứu

1 Nguyên liệu:

- Máu tươi của những người khoẻ mạnh không có cùng quan hệ huyết thống do Viện Quân y 108 cung cấp

- Hoá chất: Hoá chất cho tách chiết ADN (hãng Sigma); hoá chất dùng cho quá trình PCR đối với locus D7S820 (mồi đặc hiệu cho locus D7S820 của hãng Pharmacia-Thuỵ Điển; Taq ADN polymeraza-của Viện Sốt rét Ký sinh trùng

và Côn trùng Trung ương); hoá chất dùng cho điện di và nhuộm băng ADN (của các hãng Promega, Pharmacia,

Sigma, MERCK)

2 Phương pháp:

a Tách ADN:

ADN từ máu được tách chiết theo phương pháp chuẩn dùng phenol và chloroform để tinh sạch [4] Kết quả tách chiết thu được ADN có độ tinh sạch khá cao với OD trung bình 1,75 và hàm lượng >50ng/l

b Kỹ thuật PCR:

Quá trình PCR với các giai đoạn cơ bản: biến tính, gắn mồi

và tổng hợp Quá trình được thực hiện với các nhiệt độ gắn mồi khác nhau được lựa chọn từ 50oC đến 58oC Sản phẩm PCR sau đó được kiểm tra trên gel agaroza 2%, nhuộm ethidium bromide (25g/ml)

c Kỹ thuật điện di:

Các mẫu sau khi thực hiện quá trình PCR đã được kiểm tra trên gel agaroza 2% sau đó được điện di trên gel

polyacrylamide 6% sử dụng ure 7M Băng ADN được phát hiện bằng phương pháp nhuộm bạc của Bassam, 1991 [6]

d Phương pháp chọn lọc và xây dựng thang alen

* Đánh số alen theo quy ước riêng: Dựa vào các alen quan sát được của các mẫu khác nhau trên bản điện di,

chúng tôi chọn ra các mẫu mang các alen khác nhau và đánh số alen theo thứ tự từ dưới lên trên (đánh số alen từ băng ADN có trọng lượng phân tử thấp nhất đến băng

ADN có trọng lượng phân tử cao nhất) Việc đánh số ở đây chỉ mang tính quy ước sao cho mỗi alen xác định được có

ký hiệu riêng, vì đây là quá trình khảo sát ban đầu chưa có thang alen chuẩn để so sánh

* Xây dựng thang alen: Trong quá trình đánh số, chúng tôi đồng thời chọn ra những mẫu mang những alen khác nhau tập hợp lại để tạo thang alen Thang alen được tạo bằng phương pháp trộn mẫu

* Chuẩn thang alen: ký hiệu lại các alen đã khảo sát được theo quy ước quốc tế Alen của locus D7S820 được

ký hiệu từ 6 đến 14 căn cứ vào số đoạn lặp của mỗi alen

Chúng tôi tiến hành chuẩn thang alen như sau: lấy kết quả tần suất alen tính được so sánh với tần suất alen đã khảo sát bằng thang alen chuẩn ở một nhóm người Đông Nam Á Chuẩn trước hai alen theo tần suất tương đương (thường chọn alen có tần suất lớn nhất và nhỏ nhất), từ đó

ký hiệu lại các alen khác theo alen đã chuẩn

II Kết quả và bàn luận

1 Kết quả tối ưu nhiệt độ gắn mồi quá trình PCR :

Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR ở các nhiệt độ gắn mồi khác nhau cho thấy: ở tất cả các điều kiện nhiệt độ gắn mồi từ 50oC đến 58oC đều có sự hình thành sản phẩm PCR thể hiện ở sự có mặt của các băng ADN trên bản gel

agaroza Tuy nhiên, ở nhiệt độ gắn mồi 50oC, 52oC, 54oC

và 56oC băng ADN xuất hiện mờ hơn hẳn so với ở nhiệt độ gắn mồi 58oC Điều này chứng tỏ ở nhiệt độ gắn mồi 58oC, quá trình PCR là tối ưu nhất (sản phẩm tạo ra nhiều nhất so với các nhiệt độ gắn mồi còn lại) Vì vậy, điều kiện đã tối

ưu này được chúng tôi sử dụng để thực hiện quá trình PCR đối với các mẫu nghiên cứu (hình 1)

Hình 1 Kết quả kiểm tra sản phẩm PCR ở một số mẫu trên

gel agaroza theo điều kiện nhiệt độ gắn mồi 58oC

2 Kết quả chọn lọc alen và tạo thang alen :

Sử dụng các phương pháp đã nêu chúng tôi đã tạo được thang alen chuẩn cho locus D7S820 Thang alen này (ký hiệu L) bao gồm 7 alen khác nhau (hình2) được ký hiệu từ alen số 1 đến alen số 7

Hình 2 Thang alen chuẩn của locus D7S820 với 7 alen khác nhau được phân tách bằng kỹ thuật điện trên gel PA

biến tính

3 Kết quả tính tần suất alen của locus D7S820:

Căn cứ vào thang alen đã tạo được ở trên, chúng tôi đã xác định và tính tần suất alen của 64 mẫu ADN khác nhau

Đồng thời, chúng tôi cũng so sánh tần suất tính được với tần suất tương đương của người Việt Nam đã được khảo sát [1]

* Kết quả tính toán và so sánh tần suất và chuẩn alen như

sau:

Trong số 64 mẫu chúng tôi đã khảo sát, có 61 mẫu đã xác

định được alen, trong đó:

- Số cá thể đồng hợp tử : 16 (chiếm 26,2%)

- Số các thể dị hợp tử : 45 (73,8%)

- Số alen xác định được : 7 alen (ký hiệu từ alen số 7 đến alen số 13)

- Alen có tần suất cao nhất là alen số 11 (32%)

- Alen có tần suất thấp nhất là alen số 7 (0,8%)

- Chưa phát hiện thấy alen số 14 Số mẫu mà chúng tôi khảo sát bước đầu còn ít nên có thể chưa phát hiện được alen này

Với tần số khảo sát alen số 7 là 0,8% và chưa phát hiện thấy alen số 14 trong số 122 alen, có thể coi alen số 7 và 14

là các alen hiếm của locus D7S820 ở người Việt Nam

III Kết luận

1 Đã tối ưu được điều kiện PCR đối với locus D7S820 với điều kiện nhiệt độ gắn mồi là 58oC

2 Đã xây dựng được thang alen cho locus di truyền

D7S820 với 7 alen khác nhau

4 Đã khảo sát sơ bộ tần suất alen của locus D7S820 ở 64 mẫu ADN người Việt Nam dựa vào thang alen tạo được Tần suất khảo sát thu được cao nhất ở alen số 11 và thấp nhất ở alen số 7 Alen số 14 chưa thấy xuất hiện trong số mẫu đã khảo sát

Kết quả khảo sát tần suất của locus D7S820 sẽ góp phần phục vụ công tác nhận dạng cá thể người và tiến tới làm tàng thư ADN ở người Việt nam

5 Với kết quả trên, trong thời gian tiếp theo, chúng tôi mong muốn:

- Nghiên cứu tạo thang alen bằng kỹ thuật PCR sử dụng phương pháp trộn ADN khuôn

- Tiến hành khảo sát bổ xung để xây dựng được bảng phân

bố tần suất các alen của locus D7S820 ở các mẫu ADN người Việt Nam

- Tiếp tục khảo sát tần suất các alen đối với các locus ADN đa hình khác để tăng khả năng phân biệt cá thể ở người Việt Nam

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Lê Đình Lương 2001 Nghiên cứu tính đặc trưng cá thể và tần số phân bố các alen của ba lôcut VNTR (D1S80, YNZ22 và ApoB) ở Việt Nam bằng kỹ thuật PCR Di

truyền học & ứng dụng, số 4/2001

2 Lê Đình Lương, Lưu Xuân Hoà, Nguyễn Xuân Hùng, Trịnh Đức Anh Nghiên cứu xác định dấu ADN ở người Việt bằng các locut trên nhiễm sắc thể giới tính Công trình Hội nghị toàn quốc, Chương trình KHCB, Huế 7-2003

3 Ngô Tiến Quý, Hà Quốc Khanh, Nghiêm Xuân Dũng, Trần Minh Đôn, 2002: “Bước đầu khảo sát tần số phân bố alen của gen TPOX” Tạp chí Di truyền và ứng dụng 2002,

số đặc biệt chào mừng 100 năm trường Đại học Y – Hà Nội Trang 47-50

4 Nguyễn Văn Lợi, Nguyễn Trọng Toàn, Nghiêm Xuân Dũng, 2003: “Tối ưu hóa điều kiện PCR và khảo sát sơ bộ tần suất alen locus TH01 Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống Báo cáo khoa học hội nghị toàn quốc lần thứ hai nghiên cứu cơ bản trong sinh học, nông nghiệp, y học Huế, 25-26/7/2003.; trang 952-955

5 Sambrook J., Fritsch E F., Maniatis T (1989),

Molecular cloning 1,2,3, Cold Spring Harbor Laboratory

Press, USA

6 Shimada I., Brinkmann B., Nguyễn Q.T, Hohoff C Allele frequency date for 16 STR loci in the Vietnamese population International Journal of legal Medicine 2002 Short Communication (in press)

7 Westermeier R (1997), Electrophoresis in Practice, VCH A Wiley company, Federal Republic of Germany

8 Technical manual (1999), Geneprint fluorescent STR systems, Promega

THE APPLICATION OF PCR TECHNIQUE FOR THE PRELIMINARY CALCULATION OF ALLELE FREQUENCY OF LOCUS D7S820 IN VIETNAMESE POPULATION

Nghiêm Xuân Dũng, Trần Minh Đôn,

Lương Thị Yến, Lê thị Bích Trâm

Summary

The genetic variation among inviduals in higher at the

DNA level than at the protein level Identity testing by DNA analysis became a practical reality when Alec J

Jeffreys identified the hypervariable “minisatellite” or

variable number of tandem repeat (VNTR) loci in the

human genome “Microsatellite” or sort tandem repeats (STR) provide another rich source of polymorphic markers resulting from variations in the number of copies of the repeated motif PCR-based typing of STR loci become a technique of growing importance in forensic analysis and paternity testing

D7S820 is one of many STR loci which located at

chromosome number 7 and has short repeat units of 4bp This locus has been investigated and used worldwide as one of many important markers for forensic analyses and paternity testing

The aim of our study is to determine the allele frequency distribution at D7S820 in Vietnamese population Blood samples were obtained from unrelated voluntary donors from population in Vietnam The DNA isolation from the

white blood cells was performed by phenol/chloroform

extraction/ ethanol precipitation method PCR technique for D7S820 was made at optimal annealing temperature of

58oC; then separation of PCR fragments was performed by electrophoresis on the 6% denaturing polyacrylamide gel and DNA bands were visualized by silver staining

7 different alleles (from 7 to 13) was identified after the electrophoresis Allelic ladders of D7S820 were made by mixing different PCR products Base on the allelic ladders, the allele frequency was calculated Among 64 different DNA samples, 61 sample had alleles identified in which:

- A highest frequency of 32% was found at allele No 11; and a lowest frequency was 0,8% found at allele No 7

- The frequency of allele No 14 hasn’t been observed

- The percent of heterozygotes and homozygotes are

73,8% and 26,2% respectively

- In comparison with another distribution of allele

frequency on a group of South-East Asian, this result was quite equivalent

Người thẩm định nội dung khoa học: TS Nguyễn Đức Thành