BÁO CÁO KHOA HỌC: "SỬ DỤNG KỸ THUẬT DI TRUYỀN TRONG NGHIÊN CỨU TƯƠNG TÁC PROTEIN" pdf

GIỚI THIỆU: Nghiên cứu tương tác protein có ý nghĩa quan trọng nhằm xác định chức năng và sự tham gia của chúng vào một hay nhiều hoạt động sống cụ thể như quá trình phân chia tế bào,

SỬ DỤNG KỸ THUẬT DI TRUYỀN TRONG

NGHIÊN CỨU TƯƠNG TÁC PROTEIN

Dương Văn Hợp

Trung tâm Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc gia Hà nội

Sokolenko, R.G.Hermann

Viện CNSH Thực vật Đại học Tổng hợp Munich.Đức

I GIỚI THIỆU:

Nghiên cứu tương tác protein có ý nghĩa quan trọng nhằm xác định chức năng và sự tham gia của chúng vào một hay nhiều hoạt động sống cụ thể như quá trình phân chia tế bào, sao chép DNA, tổng hợp protein hay vận

chuyển tín hiệu Trên thực tế có nhiều phương pháp khác nhau dùng cho nghiên cứu tương tác protein như; sắc kí ái lực (Affinity chromatography), kết tủa miễn dịch (

Immunopricipitate) , tạo liên kết chéo ( Cross-linking) Phương pháp sắc ký ái lực được thực hiện như sau:protein nghiên cứu được cố định trên một chất mang ( ví dụ:

agarose, Sephadex) Sau đó mẫu chứa protein tương tác

được cho đi qua cột và chúng bị giữ lại các protein bám này được tách ra khỏi cột bằng các dung dịch thích hợp như : SDS, muối NaCl, dung môi hữu cơ người ta đã sử dụng phương pháp này để tách các protein tương tác với RNAaza

từ 25 năm trước đây (1)

Phương pháp kết tủa miễn dịch dựa vào phản ứng kháng nguyên với kháng thể ở đây người ta dùng chất mang

(Sepharose) gắn với protein A tương tác với kháng thể để kết tủa phức hệ kháng nguyên kháng thể đồng thời kéo theo các protein khác tương tác với protein nghiên cứu (kháng nguyên) Các protein kết tủa cùng sẽ được tách ra để

nghiên cứu (2)

Phương pháp tạo các liên kết chéo Với phương pháp này thì liên kết chéo giữa các protein tương tác với nhau nhờ một tác nhân(ví dụ gluceraldehite) Sau đó phức hệ được tách ra và phân tích khi dùng điện di hai chiều để phát hiện khả năng hai protein có tương tác với nhau(3)

Năm 1989, Stan Field (4) lần đầu tiên giới thiệu phương

pháp sử dụng kỹ thuật di truyền để nghiên cứu tương tác protein có tên là hệ thống lai kép (Two hybride system ) Phương pháp này có nhiều ưu việt hơn hắn các phương pháp khác Đặc biệt là độ chính xác và độ nhạy cao mà không phương pháp nào có thể đạt được.Nguyên lý của phương pháp này có thể được mô tả như sau Việc hoạt động của promotor cho gen “báo cáo” (reporter genes) phụ thuộc vào hai nhân tố phiên mã: nhân tố hoạt hoá promotor

AD (Activation Domain) và nhân tố bám vào sợi ADN để cho ARN polymeraza bắt đầu quá trình phiên mã BD

(DNA Binding Domain) Như vậy khi có mặt cả hai nhân

tố AD và BD thì quá trình phiên mã và dịch mã của gen

‘báo cáo” xảy ra, còn khi chỉ có một trong hai nhân tố trên thì sản phẩm của gen ‘báo cáo” không được tổng hợp

Người ta tách gen mã hoá cho hai nhân tố và gắn vào hai vectơ tách dòng riêng rẽ Muốn nghiên cứu tương tác

protein X và Y người ta tiến hành tách dòng gen mã hoá cho hai protein này và lần lượt gắn vào hai vectơ AD và

BD Sau đó hai vectơ cùng được biến nạp vào dòng tế bào biểu hiện gen Kết quả là tạo ra các protein lai ( fussion protein) AD-X và BD-Y Nếu hai protein X và Y có tương

tác với nhau thì cả AD và BD cùng hoạt hoá promotor và sản phẩm của gen “báo cáo” được phát hiện Ngược lại , nếu hai protein X và Y không tương tác với nhau thì tác động của chúng đối với promotor là riêng rẽ do đó không

có sản phẩm của gen “báo cáo”

Hình 1: Cơ sở phân tử của hệ thống lai kép

a Phức hệ phiên mã gồm AD và BD

b Sử dụng phức hệ phiên mã để nghiên cứu tương tác hai protein X và Y

Phương pháp lai kép được ứng dụng rộng rãi để nghiên cứu tương tác protein trong một số trường hợp sau:

1 Nghiên cứu tương tác hai protein như đã mô tả ở trên

2 Nghiên cứu tương tác giữa các đoạn peptit chức năng (domain) khác nhau của một protein với các protein khác

3 Nghiên cứu sàng lọc (screening) từ thư viện gen để tìm kiếm các protein tương tác với một protein đã biết

Dưới đây chúng tôi sẽ trình bày một thí nghiệm ứng dụng

kỹ thuật hệ thống lai kép với tế bào chủ là nấm men để

nghiên cứu các protein tương tác vớ photphataza (TTP30)

II SỬ DỤNG HỆ THỐNG LAI KÉP NGHIÊN CỨU CÁC PROTEIN TƯƠNG TÁC VỚI MỘT

PHOTPHATAZA TTP30

A.Vật liệu và dòng tế bào dùng cho nghiên cứu:

Thư viện gen (cDNA library) của Arabidopsis, Viện CNSH

thực vật, ĐHTH Munich Đức

Plasmit pGBT9 mang Gal4-BD và Trp và Plasmit

pGAD424 mang Gal4-AD và Leu

Dòng tế bào nấm men HF7C khuyết dưỡng Leu.,Trp.,và His.,thư viện gen ( cDNA library) của Arabidopsis đã được gắn vào plapsmit pGAD424 mang gen Leu.( Công ty

clontech ,USA) cung cấp

2 Hoá chất dùng cho nghiên cứu:

Sử dụng các cặp mồi dùng để tách dòng gen TTP30 và gắn vào vectơ pGBT9 như sau:F1,R1;F2R2 và F3

Các hoá chất khác dùng cho nghiên cứu đạt độ tinh khiết cho sinh học phân tử từ các nhà sản xuất Meck, Sigma Điều kiện phản ứng PCR: Hỗn dịch phản ứng 25 microlit: dNTP: 0,25 microMol., đệm tris : pH:8.0 10 mM,

MgCl2:1mM, DNA mồi (primer) 50ng, DNA khuôn

(template) 10-20ng) ,

94 oC:45s,55 oC:45s,72oC :45s Số chu kỳ lặp lại : 35

4 Kỹ thuật: Sử dụng cá kỹ thuật di truyền như: tách, tinh sạch DNA, cắt với enzim giới hạn, gắn vào vectơ và biến nạp E.coli theo các phương pháp mô tả của Maniats

5 (Molecular Cloning)(5) Biến nạp vào nấm men theo phương pháp Li thium acetat của (6)

6 Các kỹ thuật phát hiện dòng tế bào biến nạp trên môi trường chọn lọc và sản phẩm của gen chỉ thị theo chỉ dẫn của Clontech(7)

B: Kết quả nghiên cứu:

1 Thu nhận dòng gen mã hoá cho TTP30 bằng kỹ

thuật PCR

Gen TTP30 đã được nghiên cứu tại Việnn CNSH thực vật, ĐHTH Munich Kết quả nghiên cứu cho thấy sản phẩm của gen là protein có hai nhóm chức năng phân biệt là vị trí bám vào photphat : PB(435 bps ) và vị trí có độ lặp lại cao của 4 a xitamin TPR( 550bps ) Với mục đích tìm hiểu các protein tương tác với gen TTP30 cũng như với từng đoạn peptit PB và TPR chúng tôi dùng phản ứng PCR để thu được các đoạn gen mong muốn

Khi dùng cặp mồi F1 và R1, chúng tôi nhận được gen đầy

đủ chứa cả hai vị trí PB và TPR(1050bps) và khi dùng các cặp mồi F2, R2 và F3 ,R1 sẽ thu được các phần gen riêng biệt cho PB và TPR Kết quả điện di sản phẩm PCR được trình bày ở hình2

Hình 2: Sản phẩm PCR của gen TTP30 và các đoạn

PB,TPR

2 Gắn sản phẩm PCR vào vectơ pGBT9 và biến nạp vào dòng tế bào nấm men HF7C

Các đoạn mồi đều mong vị trí cắt của enzim giới hạn SmaI

Chúng tôi đã tiến hành cắt riêng rẽ các sản phẩm PCR và vectơ pGBT9 với SmaI Sản phẩm PCR và vectơ tinh sạch

lại được gắn với nhau nhờ ligaza(MPI) và được biến nạp vào E.coli (DH5anpha) Chúng tôi nuôi cấy E.coli chứa

plasmit pGBT9 mang các đoạn gen nghiên cứu , tiến hành tách plasmit và biến nạp vào dòng tế bào nấm men

HF7C.Trên môi trường chọn lọc khuyết dưỡng triptophan chúng tôi thu được dòng tế bào biến nạp Sử dụng kỹ thuật PCR để kiểm tra các đọan gen đã được gắn vào vectơ

pGBT9, kết quả kiểm tra được trình bày ở hình 3

Hình 3: Kết quả kiểm tra bằng PCR các đoạn gen sau khi

gắn vào vectơ pGTB9 và biến nạp vào HF7C

3 Tuyển chọn dòng gen mã hoá cho protein tương tác với TTP30

Chúng tôi đã tiến hành tách plasmit pGAD424 mang cDNA biến nạp vào tế bào nấm men HF7C đã chứa plasmit

pGBT9 mang các đoạn gen tương ứng TTP30,PB,TPR ở trên Các thể biến nạp được phát hiện trên các môi trường chọn lọc: MT1 không chứa Leu và Trip (phát hiện hiệu quả

và tần số biến nạp), môi trường MT2 không chứa Leu, Trip

và His (phát hiện dòng gen mã hoá cho protein tương tác với TTP30) theo sơ đồ 1

Kết quả thí nghiệm cho thấy các dòng tế bào đều cho tần số biến nạp cao khi phát hiện trên môi trương MT1 Trên môi trường MT2 chúng tôi chỉ nhận được 5 khuẩn lạc với dòng

tế bầo mang gen TTP30 trong khi đó không nhận được thể biến nạp nào với 2 dòng tế bào còn lại (PB và TPR) Để khẳng định các thể biến nạp thu được chúng tôi đã xác định hoạt độ betagalactosidaza và chỉ có hai thể biến nạp có hoạt tính Đồng thời chúng tôi đã dùng phản ứng PCR để phát

hiện đoạn gen cDNA khi dùng primer của plasmit

pGAD424 kết quả được trình bày ở hình 5

Sơ đồ 1: Biến nạp plasmit pGAD424 gắn với cDNA vào

dòng nấm men HF7C mang pGBT9 có chứa

TTP30,PB,TPR

Hình 5: Kết quả xác định hoạt độ betagalactosidaza (a) và

phản ứng PCR của hai thể biến nạp thu được

NHẬN XÉT:

Như vậy, khi dùng kỹ thuật lai kép với tế bào chủ là nấm men HF7C chúng tôi đã thu được 2 gen mã hoá cho protein tương tác với TTP30 có kích thước khoảng 1,6 kb ( kết quả PCR).Gen TTP30 có hai vùng chức năng PB và TPR nhưng không có biểu hiện tương tác với một protein nào từ thư viện gen cDNA , điều này có thể liên quan đến việc tách dòng riêng rẽ các vùng chức năng sẽ ảnh hưởng đến cấu hình không gian và làm thay đổi khả năng tương tác của chúng Việc xác định loại gen và vùng tương tác của hai

dòng gen thu được ở trên chỉ được thực hiện sau khi giải trình tự gen và axitamin của protein tương ứng kết hợp với

kỹ thuật tạo đột biến điẻm trong các nghiên cứu tiếp theo

SUMMARY

Dương Văn Hợp

Sokolenko, R.G.Hermann

The paper is a briefly introduction to the two-hybride

system as useful technique for studying protein interaction Studying interaction of possible proteins with TTP30 as a case -study was performed also The result showed that at least two proteins were found from the cDNA library of Arabidopsis interact with TTP30

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Ratner,D.,1974:J.Mol.Biol.88:373-383

2 Harlow,E.,P.Whyte and

S.J.Elledge.1993:Cell,75:805-816

3 Cover,J.A.,J.M.Lambert

andR.R.Traut.1981:Biochemistry,20:2843-2852

4 Fields S., Song O.,1989: Nature,340:245-246

5 Sambrook S.,Fritsch F.F., 1989 : Maniatis T.,

Molecular CloningCSH Lab.Press

6 Johnston J.R.,1993:Molecular Genetic of Yeast.AP press

7 Clontech Protocol PT3062-1-the mannual intruction