3.1.1 Thời gian thực hiện
Đề tài đƣợc thực hiện từ 03/2007 đến 08/2007
3.1.2 Địa điểm thực hiện
Mẫu lá các dòng Keo lá tràm đƣợc thu thập tại Trạm thực nghiệm lâm nghiệp Bàu Bàng(Tỉnh Bình Dƣơng ) của Viện khoa học lâm nghiệp Việt Nam.
Mẫu lá đƣợc phân tích tại Phân viện Nghiên cứu khoa học kĩ thuật lâm nghiệp Nam Bộ và Trung tâm Công nghệ sinh học TP.Hồ Chí Minh.
3.2 Vật liệu thí nghiệm
Thu thập các dòng Keo lá tràm khác nhau (xem phụ lục).
Cách lấy mẫu: Mẫu lá tƣơi đƣợc lấy tại rừng trên những cây có đánh dấu số dòng khác nhau, cho vào túi nylon, đánh dấu mẫu và đƣa về trữ trong tủ lạnh để tiến hành ly trích DNA.
Nguyên tắc thu thập mẫu: Thu thập lá non của các dòng Keo lá tràm có kí số khác nhau.
3.3 Phƣơng pháp thí nghiệm
Trên cơ sở của các thông tin thu thập trong và ngoài nƣớc, chỉ thị phân tử SSR(Microsatellite) đƣợc chọn để sử dụng trong nghiên cứu này do bởi :
Chỉ thị này xuất hiện rải rác trên genome của sinh vật và cho độ đa hình lớn. Chỉ thị đồng trội nên dễ phát hiện.
Đơn giản nhƣng cho hiệu quả phân tích cao
Ngoài ra, theo một số nghiên cứu kết quả do SSRs mang lại khi phân tích các loài Keo cho kết quả phân tích cao hơn và có tính chính xác cao hơn so với những chỉ thị phân tử khác. Ví dụ : hiệu quả cao hơn RAPD khoảng 7lần (Kraic và cộng tác viên, 1998) và cao hơn 3lần so với RFLP (Butcher và cộng tác viên, 2000).
3.4 Thiết bị và dụng cụ
Chày và cối (Đức).
Bình và khay đựng Nitơ lỏng. Cân điện tử (Ohaus - Mỹ). Bồn ủ nhiệt (Memmert-Anh). Tủ lạnh 4oC và -20oC.
Máy Vortex (IKA - Đức).
Máy hút và tủ cấy vô trùng (Việt Nam /Anh). Máy vi ly tâm lạnh (Hettich - Đức).
Nồi hấp Autoclave (ToMy - Nhật Bản). Lò Viba (Electrolux).
Tủ sấy (Jencons-Anh). Máy điện di (Biorad).
Máy chụp ảnh DNA (Biorad - Thụy Điển). Đầu típ các loại (Đức).
Pipet các loại (Nichiryo – Nhật Bản). Máy PCR (BioRad – Thụy Điển). Tủ lạnh các loại (Sanyo - Nhật Bản). Eppendorf các loại(Pháp).
3.5 Ly trích DNA 3.5.1 Hóa chất
Các hóa chất sử dụng trong thí nghiệm đƣợc liệt kê trong Bảng 3.1
Bảng 3.1: Các hóa chất sử dụng trong quá trình ly trích DNA
HÓA CHẤT CÔNG DỤNG CÁCH PHA
CTAB(C19H42NBr) (M=364,5 g/mol)
Phá vỡ màng tế bào, màng nhân
Hòa tan trong nƣớc cất 2 lần ở 65o
C
Ethanol 80% Rửa DNA Pha với tỷ lệ 7 thể tích
ethanol 100% và 3 thể tích nƣớc cất 2 lần đã hấp tiệt trùng
Nitơ lỏng Giúp nghiền mẫu nhanh Dung dịch gốc Chloroform Biến tính protein và các
sắc tố có trong mẫu. Tách lớp sau khi ly tâm
Dung dịch gốc
TE 10X Ổn định DNA
Hòa tan DNA
Pha 100ml: 10ml Tris-HCl 1M + 2ml EDTA 0,5M + 88ml nƣớc cất 2 lần. Hấp 121oC/20 phút trƣớc khi dùng.
Mercapto Ethanol Bảo vệ DNA Dung dịch gốc
EB(Extraction Buffer) Dung dịch ly trích Pha 100ml:
900µl CTAB (lắc nhẹ trong bồn ủ 65oC cho tan, hạn chế tạo bọt).
Bổ sung 6 µl Mercaptro Ethanol.
Bọc giấy bạc, trữ ở 4oC, tránh ánh sáng trực tiếp. Isopropanol Tủa DNA ở nhiệt độ
thấp, không cần muối Sodium Acetate
3.5.2 Quy trình ly trích DNA
DNA trong mẫu lá Keo đƣợc ly trích theo quy trình mô tả bởi Butcher và cộng sự (sơ đồ 3.1).
Sơ đồ 3.1: Quá trình ly trích mẫu DNA 0.2g lá Keo non
Bổ sung 500 μl Chloroform đảo đều
o Nghiền mẫu trong Nitơ lỏng(-196o ) o Bổ sung 900 μl CTAB(65o) o Ủ trong 45-60 phút (65o) o Bổ sung 6 μl mercaptoethanol
Ly tâm 13000vòng trong 8 phút.Thu dịch nổi
Bổ sung 500 μl Phenol+ Chloroform (v/v=1:1).Đảo đều
Ly tâm 13000vòng trong 8 phút.Thu dịch nổi
Bổ sung 200 μl CTAB tủa, đảo đều trong 5 phút +500 μl Phenol+ Chloroform(v/v=1:1).Đảo đều
Tủa DNA trong 600 μl Isopropanol lạnh, ly tâm lạnh ở 4oC(13000 vòng trong 15 phút).Thu tủa.
Rửa bằng 500 μl ethalnol (80%), ly tâm lạnh ở 4o
(13000 vòng trong 15 phút), thu tủa, phơi khô ở nhiệt độ phòng
3.5.3 Kiểm tra sản phẩm DNA ly trích
Mẫu DNA ly trích đƣợc điện di trên gel Agarose1.5%, trong dung dịch đệm 1X TBE ở hiệu điện thế 60 V, cƣờng độ dòng điện 400 mA trong 60phút.
Sau khi chạy điện di xong, ngâm gel trong hỗn hợp Ethidium Bromide 0,5 g/ml và TAE 0,5X trong 15phút. Gel sau khi nhuộm đƣợc rửa nhẹ với TAE 0,5X và đƣa vào máy chụp ảnh DNA. Dƣới tia UV, Ethidium Bromide đã liên kết với sợi đôi DNA sẽ phát quang và tạo thành các band trên gel.
3.6 Thực hiện kỹ thuật SSR
Hóa chất dùng trong phản ứng PCR: PCR buffer
MgCl2 . dNTP’s.
Taq DNA polymerase.
Primer.
DNA mẫu (ly trích từ lá Keo).
H2O cất chạy PCR.
3.6.1 Qui trình phản ứng PCR
Phản ứng PCR với cặp primer đã lựa chọn
Thành phần Thể tích sử dụng Nồng độ đầu Nồng độ cuối
HN buffer 2,5 μl 10X 1X
MgCl2 0,75μl 50mM 1.5mM
dNTPs 0,2μl 25mM 0,2mM
Primer forward 0.5μl 10 μmol/ μl 0,2 μmol/ μl Primer reverse 0.5μl 10 μmol/ μl 0,2 μmol/ μl
DNA mẫu 0.5μl
H2O cất 19,85μl Tổng thể tích: 25µ
Bảng 3.2: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR Chu kỳ Nhiệt độ (oC) Thời gian
1 94 2 phút 2 - 29 94 30 giây 55-60 30 giây 72 1 phút 30 72 5 phút 31 4 Forever
Lƣu ý: Sau khi phản ứng PCR hoàn chỉnh, chờ cho nhiệt độ trong máy về 4oC trong 5 phút. Đem sản phẩm trữ ở 4o
C hay -20oCđể có thể sử dụng với trong thí nghiệm sau này. Các thao tác tiến hành pha mix phải thực hiện trong tủ cấy để đảm bảo điều kiện vô trùng và các thành phần phải luôn đƣợc giữ trong điều kiện lạnh .
Trình tự của các primer sử dụng trong đề tài theo chiều 5’ – 3’
Bảng 3.3: Trình tự các SSR’Primer sử dụng
Primer Trình tự (5’-3’) Nucleotide lặp lại
Am008 F: CCACCCGTTACCCATTTATG R: CCGTGATTGACTCTCAGCG (TG)14 Am012 F: TGAGTCGATCGCTTAGCTTG R: TCCCGTTATTATGCCAAAGTG (TC)15(AC)7-(AC)10AG Am014 F: TACTAACGTTGCTATATGAGAAAGG R: CTGGTTGTTCGCTTATATGG (ATAC)3(AC)26(AT)3,(GTAT)2(AT)3AC
Am018 F: CACGGCTGTTATTTCCTTCG R: GGAAAGAGGTGTGACAGAGGAC (AC)14 Am326 F: GGACCAAACTTATGCAACACC R: GCATCAATGTACTAAACCATTTCC (CA)20 Am341 F: CCATTCGAGCATCCTAAGAG R: CGTATGGCTGAGCTACTTAATCA (CA)12(TA)2 Am502 F: CAAATGGCCAAGTTACGACTG R: TTCTGGTAATCCAAACTTATGTGG (TTC)3-(GGA)8, AGA(GGA)2 Am522 F: ATGAGTTTGACCCGACTTGA R: TGCGTAACACGATTATCCT (AAT)3-(AGT)2(GGT)7 Am770 F: CAGAGGTGGCAGATGATGTC R: AAGCCTTTAGTTGGGCGTTC CTC(CAC)5CGC,(CAC)3 3.6.2 Điện di sản phẩm PCR
Lƣu ý: Khi tiến hành nạp gel và gắn lƣợc cần tránh tạo bọt khí trong bản gel và tại các giếng.
Bƣớc1: Rửa các tấm kính(0.75mm) với nƣớc. Lau khô bằng giấy mềm. Rửa lại 2lần bằng cồn 70 oC. Dùng giấy không bụi lau lại thật sạch Lắp các tấm kính vào bộ phận đổ gel điện di đứng vào.
Bƣớc2: Chuẩn bị gel phân tích polyacrylamide(7.5%):
H2O 4.89ml
Tris HCl 1.5M,pH 8.8 2.5ml
Monomer 2.5ml
TEMED 10 μl
10% APS 100 μl
Bơm dịch gel vào bộ phận đổ gel. Thêm iso propanol vào để làm đều mặt gel. Đợi gel đông hoàn toàn (khoảng 20phút), thấm hút dịch isopropanol.
Bƣớc3: Chuẩn bị gel gom polyacrylamide(7.5%):
H2O 2.133ml
Monomer 0.83ml
TEMED 3μl
10% APS 30μl
Bơm dịch gel vào bộ phận đổ gel. Gắn lƣợc tạo giếng. Đợi gel đông hoàn toàn. Tháo lƣợc. Gắn bản gel vào buồng điện di đứng. Chuẩn bị load mẫu điện di.
Bƣớc4: Trộn 10µl mẫu với 10µl loading dye5x (BioRad) rồi nạp vào giếng. Vận hành máy điện di ở 60V, 400A trong 60 phút.
Bƣớc5: Di chuyển gel ra khỏi tấm kính và đem nhuộm ethium bromide trong 15 phút. Rửa lại với TAE 0.5X. Tiến hành chụp gel.
Phần 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Quá trình ly trích
Li trích DNA là một bƣớc khởi đầu rất quan trọng, vì nó quyết định sự thành công cho phản ứng PCR sau này. Qui trình li trích DNA theo sơ đồ 3.1 đạt hiệu quả tốt vì DNA li trích có độ tinh khiết cao, không bị lẫn tạp DNA lạ. Dịch trích DNA chứa chất mercaptoethalnol có khả năng phá vỡ thành tế bào rất mạnh. Bƣớc sử dụng Chloroform đƣợc lặp lại 2 lần liên tiếp kết hợp với li tâm đã loại bỏ hết protein và polysaccharide có trong mẫu. Do đó, DNA thu đƣợc tƣơng đối tốt, đảm bảo cho phản ứng PCR xảy ra.
Bƣớc pha tủa và pha loãng mẫu sẽ giúp giảm nồng độ tạp chất còn lẫn trong sản phẩm li trích sau cùng, bƣớc li tâm tiếp theo sẽ giúp thu đƣợc DNA tinh sạch với nồng độ thấp ở khoảng giữa ống và không bị lẫn tạp chất đã lắng xuống đáy ống.
Hình điện di sản phẩm ly trích DNA
Phản ứng PCR qua nhiều thí nghiệm với nhiều quy trình nhiệt độ và thành phần thay đổi đã tìm đƣợc điều kiện thích hợp nhất. Quy trình PCR ở trên là phù hợp và cho kết quả tin cậy.
Do các đoạn DNA thu đƣợc từ sản phẩm PCR có kích thƣớc không quá khác biệt nhau nên sự đa hình rất khó nhận thấy trong sản phẩm khi điện di trên gel thông thƣờng. Vì vậy cần phải tiếp tục phân tích trên máy giải trình tự ABI 3100 để thu đƣợc những kết quả chính xác hơn.
Sau khi tách chiết, mẫu ADN tách chiết từ các mẫu lá thí nghiệm này đƣợc sử dụng để thanh lọc các mồi SSR để tìm đa hình và xem mồi nào có thể đƣợc sử dụng để đánh giá mối quan hệ di truyền giữa các cá thể Keo lá tràm nghiên cứu. Kết quả thanh lọc các cặp mồi thu đƣợc :
Thanh lọc với cặp mồi Am341: Cá thể số 91 không xuất hiện band. Có sự khác nhau về trọng lƣợng các band giữa các cá thể. Đồng thời có sự biến động về di truyền giữa các cá thể.
Thanh lọc với cặp mồi Am 522: Có thu đƣợc đa hình giữa một số dòng. Cá thể số 142 và 178 có trọng lƣợng phân tử nhỏ hơn các dòng khác.
Thanh lọc với cặp mồi Am 502.
Thanh lọc với cặp mồi Am 770:
Cặp mồi Am 770 cũng có thể sử dụng để nhận biết sự khác biệt giữa các cá thể: cá thể số 8 và 36 không có band.
Tƣơng tự nhƣ mồi Am 770, cặp mồi Am 326 cũng đƣợc dùng để nhận biết cá thể 116, 10, 30, 169 và 134 với các cá thể khác.
Nhƣ vậy 3 cặp mồi Am 326, Am 341 và Am 770 có thể đƣợc sử dụng để phân biệt với các cá thể khác trong thí nghiệm này. Cần thử nghiệm tiếp để tìm đƣợc căp mồi chung cho toàn bộ cá thể nghiên cứu.
Kết quả thanh lọc các mồi SSR trong thí nghiệm này, bƣớc đầu đã cho thấy các mồi đều cho dạng đa hình giữa các cá thể, trong đó mồi Am 341 có thể phân biệt dùng để phân biệt cá thể số 91 (thuộc nhóm sinh trƣởng trung bình) với các cá thể khác. Cặp mồi Am 770 có thể đƣợc dùng để nhận biết cá thể số 8 (thuộc nhóm cá thể có sinh trƣởng nhanh), trong khi mồi Am 326 có thể dùng để nhận biết các cá thể 116, 10, 30, 169 và 134 với các thể khác. Tuy nhiên, cặp mồi Am 326 chỉ có thể sử dụng để tìm hiểu mối quan hệ di truyền giữa các cá thể chứ không sử dụng đƣợc để tìm hiểu mối liên kết của chỉ thị phân tử và tính trạng tăng trƣởng nhanh trong quần thể Keo lá tràm này đƣợc. Những thí nghiệm thanh lọc với các cặp mồi khác còn đang đƣợc tiếp tục tiến hành để phát hiện thêm các cặp mồi có thể dùng để phân biệt giữa các cá thể , đặc biệt là có liên quan đến tính trạng sinh trƣởng nhanh , và có thể đƣợc sử dụng trong công tác chọn giống Keo lá tràm theo hƣớng chất lƣợng với độ chính xác cao.
Phần 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận
Từ các kết quả thu đƣợc, chúng tôi rút ra một số kết luận nhƣ sau: Sử dụng lá keo non để ly trích sẽ thu đƣợc lƣợng DNA mẫu tốt nhất.
Kết quả thanh lọc cho thấy cặp mồi Am 341, Am 326 và Am 770 có thể đƣợc sử dụng để tìm hiểu mối quan hệ của các cá thể. Tuy nhiên để sử dụng những chỉ thị này tìm hiểu sự liên hệ với tính trạng tăng trƣởng nhanh thi có thể sử dụng mồi Am 341 và Am 770.
Luận văn thực hiện là một phần trong đề tài lớn với việc ứng dụng chỉ thị phân tử ADN trong chọn giống Keo lá tràm theo hƣớng tăng trƣởng nhanh. Tổng số mồi SSR dự kiến sử dụng là 50 cặp. Tuy nhiên do số kinh phí cấp hàng năm hạn chế nên mỗi năm chỉ đủ kinh phí mua 5-6 cặp mồi và hoá chất thí nghiệm. Vì thế, luận văn chỉ mới thực hiện bƣớc thanh lọc đƣợc trên 9 cặp mồi. Do số cặp mồi thanh lọc còn ít nên việc sử dụng phần mềm NTSYS để phân tích mối quan hệ di truyền sẽ chƣa đƣợc chính xác, vì thế luận văn chƣa thể có kết luận về mối quan hệ di truyền giữa các cá thể nghiên cứu.
5.2 Đề nghị
Trong các công trình nghiên cứu tiếp theo về Microsatellite để mang lại các kết quả khả quan hơn trong việc thu nhận các đoạn DNA mã hoá cho các tính trạng chiều cao cây, thể tích thân, phẩm chất gỗ, khả năng chống chịu sâu bệnh.. cần lƣu ý một số vấn đề sau:
- Tiếp tục áp dụng và hoàn thiện kỹ thuật Microsatellite để lập hồ sơ kiểu gene cho các giống và keo phục vụ cho việc trao đổi dữ liệu, thông tin về đa dạng di truyền giữa các giống, đồng thời phục vụ cho công tác lai tạo và chọn lọc giống.
- Từ kết quả nghiên cứu lần này tiếp tục phát triển thêm, nhiều cặp mồi SSR cần phải đƣợc thử nghiệm, thanh lọc để chọn lựa primer phù hợp hơn cho việc đánh giá mối quan hệ di truyền gữa các cá thể Keo lá tràm một cách chính xác, để xây dựng cơ sở di truyền hoàn chỉnh và tin cậy cho các giống có phẩm chất cao tại Việt Nam nhằm tạo thuận lợi cho những nhận định, kiểm tra, phân tích sau này.
-Cần chú ý thu thập thông tin về các QTL (Quantitive trait loci) có liên quan đến tính trạng tăng trƣởng nhanh để tìm đƣợc những cặp mồi thích hợp cho quá trình phân tích. Trên cơ sở đó, cặp mồi tìm đƣợc sẽ đƣợc dùng để xác định sự liên hệ với các tính trạng tăng trƣởng nhanh ở quần thể Keo lá tràm nghiên cứu.
TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
1. Bùi Chí Bửu – Nguyễn Thị Lang – 1999: Di truyền phân tử - Những nguyên tắc căn bản trong chọn giống cây trồng- Nhà xuất bản Nông nghiệp Thành Phố Hồ Chí Minh.
2. Lê Trọng Cúc – 2002: Đa dạng sinh học và bảo tồn thiên nhiên – Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Hà Nội.
3. Đỗ Thị Hoàng Diễm :Luận văn khóa luận tốt nghiệp 2002-2006.
4. Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng – 1997: Sinh học phân tử - Nhà xuất bản giáo dục.
5. Bùi Việt Hải – 1998:Nghiên cứu một số cơ sở khoa học cho kỹ thuật tỉa thƣa rừng trồng Keo lá tràm cung cấp gỗ nguyên liệu giấy sợi vùng miền Đông Nam Bộ.
6. Phạm Thành Hổ : Bài giảng CNSH cây trồng.
7. Nguyễn Thị Lang – 2002: Các phƣơng pháp cơ bản trong nghiên cứu công nghệ sinh học – Nhà xuất bản Nông nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh.
8. Lâm Vỹ Nguyên: Luận văn khóa luận tốt nghiệp 2002-2006.
9. Phạm Bình Quyền - Nguyễn Nghĩa Thìn – 2002. Đa dạng sinh học - Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Hà Nội.
10. Nguyễn Nghĩa Thìn – 2005: Đa dạng sinh học và tài nguyên di truyền thực vật - Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Hà Nội.
11. Trần Ngọc Việt : Luận văn khóa luận tốt nghiệp 2002-2006.
TÀI LIỆU TIẾNG NƢỚC NGOÀI
13. Butcher PA.; Decroocq S.;Gray Y. và Moran GF.,2000: Development, inheritance and cross- species amplification of Microsatellite markers from Acacia mangium.
14. Wickneswari R and Norwati M 199: Genetic diversity of natural population of Acacia auriculifofmis. Aust.J.Bot. 41:65-77.
15. Kenneth Berendzen, Iain Searle, Dean Ravenscroft, .v.v..,2005: A rapid and versatile combined DNA/RNA extraction protocol and its application to the analysis of a novel DNA marker set polymorphic between Arabidopsis thalian