Phản ứng PCR được tiến hành trong thể tích 20 µl gồm: 14,4 µl nước cất, 2 µl PCR Buffer 10X, 0,4µl dNTPs, 0,2µl Taq polymerase, 1µl DNA và 2µl primer(0,5µl External sense Primer, 0,5µl Internal Fragrant Antisense Primer, 0,5µl Internal Non-Fragrant sense Primer, 0,5µl External Antisense Primer) trong máy GeneAmp PCR system 2700.
Hình 2.1: Vị trí tương đối của đoạn mồi ESP, IFAP, INSP, EAP được sử dụng trong phản ứng PCR.
Phản ứng PCR được thực hiện qua 30 chu kỳ gia nhiệt (Hình 3.1) trên máy PCR như sau: 2 phút ở 940C; 30 chu kỳ gồm 30 giây ở 940C, 30 giây ở 580C, 30 giây ở 720C; 5 phút ở 720C. Sản phẩm được trữ ở 40C.
Hình 2.2 Sơ đồ minh họa chu kỳ phản ứng PCR với primer ESP, IFAP, INSP, EAP
2.4.3.2 Phản ứng PCR với primer OPC07
Phản ứng PCR được tiến hành trong thể tích 15 µl gồm: 11,6 µl nước cất, 1,5 µl PCR Buffer 10X, 0,4 µl dNTPs, 0,15 µl Taq polymerase, 1 µl DNA, 0,4 µl OPC07 primer của con mồi trong máy GeneAmp PCR system 2700.
577 bp or 585 bp 355 bp 257 bp INSP IFAP 2:00 94,0 0:30 5:00 94,0 58,0 0:30 72,0 72,0 4,0 0:30 30 chu kỳ Nhiệt độ (0C) Thời gian (phút:giây)
26
Phản ứng PCR được thực hiện qua 30 chu kỳ gia nhiệt (Hình 3.1) trên máy PCR như sau: 5 phút ở 950C; 30 chu kỳ gồm 30 giây ở 940C, 30 giây ở 400C, 30 giây ở 720C; 5 phút ở 720C. Sản phẩm được trữ ở 40C.
Hình 2.3 Sơ đồ minh họa chu kỳ phản ứng PCR với primer OPC07
2.4.3.3 Phản ứng PCR với primer RM212
Phản ứng PCR được tiến hành trong thể tích 20 µl gồm: 15,4 µl nước cất, 2 µl PCR Buffer 10X, 0,4 µl dNTPs, 0,2 µl Taq polymerase, 1 µl DNA, 0,5 µl H và 0,5 µl T của con mồi trong máy GeneAmp PCR system 2700.
Phản ứng PCR được thực hiện qua 30 chu kỳ gia nhiệt (Hình 3.1) trên máy PCR như sau: 5 phút ở 940C; 30 chu kỳ gồm 30 giây ở 940C, 30 giây ở 570C, 30 giây ở 720C; 5 phút ở 720C. Sản phẩm được trữ ở 40C.
Hình 2.4 Sơ đồ minh họa chu kỳ phản ứng PCR với primer RM212
2.4.3.4 Phản ứng PCR với primer RM10825
Phản ứng PCR được tiến hành trong thể tích 20 µl gồm: 15,4 µl nước cất, 2 µl PCR Buffer 10X, 0,4 µl dNTPs, 0,2 µl Taq polymerase, 1 µl DNA, 0,5 µl H và 0,5 µl T của con mồi trong máy GeneAmp PCR system 2700.
Phản ứng PCR được thực hiện qua 30 chu kỳ gia nhiệt (Hình 3.1) trên máy PCR như sau: 5 phút ở 940C; 30 chu kỳ gồm 30 giây ở 940C, 30 giây ở 620C, 30 giây ở 720C; 5 phút ở 720C. Sản phẩm được trữ ở 40C. 0:30 5:0 72,0 72,0 4,0 60,0 0:30 30 chu kỳ 5:0 94,0 94,0 0:30 Nhiệt độ (0C) Thời gian (phút:giây) Nhiệt độ (0C) Thời gian (phút:giây) 5:00 95,0 95,0 0:30 40,0 0:30 30 chu kỳ 0:30 5:00 72,0 72,0 4,0
27
Hình 2.5 Sơ đồ minh họa chu kỳ phản ứng PCR với primer RM10825
2.4.4 Điện di sản phẩm PCR
- Điện di trên gel agarose
Sản phẩm PCR với việc sử dụng 4 primer (ESP, IFLP, INSP, EAP) và OPC07 được điện di trên gel agarose 1.5% trong dung dịch TAE 1X bằng máy điện di với hiệu điện thế như sau: 30 phút đầu ở hiệu điện thế 42V, 35 phút sau ở hiệu điện thế 60V. Nhuộm gel khoảng 15 phút trong ethidium bromide (1 mg/L), rửa lại với nước rồi đem chụp ảnh gel bằng máy chụp ảnh trên máy chiếu tia UV. Sự hiện diện của các băng được khuếch đại trên gel agarose sẽ đánh giá sự tồn tại của gen thơm và gen kháng rầy trên lúa.
- Điện di trên gel polyAcrylamide
Sản phẩm PCR với primer RM212 và RM10825 được chạy điện di trên gel PolyArylamide trong dung dịch TBE 0,5% bằng máy ATTA Compact PAGE-twin với thời gian 60 phút ở hiệu điện thế 24V. Nhuộm gel khoảng 15 phút trong ethidium bromide (10 mg/L), rửa lại với nước rồi đem chụp ảnh gel bằng máy chụp ảnh trên máy chiếu tia UV. Sự hiện diện của các băng được khuếch đại trên gel acrylamide sẽ đánh giá sự tồn tại của gen chịu hạn trên lúa.
4,0 5:0 94,0 0:30 94,0 0:30 62,0 0:30 72,0 72,0 Nhiệt độ (0C) Thời gian (phút:giây) 30 chu kỳ 7:0
28
Chương 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Ly trích DNA
Kết quả điện di DNA trên gel agarose cho thấy hầu hết các DNA được ly trích đều có mức độ tinh sạch chấp nhận được, tuy nhiên một số mẫu chưa thực sự tốt như: giếng 1,2,3 và 12 có hiện tượng DNA bị nhiễm bẩn và RNA hoặc DNA bị đứt gãy nhiều hơn các giếng khác (hình 3.1). Do thao tác, thời gian thu mẫu đến lúc ly trích quá lâu.
Hình 3.1 Kết quả diện di kiểm tra DNA bằng agarose gel 1%
3.2 Nhận diện gen thơm với 4 primer ESP, IFAP, INSP và EAP
Các đoạn mồi ESP và EAP bắt cặp tại các trình tự chung của cả hai giống lúa thơm và không thơm tại vị trí 580 bp(băng ở vị trí thứ nhất). Hai đoạn mồi ESP và IFAP cho ra sản phẩm tại vị trí 257 bp đối với các dòng lúa thơm đồng hợp tử, trong khi hai đoạn mồi INSP và EAP khuếch đại được một đoạn 355 bp đối với các dòng lúa không thơm đồng hợp tử. Ở các giống lúa không thơm dị hợp tử sẽ xuất hiện cả băng 3 nêu trên (Bradbury ctv. 2005).
Kết quả ở hình 3.2 cho thấy, trong tổng số 13 giống lúa có 4 giống được nhận diện có mang gen thơm, 7 giống nhận diện không có gen thơm và 2 giống thuộc dạng dị hợp tử không thơm. Những giống lúa mang gen thơm có băng ở vị trí thứ hai là 257 bp: Jakouine, OM6161, OM6162, Jasmine 85. Trong khi đó những giống không mang gen thơm cho ra băng ở vị trí thứ hai là 355 bp là Bala Baghman, Pashadi Laghman, Surjamkhi, Nàng thơm Chợ Đào 1, Izayoi và Luke Andrab. Bên cạnh đó những giống lúa không thơm dị hợp tử cho ra 3 băng ở vị trí 257 bp, 355 bp và 580 bp: OM6600 và Cần Thơ 2.
29
Hình 3.2 Phổ điện di sản phẩm PCR của DNA 13 giống lúa với primer ESP, IFAP, INSP và EAP
M: ladder 1kb, 1: Bala Baglan, 2: Monda Laghman, 3: Pashadi Laghman, 4: Surjamkhi, 5: Nàng thơm Chợ Đào 1, 6: Izayoi, 7: Jakouine, 8: OM6161, 9: OM6162, 10: OM6600, 11: Cần Thơ 2, 12:
Jasmine 85, 13: Luke Andrab
Hien ctv. (2006) đã tiến hành phân nhóm các giống được thu thập tại Việt Nam, trong đó Nàng thơm Chợ Đào được chia thành ba nhóm Nàng thơm Chợ Đào 1, Nàng thơm Chợ Đào 2, Nàng thơm Chợ Đào 3 và Nàng thơm Chợ Đào 4 dựa trên việc tuyển chọn về đặc điểm hình thái, nông học và hương thơm. Trong nghiên cứu đó họ đã sử dụng KOH 1,7% đã kiểm tra và cho kết quả không thơm ở giống Nàng thơm Chợ Đào 1. Nguyên nhân là do địa điểm thu giống của 4 nhóm khác nhau và do mục đích thương mại nên Nàng thơm Chợ Đào 1 đã bị lẫn tạp.
Với bộ primer này, đã có rất nhiều nhà khoa học và nhà chọn giống trong và ngoài nước tiến hành nghiên cứu. Sarhadi và Hien, (2011) đã sử dụng bộ primer này để nhận diện thành công các giống lúa thơm Pashadi Konar, Sarda Bala, Sela Doshi, Pashadi Konar, Germa Bala, Lawangi, Fajr, Qaserdashti và Qaserdashti các giống lúa này được thu thập tại nhiều quốc gia ở châu Á.
3.3 Nhận diện gen kháng rầy với primer OPC07
Kết quả quan sát trên phổ điện di hình 3.3 cho thấy có 7 giống (Bala Baglan, Monda Laghman, Nàng thơm Chợ Đào 1, Jakouine, OM6161, OM6162, Luke Andrab) trong tổng 13 giống lúa có xuất hiện băng ở vị trí 697 bp, theo Venkateswarlu (2012) những giống lúa có sự hiện diện của băng 697 bp, thì có mang gen kháng rầy nâu. Những giống lúa có sự hiện diện của băng 846 bp: Surjamkhi, Izayoi, Cần Thơ 2, Jasmine 85 là những giống nhiễm rầy, không mang gen kháng. Tuy nhiên, 2 giống Pashadi Laghman, OM6600 không có sự hiện diện của băng nào, có thể là do primer OPC7 không thể bắt cặp với gen của hai giống lúa này. M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 - - - - - - + + + - - + - 600 bp 500 bp 400 bp 300 bp 200 bp 580 bp 355 bp 257 bp
30
Theo Venkateswarlu và ctv. (2012), đã chỉ ra một sự phân chia đa hình rõ ràng giữa các cá thể nhạy cảm và cá thể kháng liên quan đến gen kháng rầy nâu trong phân tích quần thể trồng dồn phân ly. Như vậy, phân tích quần thể trồng dồn phân ly với RAPD marker OPC07 các cá thể nhiễm rầy cho ra sản phẩn ở vị trí 846 bp và cá thể kháng có sản phẩm ở vị trí 697 bp cung cấp các lựa chọn trợ giúp tuyển chọn các cá thể của trong quần thể F2 IR50/pTb33, cho thấy rằng kết quả thực hiện trong thí nghiệm trên phù hợp với kết quả này.
Hình 3.3 Phổ điện di sản phẩm PCR của 13 giống lúa sử dụng primer OPC07
M: ladder 1kb Plus, 1: Bala Baglan, 2: Monda Laghman, 3: Pashadi Laghman, 4: Surjamkhi,5: Nàng thơm Chợ Đào 1, 6: Izayoi, 7: Jakouine, 8: OM6161, 9: OM6162, 10: OM6600, 11: Cần Thơ
2, 12: Jasmine 85, 13: Luke Andrab
3.4 Nhận diện gen chịu hạn với primer RM212
Kết quả quan sát trên phổ điện di hình 3.4 cho thấy có 10 giống có khả năng mang gen chịu hạn là Bala Baglan, Pashadi Laghman, Surjamkhi, Izayoi, OM6161, OM6162, OM6600, Cần Thơ 2, Jasmine 85 vì các giống này có xuất hiện băng ở vị trí 136 bp. Theo Zhu ctv. (2013), ông cho rằng nếu các giống lúa được nhận diện bằng cặp mồi RM212 và xuất hiện của băng ở vị trí 136 bp thì có khả năng mang gen chịu hạn. Ba giống xuất hiện băng ở vị trí 154 bp: Monda Laghman, Nàng thơm Chợ Đào 1, Jakouine không mang gen chịu hạn. Theo Kanagaja ctv. (2010) cho thấy rằng dấu phân tử RM212 liên kết với gen liên quan đến tính trạng cuộn lá khi gặp điều kiện hạn, đó là đặc tính quan trọng cho những giống lúa có khả năng chịu hạn.
Đặc biệt đối với 2 giống Pashadi Laghman và OM6600 không có sản phẩm nào, có thể là do các nguyên nhân sau: primer OPC07 không thể tìm được vị trí bắt cặp với gen của 2 giống lúa này.
1000 bp 500 bp 400 bp M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 + + 0 - + - + + + 0 - - + 846 bp 697 bp
31
Hình 3.4 Phổ điện di sản phẩm PCR của 13 giống lúa và 1 đối chứng bằng cặp mồi RM212
M: ladder 1kb Plus, 1: Bala Baglan, 2: Monda Laghman, 3: Pashadi Laghman, 4: Surjamkhi, 5: Nàng thơm Chợ Đào 1, 6: Izayoi, 7: Jakouine, 8: OM6161, 9: OM6162, 10: OM6600, 11: Cần Thơ
2, 12: Jasmine 85, 13: Luke Andrab, 14: VND9520
3.5 Nhận diện gen kháng mặn với Primer RM10825
Kết quả phân tích phổ điện di hình 3.5 sản phẩm PCR từ cặp mồi RM10825 cho thấy sự xuất hiện của 3 băng DNA đa hình. Trong đó 8 gống là Pashadi Laghman, Surjamkhi, Jakouine, OM6162, OM6600, Cần Thơ 2, Luke Andrab này xuất hiện ở vị trí 137 bp cùng vị trí với Pokkali nên có khả năng mang gen chịu mặn. Có 4 gống Monda, Laghman, Nàng thơm Chợ Đào 1, Jasmine 85 hiện diện băng ở vị trí 181 bp đồng vị trí với IR28 nên mang gen nhiễm mặn. Kết quả này phù hợp với kết quả của Michael (2010) cho rằng các giống có xuất hiện băng ở vị trí 137 bp cùng vị trí với Pokkali có khả năng mang gen chịu mặn. Những giống xuất hiện băng ở vị trí 181 bp đồng vị trí với IR28 mang gen nhiễm mặn. Đối với hai giống Bala Baglan, Izayoi không xuất hiện băng ở vị trí 137 bp mà xuất hiện băng ở vị trí 125 bp nên không có khả năng mang gen kháng mặn.
Hình 3.5 Phổ điện di sản phẩm PCR của 13 giống lúa và 2 đối chứng bằng cặp mồi RM10825
M: ladder 1kb Plus, 1: Bala Baglan, 2: Monda Laghman, 3: Pashadi Laghman, 4: Surjamkhi, 5: Nàng thơm Chợ Đào 1, 6: Izayoi, 7: Jakouine, 8: OM6161, 9: OM6162, 10: OM6600, 11: Cần Thơ
2, 12: Jasmine 85, 13: Luke Andrab, 14: Pokkali, 15: IR28
+ - + + - + - + + + + + + + +
M 1 2 3 4 5 6 7 8 14 M 9 10 11 12 13 14
200 bp
100 bp 136 bp
+ - - - + + - - + + - + + + + - +
M 14 15 1 2 3 4 5 6 7 M 14 15 8 9 10 11 12 13
200 bp
100 bp
181 bp
137 bp
32
3.6 Kết quả nhận diện dấu phân tử đối với các tính trạng thơm, kháng rầy, chịu hạn, chịu mặn chịu hạn, chịu mặn
Bảng 3.1 Tổng hợp kết quả phân tích phổ điện di với các tính trạng thơm, kháng rầy, chịu hạn, chịu mặn
STT Tên giống Thơm Kháng rầy Chịu hạn Kháng mặn
1 Bala Baglan - + + + 2 Monda Laghman - + - - 3 Pashadi Laghman - 0 + - 4 Surjamkhi - - + - 5 Nàng thơm Chợ Đào 1 - + - + 6 Izayoi - - + + 7 Jakouine + + - - 8 OM6161 + + + + 9 OM6162 + + + + 10 OM6600 - 0 + + 11 Cần Thơ 2 - - + + 12 Jasmine 85 + - + - 13 Luke Andrab - + + +
- Dựa vào kết quả tổng hợp ở Bảng 3.1 cho thấy giống OM6162 và OM6161 cả hai đều có khả năng mang gen chịu hạn, kháng mặn, kháng rầy và mang gen thơm 2AP.
- Có 2 giống Bala Baglan, Luke Andrab là hai giống lúa không mang gen thơm 2AP nhưng có khả nang mang gen kháng rầy nâu, chịu hạn và kháng mặn. - Có 3 giông có khả năng mang gen chịu hạn và kháng mặn: Izayoi, OM6600,
Cần Thơ 2.
- Đối với giống Nàng thơm Chợ Đào 1 tuy không mang gen thơm 2AP nhưng có khả năng mang gen kháng rầy nâu và kháng mặn.
33
- Hai giống Jakouine và Jasmine 85đều có mang gen thơm nhưng có khả năng mang gen kháng rầy nâu chỉ có ở giống Jakouine còn Jasmine 85 thì không có gen kháng rầy nâu và không mang gen kháng mặn nhưng mang gen chịu được hạn.
- Giống Pashadi Laghman, Surjamkhi chỉ có khả năng mang gen chịu hạn. - Còn lại giống Monda Laghman chỉ có thể mang gen kháng rầy nâu.
34
Chương 4
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
4.1 Kết luận
Đã nhận diện được 4 giống lúa mang gen thơm là Jakouine, OM6161, OM6162, Jasmine 85 trong tổng số 13 giống. Chín giống còn lại: Bala Baglan, Monda Laghman, Pashadi, Laghman, Surjamkhi, Nàng thơm Chợ Đào 1, Izayoi, OM6600, Cần Thơ 2, Luke Andrab không mang gen thơm bằng Primer ESP, IFAP, INSP và EAP.
Có 7 giống trong 13 giống lúa đã được nhận diện có khả năng mang gen kháng rầy nâu: Bala Baglan, Monda Laghman, Nàng thơm Chợ Đào 1, Jakouine, OM6161, OM6162, Luke Andrab với primer OPC7.
Đã nhận diện được 10 giống lúa có khả năng mang gen chịu hạn: Bala Baglan, Pashadi Laghman, Surjamkhi, Izayoi, OM6161, OM6162, OM6600, Cần Thơ 2, Jasmine 85 với việc sử dụng con mồi RM212.
Với việc sử dụng primer RM10825, đã nhận diện được 8 giống có khả năng mang gen kháng mặn: Pashadi Laghman, Surjamkhi, Jakouine, OM6162, OM6600, Cần Thơ 2, Luke Andrab. Các giống còn lại không xuất hiện band ở vị trí 137 bp nên không có khả năng mang gen kháng mặn bằng Primer RM10825.
4.2 Đề nghị
- Sử dụng các chỉ thị phân tử chuyên biệt này để phục vụ cho công tác chọn giống, rút ngắn được thời gian và hiệu quả nhất.
- Đưa những giống đã được nhận diện vào chương trình chọn giống lúa có phẩn chất cao và có khả năng chống chịu với môi trường.
- Đối với hai đặc tính kháng mặn và chịu hạn cũng nên kiểm tra lại đặc tính tốt này bằng phương pháp thử hạn và thử mặn.
- Nên tiến hành thí nhiều nghiệm trong điều kiện ngoài đồng kết hợp với việc thống kê và so sánh, đánh giá lại sự tương thích giữa việc sử dụng đánh dấu phân tử so với điều kiện thực tế.
35
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
Hiệp hội Lương thực Việt Nam, (2011). Số liệu thống kê - Nông nghiệp http://vietfood.org.vn/vn/default.aspx?c=74&n=5900.
Nguyễn Ngọc Đệ (2008). Giáo trình cây lúa, Trường Đại Học Cần Thơ.
Nguyễn Thị Lang và Bùi Chí Bửu (2004a). Ứng dụng marker phân tử đánh dấu gen
mùi thơm trên lúa, Tại chí Di truyền học và ứng dụng, số 2 năm 2004.
Nguyễn Thị Lang và Bùi Chí Bửu (2004b). Xác định gen fgr điều khiển tính trạng mùi thơm bằng phương pháp Fine Mapping với Microseltellites, Hội nghị quốc gia về chọn tạo giống lúa, nhà xuất bản Nông Nghiệp TP.HCM, tr. 192- 199.
Nguyễn Thị Lang và Bùi Chí Bửu (2004c). Nghiên cứu di truyền tính kháng rầy nâu
