Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của cây mầm trắng trong rừng ngập mặn Cần Giờ

GIỚI THIỆU

Rừng ngập mặn Cần Giờ TP Hồ Chí Minh, đƣợc xem là khu rừng phục hồi đẹp nhất Đông Nam Á và vinh dự đƣợc UNESCO công nhận là khu dự trữ sinh quyển đầu tiên của Việt Nam, nằm trong mạng lưới 459 khu dự trữ sinh quyển trên Thế giới. Đây đƣợc xem là hệ sinh thái quan trọng, điển hình ở vùng ven biển nhiệt đới, không chỉ phong phú, đa dạng với các quần thể thực vật, động vật có giá trị mà còn đƣợc xem là lá phổi xanh của TP Hồ Chí Minh và có nhiều tiềm năng về kinh tế, du lịch sinh thái – văn hóa, nghiên cứu và giao lưu quốc tế. Nguồn lợi chính của mắm không nằm trong việc khai thác gỗ mà nằm trong việc bảo vệ đất bồi và gây môi trường sống cho sinh vật ven biển.

Quần thể mắm trắng đi kèm với quần thể đước là thành phần chính của rừng ngập mặn Cần Giờ, có vai trò chắn sóng gió, bảo vệ vùng ven biển, là nơi nuôi dƣỡng và cung cấp thức ăn cho các loài hải sản có giá trị cao. Tuy nhiên, qua thời gian cùng với sự phát triển của rừng, diện tích mắm trắng đang ngày càng thu hẹp trước sự khai thác, sử dụng không hợp lý và lâm vào tình trạng báo động bởi những dịch sâu bệnh tấn công trên vùng rộng. Việc đánh giá tổng quát về quỹ gien và mức độ đa dạng di truyền của quần thể mắm trắng tại Khu dự trữ sinh quyển Cần Giờ là cần thiết để cung cấp những thông tin cơ bản cho các kế hoạch bảo vệ và sử dụng hợp lý tiềm năng cây mắm trắng.

“BƯỚC ĐẦU HOÀN THIỆN PHƯƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÂY MẮM TRẮNG (Avicennia alba) TẠI KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ BẰNG KỸ THUẬT RAPD”.  Thu thập đƣợc nhiều mẫu đặc trƣng, mang tính đại diện cao cho quần thể mắm trắng tại khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ, chú ý đến những mẫu đặc biệt, cá biệt trong quần thể, ghi nhận tọa độ chính xác của mỗi cá thể.

40 chu kỳ

• Các chỉ thị phân tử dùng trong nghiên cứu tính đa dạng di truyền

Bắt cặp: Nhiệt độ phản ứng giảm xuống để primer liên kết vào các mạch của DNA đích theo nguyên tắc bổ sung (nhiệt độ này phụ thuộc vào primer nhƣng thường là 50 - 560 C). Hiện nay, thành tựu của PCR mở ra nhiều triển vọng cho sinh học phân tử, với nhiều ứng dụng trong sinh học, trong y khoa, trong nông nghiệp và trong nhiều lĩnh vực khác. Nguồn gốc tính đa dạng sinh học ở thực vật nói riêng và ở sinh vật nói chung nằm ở thứ tự các bộ ba trên phân tử DNA làm nên bộ máy di truyền của chúng.

Phương pháp tiến hành: DNA sau khi tách chiết được phân cắt bằng một enzyme nhất định, rồi chạy điện di, lúc này các đoạn DNA tách riêng ra với nhau tùy theo kích thước của nó chạy trên gel agarose. SSCP có thể xác định tính chất dị hợp tử của những đoạn phân tử DNA (có cùng trọng lƣợng phân tử), và nó có thể phân biệt đƣợc sự thay đổi của một vài nucleotide nào đó. Do vậy nguyên tắc của phương pháp này là dựa trên sự khuếch đại các trình tự lặp lại trên bộ gien bằng các primer đặc hiệu có khả năng bổ sung vào hai đầu của locus microsatellite.

Sản phẩm PCR là các đoạn DNA có chiều dài khác nhau do sự biến thiên về độ dài đƣợc tách ra trên gel polyacrylamid hoặc trong mao quản của máy giải trình tự DNA. AFLP, đa hình chiều dài các đoạn DNA đƣợc khuếch đại chọn lọc, do Vos và cộng sự phát minh 1975, là kỹ thuật đƣợc áp dụng để phân tích tính đa dạng của sinh vật từ hàng trăm đoạn DNA giới hạn đã đƣợc khuếch đại đồng thời nhờ phản ứng PCR [13], [18], [20]. Adapter là một đoạn oligonucleotide đôi, được tổng hợp nhân tạo và có trình tự tương ứng với trình tự ở đầu đoạn DNA được phân cắt bởi một loại enzyme nhất định.

Sau phản ứng cắt, có ba loại đoạn DNA thu nhận đƣợc: một loại đoạn DNA đƣợc cắt bởi EcoRI ở cả hai đầu kết thúc, một loại đoạn DNA đƣợc cắt bởi EcoRI ở một đầu kết thúc này và MseI ở đầu kết thúc khác, và một loại đoạn DNA đƣợc cắt bởi MseI ở cả hai đầu kết thúc [13]. Primer này được thiết kế tương ứng với adapter đã sử dụng, đồng thời có gắn thêm một nucleotide ở đầu 3’ để chọn lọc những đoạn DNA cần khuếch đại, cụ thể là EcoRI gắn thêm nucleotide A và MseI gắn thêm nucleotide C ở đầu 3’.  Phân tích kết quả bằng các phần mềm thông dụng, lập cây phát sinh chủng loại để xác định sự khác biệt di truyền và đa dạng sinh học của các mẫu nghiên cứu.

Kỹ thuật này cho phép phát hiện thể đa hình mà không cần biết trước thứ tự các nucleotide bằng cách dùng các primer tổng hợp, mạch đơn, ngắn, dãy mã đƣợc thiết kế ngẫu nhiên để thực hiện PCR [4]. Sau khi bắt cặp tại các vị trí chuyên biệt trên sợi DNA, primer tiến hành sự khuếch đại để tạo ra các đoạn có kích thước khác nhau, có khi lên tới 2 kb.  Xác định tính đa dạng di truyền bằng các phần mềm thông dụng (NTSYSpc, UPGMA cluster, Gelcompar, lập dendrogram) các số liệu thu đƣợc cho thấy sự gần gũi hoặc cách biệt di truyền của các mẫu nghiên cứu.

Vật liệu nghiên cứu 1. Mẫu thực vật

• Hóa chất thí nghiệm
• Kiểm tra DNA ly trích

Gắn nối các ion hóa trị II (Mg++, Ca++…) có trong dịch ly trích, ngăn chặn sự hoạt động của các enzyme phân hủy DNA. Các enzyme này hoạt động rất mạnh nếu có sự có mặt của các ion hóa trị II nhất là ion Mg++. Dung dịch đệm, làm tăng lực ion trong dịch trích, tạo điều kiện thuận lợi cho DNA kết tủa với ethanol 100%.

Mercaptro Ethanol Bảo vệ DNA Dung dịch gốc PVP (polyvinylpyrrolydol) Biến tính các hợp chất.  Quy trình 2: Cải tiến quy trình của Doyle: thay đổi thời gian và số vòng ly tâm, thời gian ủ, trọng lƣợng mẫu.  Quy trình 4: Cải tiến quy trình 3, nghiền mẫu trong N2 lỏng thay vì nghiền mẫu trong dích trích EB, tăng số vòng vortex.

Dưới tia UV, Ethidium Bromide liên kết với sợi đôi DNA sẽ phát quang và tạo thành các băng trên gel [6], [7].  Pha loãng dung dịch DNA đến nồng độ thích hợp để đo (thường pha loãng 100 lần) với dung dịch TE 1X.  Thí nghiệm 1: Khảo sát quy trình phản ứng RAPD trên 2 nghiệm thức Sử dụng primer OPAC10 và primer 1.

Mục đích: Khảo sát quy trình RAPD – PCR trên cây mắm trắng Chỉ tiêu đánh giá: Các băng DNA trên gel điện di. Thành phần hóa chất cho phản ứng RAPD ở nghiệm thức 1 Hóa chất Nồng độ đầu Thể tích sử dụng Nồng độ cuối. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RAPD ở nghiệm thức 1 Số chu kì Nhiệt độ (0C) Thời gian (phút).

Thành phần hóa chất trong phản ứng RAPD ở nghiệm thức 2 Hóa chất Nồng độ đầu Thể tích sử dụng Nồng độ cuối. Nguyên tắc của phần mềm là dựa trên sự có mặt hay không của các băng DNA quan tâm trên gel điện di dưới dạng mã hóa theo ma trận với các thông số 0 và 1 (0: không có băng, 1: có băng). Phần mềm sẽ xử lý và xây dựng nên cây phân nhóm di truyền, qua đó ta có thể quan sát đƣợc mức độ gần gũi hay xa cách về mặt di truyền giữa những bộ gel nghiên cứu.