Báo cáo đề tài nghiên cứu khao học sinh viên: Khảo sát đa dạng di truyền và xác lập chỉ thị phân tử cho việc nhận dạng một số dòng Bơ (Persea americana miller) đã qua sơ bộ tuyển chọn tại Lâm Đồng được nghiên cứu nhằm bổ sung cho cơ sở dữ liệu nhận dạng dòng đối với cây trưởng thành cũng như ngay từ giai đoạn vườn ươm; tạo cơ sở cho chiến lược chọn tạo và phát triển giống.
Trang 1TRƯỜNG Đ I H C ĐÀ L TẠ Ọ Ạ
KHOA SINH H C Ọ
Trang 2Giáo viên h ướ ng d n: ẫ LÊ NG C TRI U Ọ Ệ
Sinh viên th c hi n: ự ệ NGUY N HOÀNG PHONG Ễ (CSK 38)
NGUY N THANH TI N (CSK 38) Ễ Ề MAI TI N Đ T (CSK 39) Ế Ạ
Trang 3 B là m t lo i cây ăn qu có giá tr kinh t cao, có ti m năng phát triên ơ ộ ạ ả ị ế ề ở Lâm Đ ng ồ Đã có nhi u ch ng gi ng b đ ề ủ ố ơ ượ c tr ng n i đây nh ng c ồ ơ ư ơ
s d li u cho vi c nh n d ng, ch n t o và công nh n gi ng còn ch a ở ữ ệ ệ ậ ạ ọ ạ ậ ố ư hoàn thi n, ệ c n ph i đ ầ ả ượ c nghiên c u ứ thêm. Tr ướ c m t c n tri n khai ặ ầ ể ghi nh n đ c đi m s b v hình thái qu và năng su t c a các dòng b ậ ặ ể ơ ộ ề ả ấ ủ ơ đang đ ượ c phát tri n; đánh giá đa d ng di truy n t p đoàn này và xác l p ể ạ ề ậ ậ
ch th phân t cho vi c nh n d ng các dòng b ti m năng ỉ ị ử ệ ậ ạ ơ ề nh m: ằ
B sung cho c s d li u nh n d ng dòng đ i v i cây tr ổ ơ ở ữ ệ ậ ạ ố ớ ưở ng thành cũng nh ngay t giai đo n v ư ừ ạ ườ ươ n m.
T o c s cho chi n l ạ ơ ở ế ượ c ch n t o và phát tri n gi ng ọ ạ ể ố
Đó là lý do đ tài này đ ề ượ c đăng ký và tri n khai ể th c hi n ự ệ .
Trang 4V t li u: ậ ệ
Qua kh o sát ban đ u, có nhi u dòng/gi ng b nh p n i và đ ả ầ ề ố ơ ậ ộ ượ c ch n t o trong ọ ạ
n ướ c đ ượ c canh tác t i Lâm Đ ng. Tuy v y có 11 dòng b đ ạ ồ ậ ơ ượ c ch n t o trong ọ ạ
n ướ c đang đ ượ c phát tri n. Đây là đ i t ể ố ượ ng nghiên c u chính c a đ tài ứ ủ ề
Trong đó, 06 dòng c n đ ầ ượ c xác l p ch th phân t ậ ỉ ị ử, g m: ồ
04 05
H i tri u 1ả ề
H i Tri u 2ả ề
34 36
H i tri u 1ả ề
H i Tri u 2ả ề
34 36
34 lai HO TO BM00 BM02
Trang 5N i dung, ộ ph ươ ng pháp và k t qu nghiên ế ả
+ Đ c đi m qu : màu s c, đ dày v , ch t lặ ể ả ắ ộ ỏ ấ ượng th t qu , kích ị ả
thước h t, tr ng lạ ọ ượng và hình d ng chung c a qu ạ ủ ả
+ Đ c đi m năng su tặ ể ấ
thông qua các phi u h i.ế ỏ
Trang 8DÒNG B 34Ơ
Đ a ch thu m u: khu 4 – Phị ỉ ẫ ường B’Lao – B o L c.ả ộ
Năng su t: kho ng 300kg/cây/năm ấ ả
Chín v da màu xanh thuôn dài, c m vàng, h t bé ( có trái không h t ) ỏ ơ ạ ạ Chi u dài qu t 25 cm đ n 35 cm ề ả ừ ế
Kh i l ố ượ ng qu t 300g đ n 800g ả ừ ế
Trang 9DÒNG B 34 LAI Ơ
Đ a ch thu m u: ị ỉ ẫ Trang tr i gi ng b H i Tri u – Đambri –ạ ố ơ ả ề
B o L cả ộ
Năng su t: kho ng ấ ả 250kg/cây/năm
Khi chín v qu có màu xanh, qu ỏ ả ả h i trònơ
H t trung bình, không dính vạ ỏ
Trang 16N i dung 2: Tách chi t, ki m tra n ng đ và ch t lộ ế ể ồ ộ ấ ượng DNA
DNA t m u lá đ ừ ẫ ượ c tách chi t theo quy trình CTAB I có c i ti n ế ả ế (b sung SDS ổ 10% vào đ m chi t) ệ ế
DNA sau tách chi t ế đ ượ c ki m tra n ng đ và ch t l ể ồ ộ ấ ượ ng b ng ph ằ ươ ng pháp ki m tra m t đ quang ể ậ ộ ở các b ướ c sóng 260nm và 280nm
Trang 17N i dung ộ 3: Làm n y sinh đ c ả ặ tr ng ư nh n d ng DNA ậ ạ d a trên ự
PCR
Ph ươ ng pháp:
S d ng k thu t ISSR (Khu ch đ i đo n gi a các trình t l p đ n gi n) đ l ử ụ ỹ ậ ế ạ ạ ữ ự ặ ơ ả ể àm
n y sinh đ c ả ặ tr ng ư nh n d ng DNA ậ ạ v i 10 m i đ ớ ồ ượ ử ụ c s d ng sau:
STT Tên m i ồ Trình t ự Ta
( 0 C)
S band ghi nh n ố ậ cho đánh giá đa
d ng di truy n11 ạ ề dòng bơ
S band ghi nh n ố ậ cho vi c xác l p ch ệ ậ ỉ
7 UBC 856C 5'(AC)8 CA3' 52 9 14
8 UBC 856T 5'(AC)8 TA3' 52 11 13
9 UBC 873 5'(GACA)4 3' 52 15 14
10 UBC 859G 5' –(TG)8 GC3' 51,5 2 02
Trang 18Khu ch đ i DNA: ế ạ Ph n ng PCR đ ả ứ ượ c th c hi n v i dung tích 20 µl ự ệ ớ
ch a 2 mM MgCl ứ 2, 0.25 mM m i lo i dNTP, 1U Taq DNA polymerase ỗ ạ (ThermoScientific), 0.2 µM m i và kho ng 30 ng khuôn m u DNA, BSA ồ ả ẫ 0.5%.
Ch ươ ng trình nhi t sau: ệ
94 0 C trong 5 phút;
10 chu k , m i chu k có ti n trình nhi t ỳ ỗ ỳ ế ệ
94 0 C trong 45 giây Nhi t đ b t m i thích h p +5 (T ệ ộ ắ ồ ợ a +5) 0 C (Ta trong b ng trên ả ) trong
45 giâygi m d n 0,5 ả ầ 0 C/chu kỳ
Kéo dài m ch 72 ạ ở 0 C trong 1 phút 30 giây;
36 chu k , m i chu k có ti n trình nhi t ỳ ỗ ỳ ế ệ
94 0 C trong 45 giây Nhi t đ b t m i thích h p (T ệ ộ ắ ồ ợ a) trong 45 giây Kéo dài m ch 72 ạ ở 0 C trong 1 phút 30 giây
B ướ c kéo dài m ch cu i cùng 72 ạ ố ở 0 C trong 15 phút.
(Touchdown PCR)
Đi n di, ch p nh gel:ệ ụ ả S n ph m khu ch đ i đ ả ẩ ế ạ ượ c phân tách trên gel agarose 2%, s d ng đ m TBE v i đi n th 60 Volt, gel sau đi n di đ ử ụ ệ ớ ệ ế ệ ượ c nhu m v i ộ ớ ethidium bromide (0.5 µg/ml), và đ ượ c ch p nh d ụ ả ướ i các ánh sáng c c tím có ự
b ướ c sóng 254/312 nm
Trang 19K t qu : ế ả
nh gel Đ c tr ng nh n d ng DNA ph c v cho
đánh giá đa d ng di truy n 11 dòng b theo 10 m iạ ề ơ ồ
Mồi ISSR 808 Mồi ISSR 844B Mồi ISSR 856C Mồi ISSR 856T
Mồi ISSR 17899B Mồi ISSR HB13 Mồi ISSR
UBC859G
Mồi ISSR UBC873
Mồi ISSR HB14 Mồi ISSR HB9
Ghi chú: 1: dòng 04, 2: dòng 05, 3: dòng H i Tri u 2, 4: dòng H i Tri u 1, 5: dòng ả ề ả ề 34; 6: dòng 36; 7: dòng 34 lai; 8: dòng HO, 9: dòng TO; 10: dòng BM00, 11: dòng BM020.
Trang 20nh gel Đ c tr ng nh n d ng DNA ph c v cho vi c xác l p marker phân
t nh n d ng 06 dòng b theo 10 m i ử ậ ạ ơ ồ
Ghi chú: 1, 2, 3: các m u dòng 04; 4, 5, 6: các m u dòng 05; 7, 8, 9: các m u dòng ẫ ẫ ẫ
H i Tri u 2; 10, 11, 12: các m u dòng H i Tri u 1; 13, 14, 15: các m u dòng 34; ả ề ẫ ả ề ẫ
16, 17, 18: các m u dòng 36 ẫ
D a trên ự s xu t hi n hay v ng m t các band ự ấ ệ ắ ặ trên gel, thi t l p ma tr n ế ậ ậ 0/1
đ đánh giá ể đa d ng và ạ xây d ng marker cho vi c ự ệ nh n d ng ậ ạ dòng
Mồi ISSR 808 Mồi ISSR
844B Mồi ISSR 856C
Mồi ISSR 856T
Trang 21N i dung 4:ộ Đánh giá đa d ng di truy n ạ ề
S d ng phử ụ ương pháp đánh giá đa d ng di truy n trong t p h p m u c a ạ ề ậ ợ ẫ ủ
de Vicente và cs., 2003 v i công c Microsoft Excel, các ch tiêu:ớ ụ ỉ
V i hj là m c đ d h p t c a locus th j, pớ ứ ộ ị ợ ử ủ ứ i là t n s c a allele th ầ ố ủ ứ
i locus th j, ở ứ H e là m c đ d h p trông đ i trung bình cho t t c ứ ộ ị ợ ợ ấ ảcác locus kh o sát và L là t ng s locus. ả ổ ố
Ngoài ra, ph n m m Popgen32 đầ ề ược s d ng đ đánh giá đa d ng ử ụ ể ạ
di truy n t p h p các dòng b kh o sát, hai ch s đa d ng là ch ề ậ ợ ơ ả ỉ ố ạ ỉ
s đa d ng gene (h) và ch s đa d ng Shannon (I) cho t p h p ố ạ ỉ ố ạ ậ ợ
m u thu đẫ ược.
Trang 22K t qu ế ả
S d ng công c Excel v i các công th c nh trình bày nh trên, thu ử ụ ụ ớ ứ ư ư
được k t qu v s đa d ng di truy n t p h p 11 m u kh o sát nh ế ả ề ự ạ ề ậ ợ ẫ ả ưsau:
+ T l ph n trăm band đa hình: ỷ ệ ầ
PPB = 91,84%
+ M c đ d h p trông đ i trung bình:ứ ộ ị ợ ợ
He = 0,3072
S d ng ph n m m Popgen 32, thu đử ụ ầ ề ược k t qu sau:ế ả
+ Ch s đa d ng gene (tỉ ố ạ ương ng v i m c đ d h p trông đ i trung ứ ớ ứ ộ ị ợ ợbình):
h = 0,3072
+ Ch s Shannon: ỉ ố
I = 0,4608
M c đ đa d ng di truy n c a t p h p m u trong nghiên c u này th p ứ ộ ạ ề ủ ậ ợ ẫ ứ ấ
h n so v i các nghiên c u trơ ớ ứ ước đây v i t p h p m u l n h n c a các ớ ậ ợ ẫ ớ ơ ủdòng/gi ng b thu th p t nhi u n i trên th gi i. Đi u này cho th y ố ơ ậ ừ ề ơ ế ớ ề ấ
có th các dòng b để ơ ược phát tri n n i đ a để ộ ị ược kh o sát trên đ a bàn ả ị
t nh Lâm Đ ng có ngu n g c g n nhau.ỉ ồ ồ ố ầ
Trang 23N i dung 5: ộ Xây d ng marker phân t cho vi c nh n d ng ự ử ệ ậ ạ
06 dòng b ti m năng ơ ề
Phương pháp:
D a trên ự K t qu phân tích nh đi n di và ma tr n d li u v s xu t ế ả ả ệ ậ ữ ệ ề ự ấ
hi n/thi u v ng các ệ ế ắ band m t cách đ c bi t ộ ặ ệ trên gel đi n di, h ệ ai ki u ch ể ỉ
th phân t ị ử đ n và kép ơ đ ượ xác đ nh đ nh n d ng các dòng c ị ể ậ ạ
Trang 24m i UBC 856C ồ ; V ng band 280bp m i UBC873 đ ng th i có band 540bp m i ắ ồ ồ ờ ồ
808 ; V ng band 280bp m i UBC873 đ ng th i v ng band 750bp m i 17899B ắ ồ ồ ờ ắ ồ và
thị kép).
+ Nh n d ng dậ ạ òng 05: V ng band 580bp m i HB9 đ ng th i có band 400bp ắ ồ ồ ờ
m i 17899B ồ ; V ng band 580bp m i HB9 đ ng th i có band 400bp m i UBC ắ ồ ồ ờ ồ 856C ; V ng band 580bp m i HB9 đ ng th i có band 540bp m i 808 ắ ồ ồ ờ ồ ; V ng band ắ 580bp m i HB9 đ ng th i v ng band 750bp m i 17899B ồ ồ ờ ắ ồ và V ng band 580bp ắ
+ Nh n d ng dậ ạ òng H i Tri u 2ả ề : V ng band 400bp m i 17899B ắ ồ ; V ng band ắ 400bp m i UBC 856C ồ ; V ng band 540bp m i 808 ắ ồ ; Có band 750bp m i 17899B ồ
và Có band 1500bp m i HB13 ồ (05 ch thỉ ị đ nơ ); Có band 890bp m i HB9 nh ng ồ ư
v ng band 700bp m i 17899B ắ ồ ; V ng band 280bp m i UBC 873 nh ng có band ắ ồ ư
m i UBC 856T ồ (03 ch thỉ ị kép).
Trang 25K t qu ế ả
+ Nh n d ng dậ ạ òng H i Tri u 1ả ề : Có band 790bp m i HB14 đ ng th i ồ ồ ờ
có band 400bp m i 17899B ồ ; Có band 790bp m i HB14 đ ng th i có band ồ ồ ờ 400bp m i UBC 856C ồ ; Có band 790bp m i HB14 đ ng th i có band ồ ồ ờ 540bp m i 808 ồ ; Có band 790bp m i HB14 đ ng th i v ng band 750bp ồ ồ ờ ắ
m i 17899B ồ ; Có band 790bp m i HB14 đ ng th i v ng band 1500bp ồ ồ ờ ắ
m i HB13 ồ và Có band 500bp m i 844B đ ng th i v ng band 700bp m i ồ ồ ờ ắ ồ 17899B (ch có 06ỉ ch thỉ ị kép).
+ Nh n d ng dậ ạ òng 34: Có band 700bp m i 17899B ồ (01 ch ỉthị đ n ơ );
Có band 890bp m i HB9 đ ng th i có band 400bp m i 17899B ồ ồ ờ ồ ; Có band 890bp m i HB9 đ ng th i có band 400bp m i UBC 856C ồ ồ ờ ồ ; Có band 890bp m i HB9 đ ng th i có band 540bp m i 808 ồ ồ ờ ồ ; Có band 890bp m i ồ HB9 đ ng th i v ng band 750bp m i 17899B ồ ờ ắ ồ ; Có band 890bp m i HB9 ồ
+ Nh n d ng dậ ạ òng 36: Có band 220bp m i HB9 ồ (ch có 01 ch th đ n)ỉ ỉ ị ơ
Trang 26K t lu nế ậ
Đã kh o sát tình hình canh tác các dòng b b n đ a t i Lâm Đ ng, ghi ả ơ ả ị ạ ồ
nh n đ c đi m 11 dòng quan tr ng ch y u d a trên đ c đi m qu và ậ ặ ể ọ ủ ế ự ặ ể ảnăng su t. Tuy nhiên d li u thu nh n đấ ữ ệ ậ ược ch là s bỉ ơ ộ đ h tr xây ể ỗ ợ
d ng ự b d li u v đ c đi m dòng/ gi ng cây trộ ữ ệ ề ặ ể ố ở ưởng thành
Đã xác l p đậ ược 9 ch th đ n và 25 ch th kép đ nh n d ng 06 ỉ ị ơ ỉ ị ể ậ ạdòng b ơ ti m năng đề ượ kh o sát. C 6 dòng đ u xác l p đc ả ả ề ậ ược ch th ỉ ịISSR đ nh n d ng. K t qu này có th ng d ng để ậ ạ ế ả ể ứ ụ ược cho vi c nh n ệ ậ
d ng các dòng b ngay t i vạ ơ ạ ườ ươn m
M c đ đa d ng di truy n c a 11 dòng b đứ ộ ạ ề ủ ơ ược kh o sát th p: m c ả ấ ứ
d h p trông đ i đ t 0.3072, ch s Shannon đ t: 0.4608, t l band đa ị ợ ợ ạ ỉ ố ạ ỷ ệhình: 91.84%. Đi u đó cho th y các dòng b đề ấ ơ ược t o gi ng và qua ạ ốtuy n ch n t i Lâm Đ ng có ngu n g c g n nhau.ể ọ ạ ồ ồ ố ầ