1.6.1 Cơ chế chống chịu mặn
Cơ chế chống chịu mặn của cây lúa được biết thông qua nhiều công trình khá nổi tiếng (Akbar và ctv., 1972, Korkor và Abdel-Aal 1974, Mas và Hofman 1977, Mori và ctv., 1987). Mặn ảnh hưởng đến hoạt động sinh trưởng của cây lúa dưới mức độ thiệt hại khác nhau, ở từng giai đoạn sinh trưởng phát triển khác nhau (Bùi Chí Bửu, 2003).
Nhiều nghiên cứu ghi nhận rằng tính chống chịu mặn xảy ra ở giai đoạn nảy mầm. Sau đó, trở nên rất mẩn cảm trong giai đoạn mạ (cây có 2-3 lá), rồi trở nên chống chịu trong giai đoạn tăng trưởng. Kế đến, nhiễm trong thời kỳ thụ phấn và thụ tinh. Cuối cùng thể hiện phản ứng chống chịu trong thời kì hạt chính (Pearson và ctv., 1996, IRRI 1967). Tuy nhiên trong một vài ghi nhận ở giai đoạn lúa trổ cây lúa không mẩn cảm với stress do mặn (Kaddah và ctv., 1975). Do đó người ta phải chia ra nhiều giai đoạn để nghiên cứu một cách đầy đủ cơ chế chống chịu mặn của cây trồng (Bùi Chí Bửu, 2003).
Thiệt hại do mặn thể hiện trước hết là giảm diện tích lá. Trong điều kiện thiệt hại nhẹ, trọng lượng khô có su hướng tăng lên sau một thời gian, sau đó giảm nghiêm trọng do suy giảm diện tích lá. Trong điều kiện thiệt hại nặng hơn, trọng lượng khô của chồi và rể suy giảm tương ứng với mức độ thiệt hại. Ở giai đoạn mạ, lá già hơn sẽ mất khả năng sống sót lớn hơn lá non (Bùi Chí Bửu, 2003).
Thiệt hại do mặn được gây ra bởi sự mất cân bằng áp suất thẩm thấu và sự tích tụ nhiều ion Cl- (Bùi Chí Bửu, 2003). Thiệt hại do mặn còn được ghi nhận bởi hiện tượng hấp thu một lượng quá thừa sodium, và độc tính của sodium là do clor trở thành anion trơ (neutral), có tác dụng bất lợi với một phổ rộng về nồng độ (Bùi Chí Bửu, 2003).
Sự mất cân bằng Na-K cũng là yếu tố làm hạn chế năng suất (Devitt và ctv., 1981). Ion kali có một vai trò quan trọng làm kích hoạt enzyme và đóng mở khí khổng tương ứng với tính chống chịu mặn của cây trồng, thông qua hiện tượng tích của kali trong chồi thân (Ponnamperuma 1984). Yeo và Flower (1984) đã tổng kết cơ chế chống chịu mặn của cây lúa theo từng nội dung sau:
- Hiện tượng ngăn chặn muối: cây không hấp thu một lượng muối dư thừa nhờ hiện tượng hấp thu có trọn lọc.
- Hiện tượng tái hấp thu: cây hấp thu một lượng muối thừa nhưng được tái hấp thu trong mô libe. Na+ không chuyển vị đến chồi thân.
19
- Chuyển vị từ rễ đến chồi: tình trạng chống chịu mặn được phối hợp với một mức độ cao về điện phân ở rễ lúa, và mức độ thấp về mức độ điện phân ở chồi, làm cho sự chuyển vị Na+ trở nên ít hơn từ rễ đến chồi.
- Hiện tượng ngăn cách từ lá đến lá: lượng muối dư thừa được chuyển từ lá non đến lá già, muối được định vị tại lá già không có chức năng, không thể chuyển ngược lại.
- Chống chịu ở mô: cây hấp thu muối và được ngăn cách trong các không bào (vacuoles) của lá, làm giảm ảnh hưởng độc hại của muối đối với hoạt động sinh trưởng của cây.
- Ảnh hưởng pha loãng: cây hấp thu muối nhưng sẽ làm loãng nồng độ muối nhờ tăng cường tốc độ phát triển nhanh và gia tăng hàm lượng nước trong chồi.
Tất cả các cơ chế này đều nhằm làm giảm nồng độ Na+ trong các mô chức năng, do đó làm giảm tỉ lệ Na+/K+ trong chồi (<1). Theo Bùi Chí Bửu (2003), Tỉ lệ Na+/K+ trong chồi được xem như là chỉ tiêu chọn lọc giống lúa chống chịu mặn.
Mỗi giống lúa đều có một hoặc hai cơ chế nêu trên, không phải có tất cả (Yeo và Flower 1984). Phản ứng của cây trông đối với tính chông chịu mặn vô cùng phức tạp, đó là hiện tượng tổng hợp từ những yếu tố riêng lẽ. Yeo và Flower (1984) kết luận rằng phản ứng tốt nhất làm gia tăng tính chống chịu mặn phải gắn liền với nhiều đặc điểm sinh lý, có tính chất độc lập tương đối với nhau. Do vậy, mục tiêu của chúng ta là phối hợp tất cả những cơ chế ấy vào trong giống lúa cải tiến tính chống chịu mặn (Bùi Chí Bửu, 2003).
Ngoài ra, Abscisic acid (ABA) được xem như một yếu tố rất quan trọng của cây trồng phản ứng với stress gây ra do mặn, do nhiệt độ cao (Gupta và ctv., 1998). Do đó, ABA còn được xem như là gen cảm ứng (inducible gens) trong cơ chế chống chịu mặn của cây trồng (Bùi Chí Bửu, 2003).
1.6.2 Nghiên cứu di truyền số lượng tính chống chịu mặn
Nghiên cứu di truyền số lượng co thấy cả hai ảnh hưởng hoạt động của gen cộng tính và gen không cộng tính điều đó có ý nghĩa trong di truyền tính chống chịu mặn (Bùi Chí Bửu, 2003).
Trong giai đoạn mạ của cây lúa, các tính trạng chiều dài chồi, hàm lượng Na và K trong chồi, trọng lượng khô của chồi, và rể thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa giữa giống nhiễm và giống kháng. Thình trạng này chủ yếu được điều khiển do hoạt động của nhóm gen cộng tính. Hệ số di truyền tính chống chịu thông qua các tính chống chịu như vậy rất thấp. Trong giai đoạn trưởng thành của cây lúa, tính trạng
20
chiều cao cây, năng suất trong điều kiện xử lý mặn được điều khiển bởi nhóm gen cộng tính (Bùi Chí Bửu, 2003).
Trong phân tích di truyền số lượng thông qua lai diallel 6x6, năng suất lúa thể hiện tính hoạt động của nhóm gen cộng tính không có ý nghĩa trong điều kiện bình thường, nhưng trở nên có ý nghĩa trong điều kiện xử lý mặn (Narayanan và
ctv., 1990). Năng suất lúa bị giảm là do ảnh hưởng của mặn. Một giống lúa có ưu thế hoạt động gen tính đối với năng suất sẽ là điều kiện thuận lợi cho chọn lọc giống trong môi trường mặn (Bùi Chí Bửu, 2003).
Trong phân tích di truyền số lượng thông qua lai diallel 9x9, tính trạng chống chịu mặn được xem xét qua tỉ lệ thấp của Na+/K+ ở trong chồi. Tình trạng này được kiểm soát bởi hoạt động của hai nhóm gen cộng tính và không cộng tính. Tính trạng Na+/K+ thấp còn thể hiện ảnh hưởng siêu trội và được điều khiển ít nhất qua hai nhóm gen trội. Ảnh hưởng của môi trường rất có ý nghĩa và hệ số di truyền thấp (19,18%) (Gregorio và Senadhira, 1993). Từ đó, các tác giả đề nghị quần thể con lai phải thật lớn, và việc tuyển chọn nên được thực hiện ở các thế hệ sau cùng, dưới điều kiện mặn được kiểm soát chặt chẽ, giảm thiểu thấp nhất ảnh hưởng biến động của môi trường (Bùi Chí Bửu, 2003).
1.6.3 Sự thể hiện của gen chống chịu mặn
Trong nông nghiệp, thiệt hại do mặn, lạnh, và khô hạn có ảnh hưởng nghiêm trọng nhất đối với năng suất cây trồng (Boyer, 1982). Đặc biệt thiệt hại do mặn có thể làm thay đổi hoạt động sinh trưởng, phát triển, năng suất, và làm chết cây. Nhiều nghiên cứu mong muốn tìm ra cơ chế chống chịu mặn một cách rõ ràng, để xây dựng một chương trình cải tiến giống chống chịu có hiệu quả chọn lọc cao. Trong lĩnh vực nghiên cứu sinh lý thực vật, hàng loạt ảnh hưởng do stress do mặn cho thấy rằng thực vật tự bảo vệ mình khỏi những thiệt hại do mặn gây ra theo mô hình phản ứng Oxygen (Kawasaki và ctv., 2001), tránh thiếu hụt nước, tăng cường hấp thụ ion trong chu trình quang hợp (Noctor và Foyer 1998, Dat và ctv., 2000). Sự thể hiện gen chống chịu mặn xét về lĩnh vực sinh học phân tử là một khám phá vô cùng thú vị. Tính hiệu được truyền vào tế bào, các gen có chức năng chuyên môn được khởi động và hàng loạt các quá trình chuyển mã, giải mã xãy ra (Bùi Chí Bửu, 2003).
Hoạt động quang hợp, sự lưu thông qua khí khổng, và hô hấp được ghi nhận sau khi xử lý 150mM NaCl. Quang hợp giảm đi trong vòng 20 phút và ổn định ở phút thứ 30 (Hoạt động quang hợp được đo theo giá trị Umol Photons/m2/giây, hoạt động này chỉ còn khoảng 1/10 so với bình thường) trong giống chuẩn kháng Pokkali. Trong điều kiện xử lý mặn lâu hơn, Pokkali tiếp tục phát triển với tốc độ
21
quang hợp thấp. 7 ngày sau khi sử lý mặn, tổng hợp chất khô tăng gấp đôi. Pokkali duy trì lượng nước trong chồi khoảng khoảng 6 ngày bị stress (Bui Chí Bửu, 2003).
Ngược lại, IR29 thể hiện phản ứng chậm hơn đối với stress, và tất cả cây lúa đều bị chết khô trong vòng 24 giờ. Điều này cho thấy tính chống chịu mặn của Pokkali là một cơ chế thể hiện nhanh sau khi có tính hiệu mặn, giúp nó chống chịu thiệt hại do mặn tốt hơn giống nhiễm IR29 (Bui Chí Bửu, 2003).
1.6.4 Ứng dụng công nghệ sinh học trong chọn giống lúa mặn
Mohammadi - Nejad và ctv. (2008) thí nghiệm 33 SSR marker đa hình trên đoạn Saltol của nhiễm sắc thể số 1 nhằm xác định mức độ liên kết và hữu dụng của các marker này trong chọn giống chống chịu mặn.Giống Cherivirrupo và IR66946- 3R-178-1-1 (FL478) có sản phẩm PCR giống như sản phẩm PCR của Pokkali khi được nhân bản bởi marker RM8094 và cho tính chống chịu rất tốt hoặc tốt đối với mặn. Do đó, marker RM8094 thể hiện liên kết thuận và chặt chẽ với tính kháng mặn. Mohammadi - Nejad và ctv. (2008) càng khuyến cáo việc sử dụng hai marker RM8094 trong xác định kiểu gen của cây lúa chống chịu mặn có mang đoạn QTL Saltol trong các chương trình lai tạo giống lúa chịu mặn.
Bùi Chí Bửu và ctv. (2000) cho rằng chỉ có marker RM223 liên kết với gen chống chịu mặn với khoảng cách là 6,3 cM trên nhiễm sắc thể số 8. RM223 nhân bản đoạn ADN có kích thước 120 bp, liên kết với gen chống chịu mặn, từ giống Đốc Phụng và sản phẩm PCR có kích thước 160 bp từ giống nhiễm IR28.Tuy nhiên Nguyễn Thị Lang và ctv. (2001) báo cáo marker OSR1 và RM315 liên kết với QTL cho tính chống chịu mặn ở lúa, định vị trên nhiễm sắc thể số 1
22
Chương 2
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài
Đề tài được tiến hành từ tháng 6/2013 đến tháng 12/2013 tại phòng thí nghiệm Di truyền, Bộ môn Di Truyền Giống Nông Nghiệp, Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, Trường Đại Học Cần Thơ.
2.2 Vật liệu nghiên cứu
Bộ giống bao gồm 13 giống lúa ở nhiều vùng khác nhau của châu Á: Việt Nam, Afghanistan, India, Japan, Thailand (Bảng 2.1)
Bảng 2.1 Danh sách 13 giống lúa trong thí nghiệm
2.3Thiết bị, dụng cụ và hóa chất sử dụng 2.3.1 Thiết bị dụng cụ
- Cân điện tử Adventure của OHAUS (Mỹ)
- Water and oilbaths WB/ob 7-45 WBU 45 của Memmert (Đức) - Máy vortex của Taitec (Đức/0
- Máy ly tâm Mini CENTRIFUGE MCF – 1350 của Jircas (Nhật)
- Máy PCR GeneAmp PCR system 2700 (Amplied Biosystems – Malaysia)
STT Tên giống Nguồn gốc
1 Bala Baglan Afghanistan
2 Monda Laghman Afghanistan
3 Pashadi Laghman Afghanistan
4 Surjamkhi India
5 Nàng thơm Chợ Đào 1 Việt Nam
6 Izayoi Japan
7 Jakouine Japan
8 OM6161 Việt Nam
9 OM6162 Việt Nam
10 OM6600 Việt Nam
11 Cần Thơ 2 Việt Nam
12 Jasmine 85 Thái Lan
23
- Bộ điện di ATTO CORPORATION AE 7344
- Máy đọc gel bằng tia UV của BioBlock Scientific (Pháp) - Máy ảnh Canon (Nhật)
- Tủ lạnh SR – S22TN(S) của SANYO (Nhật)
- Tủ lạnh -290 MDF – 135 của SANYO Electric Co (Nhật)
- Các loại dụng cụ khác: tube 1,5 ml, típ, bao tay, cối chày nghiền mẫu, beaker, pipet,…
2.3.2 Hóa chất
Hóa chất ly trích DNA: CTAB buffer, chloroform, mercaptoethanol, isopropanol,…
Hóa chất PCR và điện di: PCR buffer, Taq polymerase, dNTP, agarose tinh khiết, ethidium bromide,…
2.3.3 Primer
Bảng 2.2 Trình tự các con mồi được dùng trong thí nghiệm
STT Đăc tính
Nhận diện Tên con mồi Trình tự (5’- 3’)
1 External sense Primer (ESP) TTGTTTGGAGCTTGCTGATG
2 Internal Fragrant Antisense
Primer (IFAP) CATAGGAGCAGCTGAAATATATACC
3 Internal Non-Fragrant sense
Primer (INSP) CTGGTAAAAAGATTATGGCTTCA
4
Tính thơm
External Antisense Primer
(EAP) AGTGCTTTACAAAGTCCCGC
5 Kháng rầy
nâu OPC07 GTCCCGACGA
Forward CCACTTTCAGCTACTACCAG 6 Chịu hạn RM212 Reverse CACCCATTTGTCTCTCATTATG Forward GGACACAAGTCCATGATCCTATCC 7 Kháng mặn RM10825 Reverse CTTTCCTTTCCATCCTTGTTGC
2.4 Phương pháp nghiên cứu 2.4.1 Tách chiết DNA 2.4.1 Tách chiết DNA
Các giống lúa sau khi gieo 2 tuần thì tiến hành thu mẫu lá để ly trích DNA. Phương pháp ly trích và tinh sạch DNA từ mô lá được áp dụng theo Doyle and Doyle (1990).
24
- Cân 100mg/mẫu lá lúa cho vào cối và nghiền với 1000 µl dung dịch CTAB (đã được ủ ở 650 trong 15 phút). Cho hết dung dịch vừa nghiền vào tube mới và thêm 10 µl ME, trộn đều. Sau đó ủ 1 giờ (10 phút lắc trộn mẫu 1 lần). - Sau khi ủ xong cho vào mỗi tube 500µl CI, lắc đều. Ly tâm 13000 vòng/phút
trong 10 phút. Lấy 500µl dung dịch bên trên cho vào tube mới, thêm vào 500µl CI, lắc đều. Ly tâm 13000 vòng trong 10 phút.
- Lấy phần bên trên cho vào tube mới rồi thêm vao 5µl RNase, trộn đều, ủ mẫu ở 370 trong 2 giờ.
- Cho thêm 500µl chloroform, trộn đều. Ly tâm 13000/phút vòng trong 10 phút.
- Lấy phần bên trên cho vào tube mới thêm vào 400µl chloroform. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút.
- Lấy phần dung dịch bên trên cho vào tube mới thêm vào 300µl Isopropanol. Ủ trong ngăn đá 15 phút.
- Ly tâm 13000 vòng trong 10 phút, bỏ dung dịch lấy phần kết tủa. - Rửa 2 lần với ethanol 700, ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút. - Rửa 1 lần với ethanol 1000 ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút.
- Bỏ dung dịch lấy kết tủa và phơi mẫu trong 2 giờ, thêm 30µl TE, trữ mẫu ở - 200C.
2.4.2 Kiểm tra DNA bằng phương pháp điện di agarose
DNA sau khi ly trích và tinh sạch sẽ được kiểm tra bằng cách điện di trên gel agarose 1%.
Cân 0,3g agarose cho vào bình tam giác thêm vào 30ml dung dịch TAE 1X, đậy kín bằng màng bao thực phẩm, lắc đều rồi cho vào microware đun sôi trong 1 phút 40 giây. Trong quá trình đun, 50 giây thì tạm dừng đun, lấy ra lắc nhẹ để agarose tan đều trong TAE. Sau khi đun xong để nguội bớt rồi cho vào bộ khuôn điện di.
Khi agarose đặc lại (sau 15 phút) nhẹ nhàng tháo ra và cho gel vào dung dịch TAE 1X trong bộ điện di, chú ý là dung dịch phải ngậm gel.
Trộn đều mỗi mẫu với 1µl loading dye 6X, 1µl DNA, 4µl nước cất trên giấy parafilm rồi cẩn thận bơm từng mẫu vào giếng trên gel. Chạy điện di mẫu trong 45 phút ở 60V. Lấy gel ra nhuộm trong dung dịch ethidium bromide khoảng 15 phút, rửa lại với nước rồi đem chụp ảnh với máy đọc gel bằng tia UV.
25
2.4.3 Phản ứng PCR
2.4.3.1 Phản ứng PCR với 4 primer ESP, IFLP, INSP, EAP
Phản ứng PCR được tiến hành trong thể tích 20 µl gồm: 14,4 µl nước cất, 2 µl PCR Buffer 10X, 0,4µl dNTPs, 0,2µl Taq polymerase, 1µl DNA và 2µl primer(0,5µl External sense Primer, 0,5µl Internal Fragrant Antisense Primer, 0,5µl Internal Non-Fragrant sense Primer, 0,5µl External Antisense Primer) trong máy GeneAmp PCR system 2700.
Hình 2.1: Vị trí tương đối của đoạn mồi ESP, IFAP, INSP, EAP được sử dụng trong phản ứng PCR.
Phản ứng PCR được thực hiện qua 30 chu kỳ gia nhiệt (Hình 3.1) trên máy PCR như sau: 2 phút ở 940C; 30 chu kỳ gồm 30 giây ở 940C, 30 giây ở 580C, 30 giây ở 720C; 5 phút ở 720C. Sản phẩm được trữ ở 40C.
Hình 2.2 Sơ đồ minh họa chu kỳ phản ứng PCR với primer ESP, IFAP, INSP, EAP
2.4.3.2 Phản ứng PCR với primer OPC07
Phản ứng PCR được tiến hành trong thể tích 15 µl gồm: 11,6 µl nước cất, 1,5 µl PCR Buffer 10X, 0,4 µl dNTPs, 0,15 µl Taq polymerase, 1 µl DNA, 0,4 µl OPC07 primer của con mồi trong máy GeneAmp PCR system 2700.
577 bp or 585 bp 355 bp 257 bp INSP IFAP 2:00 94,0 0:30 5:00 94,0 58,0 0:30 72,0 72,0 4,0 0:30 30 chu kỳ Nhiệt độ (0C) Thời gian (phút:giây)
26
Phản ứng PCR được thực hiện qua 30 chu kỳ gia nhiệt (Hình 3.1) trên máy PCR như sau: 5 phút ở 950C; 30 chu kỳ gồm 30 giây ở 940C, 30 giây ở 400C, 30 giây ở 720C; 5 phút ở 720C. Sản phẩm được trữ ở 40C.
Hình 2.3 Sơ đồ minh họa chu kỳ phản ứng PCR với primer OPC07
2.4.3.3 Phản ứng PCR với primer RM212
Phản ứng PCR được tiến hành trong thể tích 20 µl gồm: 15,4 µl nước cất, 2