Mẫu DNA:
Mẫu DNA đƣợc ly trích từ nhiều bộ phận khác nhau của đối tƣợng nghiên cứu bằng nhiều phƣơng pháp khác nhau. Đối với DNA thực vật thƣờng đƣợc ly trích từ mô lá, DNA động vật đƣợc ly trích từ máu, lông, mô …
Trong kỹ thuật PCR, yêu cầu về độ tinh sạch của DNA mẫu không cần cao. Tuy nhiên để thu đƣợc kết quả tốt nhất nên sử dụng DNA mẫu thực sự tinh khiết.
Số lƣợng DNA cần cho một phản ứng PCR khoảng 5-10 ng DNA thuần khiết. Nồng độ DNA có thể xác định đƣợc nhờ sự đo OD (mật độ quang) ở độ dài sóng 260nm. Khi DNA tinh khiết, lƣợng DNA đƣợc tính theo công thức :
- 1 OD260nm = 50 ng/ l (đối với DNA sợi kép). - 1 OD260nm = 40 ng/ l (đối với DNA sợi đơn). Primer (mồi):
Là một đoạn acid nucleid có trình tự liên kết đặc hiệu với đoạn DNA cần khuếch đại. Phản ứng PCR sử dụng một cặp primer đặc hiệu bao gồm F-primer (mồi xuôi) và R-primer (mồi ngƣợc).
Cặp primer quyết định sự thành công của kỹ thuật PCR. Nếu primer đƣợc thiết kế đúng thì đoạn DNA đích sẽ đƣợc khuếch đại chính xác.
dNTP (dATP, dCTP, dTTP, dGTP):
Nồng độ dNTPs thƣờng đƣợc sử dụng là 20 - 200 μM. Nồng độ cao hơn dễ dẫn đến sự khuếch đại “ký sinh". Bên cạnh đó, sự cân bằng trong thành phần các dNTPs cũng ảnh hƣởng đến phản ứng PCR. dATP, dCTP, dTTP, dGTP đƣợc sử dụng với nồng độ nhƣ nhau. Sự mất cân bằng trong thành phần các dNTPs sẽ làm tăng các lỗi sao chép của DNA polymerase.
Nồng độ dNTPs thích hợp nhất cho một phản ứng PCR còn phụ thuộc vào nồng độ Mg2+, nồng độ primer, số lƣợng chu kỳ của phản ứng và chiều dài của sản phẩm đƣợc khuếch đại. Vì thế, nồng độ dNTPs tối ƣu cho từng phản ứng phải đƣợc xác định qua thực nghiệm
Dung dịch buffer:
Tạo môi trƣờng thuận thích hợp nhất để Taq polymerase hoạt động. Taq polymerase:
Ban đầu, khi chƣa sử dụng loại enzyme Taq - polymerase ngƣời ta phải thêm DNA polymerase trong từng chu kỳ nhân bản, vì DNA polymerase cần cho quá trình tổng hợp DNA nhƣng không chịu đƣợc nhiệt độ lớn hơn 900 C ở giai đoạn tách hai sợi của phân tử DNA. Năm 1988, Taq polymerase đƣợc phát hiện. Đây là một
DNA polymerase bền với nhiệt, đƣợc cô lập từ vi khuẩn Thermus aquaticus sống ở suối nƣớc nóng, với enzyme này chỉ cần cho một lần Taq polymerase là đủ.
Nồng độ Taq polymerase đƣợc sử dụng thông thƣờng là 0.5 - 5 đơn vị/100μl dung dịch phản ứng. Nếu nồng độ Taq quá cao, những sản phẩm không chuyên tính có thể xuất hiện làm sai lệch kết quả. Nếu nồng độ Taq quá thấp, chúng ta sẽ không có đủ số lƣợng men để xúc tác tạo ra sản phẩm PCR theo ý muốn.
Trong phản ứng PCR thì Taq polymerase có khuynh hƣớng thêm một
nucleotide loại “A” vào đầu tận cùng 3’ của sản phẩm PCR, điều này rất quan trong trong việc tạo dòng (TA - cloning) và nó sẽ bị loại thải đi nếu sự gắn kết xảy ra ở đầu tận cùng là đầu bằng (blunt end ligation). Ngoài ra có thể làm gia tăng hoạt tính của Taq polymerase bằng cách sử dụng kết hợp với một số enzyme khác: Tli hoặc Pfu. Sử dụng Tli, Pfu và một số enzyme polymerase khác.
Ion kim loại Mg++:
Tạo điều kiện thuận lợi cho Taq polymerase hoạt động.
2.4.3 Nguyên tắc của phản ứng PCR
Phản ứng PCR thƣờng đƣợc thực hiện qua 25-35 chu kỳ. Mỗi chu kỳ bao gồm các bƣớc: denature (biến tính DNA), annealing (gắn mồi), extension (kéo dài).
Giai đoạn denature: tiến hành ở nhiệt độ từ 94 - 96 oC, trong 60 giây (thời gian có thể dài hoặc ngắn hơn tùy theo độ dài DNA mẫu). Đây là bƣớc làm biến tính DNA mẫu từ sợi kép thành sợi đơn dƣới tác dụng của nhiệt độ.
Giai đoạn annealing: 50 – 60 oC, 30 giây. Đây là bƣớc primer gắn đặc hiệu vào sợi DNA đích ( ở dạng sợi đơn). Nhiệt độ trong bƣớc này tùy thuộc vào độ dài của cặp primer.
Giai đoạn Extension: 72oC, 60 – 90 giây. Đây là bƣớc kéo dài primer nhờ hoạt động của Taq polymerase. Nhiệt độ 72oC hoạt động của Taq polymerase đạt
hiệu quả tối ƣu.
Sau 25 -35 chu kỳ, phản ứng tiếp tục giai đoạn ủ ở 72oC trong 5 - 15 phút để hoàn thiện các sản phẩm PCR.