ỨNG DỤNG KỸ THUẬT AFLP ĐÁNH GIÁ SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA QUẦN THỂ ĐƯỚC ĐÔI (Rhizophora apiculata BLUME) Ở VÙNG LÕI KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ********** LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ỨNG DỤNG KỸ THUẬT AFLP ĐÁNH GIÁ SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA QUẦN THỂ ĐƯỚC ĐÔI (Rhizophora apiculata BLUME) Ở VÙNG LÕI KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa : 2004 - 2008 Sinh viên thực hiện: BÙI ANH XUÂN Tháng 9/2008 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ********** LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ỨNG DỤNG KỸ THUẬT AFLP ĐÁNH GIÁ SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA QUẦN THỂ ĐƯỚC ĐÔI (Rhizophora apiculata BLUME) Ở VÙNG LÕI KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS BÙI MINH TRÍ BÙI ANH XUÂN ThS HỒ BÍCH LIÊN Tháng 9/2008 LỜI CẢM TẠ  Con xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Cha Mẹ, người có cơng sinh thành, ni dưỡng khôn lớn cho ăn học nên người Con tự hào Cha Mẹ gia đình Con xin chân thành biết ơn người thân u gia đình ln động viên tạo điều kiện cho ăn học đến ngày hôm Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến:  Ban Giám hiệu Phòng Đào tạo trường Đại học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh  Ban Giám đốc Trung tâm Phân tích Thí nghiệm trường Đại học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh  Ban Chủ nhiệm Thầy, Cô Bộ môn Công nghệ Sinh học tận tình dạy bảo em suốt thời gian học tập trường  Ban quản lý Rừng phòng hộ Cần Giờ, đặc biệt anh Bùi Thế Kiệt tạo nhiều điều kiện thuận lợi cho phép em thực đề tài Em xin đặc biệt cảm ơn Thầy - TS Bùi Minh Trí ThS Hồ Bích Liên - giáo viên hướng dẫn, tận tình dẫn, giúp đỡ truyền đạt nhiều kinh nghiệm quý giá nghiên cứu sống, giúp em hoàn thành đề tài ứng dụng nhiều thời gian tới Em chân thành cảm ơn anh chị công tác nghiên cứu Trung tâm Phân tích Thí nghiệm trường Đại học Nông Lâm: chị Huỳnh Thị Thanh Trà, chị Văn Thị Ngọc Dung, anh Phạm Văn Bình v.v… Cùng bạn sinh viên lớp Công nghệ Sinh học K30 bên tôi, động viên, chia nhiều buồn vui giúp đỡ tơi hồn thành tốt đề tài Xin chân thành cảm ơn ! BÙI ANH XUÂN iii TÓM TẮT KHÓA LUẬN BÙI ANH XUÂN, Đại học Nơng Lâm thành phố Hồ Chí Minh, tháng 9/2008 Đề tài: “Ứng dụng kỹ thuật AFLP đánh giá đa dạng di truyền quần thể đước đôi (Rhizophora apiculata Blume) vùng lõi Khu dự trữ sinh quyễn rừng ngập mặn Cần Giờ” Giáo viên hướng dẫn: TS BÙI MINH TRÍ, ThS HỒ BÍCH LIÊN Khóa luận thực từ tháng 4/2008 đến tháng 9/2009 Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Hóa - Sinh trường Đại học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh Đước đơi quần thể phổ biến rừng ngập mặn Cần Giờ, Tp Hồ Chí Minh, có giá trị kinh tế môi trường cao Trải qua hoạt động khai thác người với mở rộng phát triển khu công nghiệp làm cho quần thể đước có có dấu hiệu lụi tàn Vì vậy, nghiên cứu đa dạng di truyền trở nên cần thiết để cung cấp thông tin cho việc thiết lập chiến lược tái tạo phục hồi đa dạng sinh học hệ sinh thái Trong đề tài sử dụng kỹ thuật AFLP đánh giá đa dạng di truyền quần thể đước đôi (Rhizophora apiculata Blume) vùng lõi Khu dự trữ sinh rừng ngập mặn Cần Giờ Những kết đạt được:  Thu thập 30 mẫu đước đôi vùng lõi Khu dự trữ sinh rừng ngập mặn Cần Giờ, huyện Cần Giờ, Tp Hồ Chí Minh  Tối ưu hóa quy trình ly trích DNA nhằm thu DNA có chất lượng tốt Kết định lượng DNA quang phổ kế cho thấy tỉ lệ OD260/OD280 dao động khoảng từ 1,5 đến 2,2  Sàng lọc 16 tổ hợp primer nhân chọn lọc có tổ hợp primer cho nhiều sản phẩm khuếch đại với mức độ xuất sản phẩm khuếch đại đa hình cao  Cây phân loại di truyền quần thể đước đơi 11 mẫu phân tích có hệ số di truyền biến thiên từ 0,56 - 0,88 Kết cho thấy thể đước đôi (Rhizophora apiculata Blume) vùng lõi khu dự trữ sinh rừng ngập mặn Cần Giờ có quan hệ di truyền tương đối gần iv SUMMARY BUI ANH XUAN, Nong Lam University Ho Chi Minh City, September 2008 The thesis titled: " Assessment genetic diversity of Rhizophora apiculata Blume in the core region of Can Gio mangrove biophere reserve using AFLP” Supervisors: BUI MINH TRI, PhD & HO BICH LIEN, Msc The thesis was carried out at The Chemical and Biological Analysis and Experiment Center - Nong Lam University from April to September 2008 Rhizophora apiculata Blume - a common population in the core region of Can Gio Mangrove Biophere Reserve - has a high economic and environmental value However, human activities and industrialization are causing negative effects in the area, in general and R apiculata population, in particular Studies on population genetics are necessary to provide basic information for setting up a strategy for conservation of the mangrove forest This research used AFLP technique to assess genetic diversity of Rhizophora apiculata Blume in core region of Can Gio mangrove biophere reserve The major obtained results were:  Leaf samples of 30 individuals (including plant description) of Rhizophora apiculata Blume in core region of Can Gio mangrove biosphere reserve were collected  DNA extraction protocol for R apiculata were optimized successfully The obtained DNA had OD260/OD280 ratio ranged between 1.5 to 2.2  Four primer combinations, those gave highest degrees of polymorphism among 16 primer combinations experimented were selected  Based on statistic results using NTSYS-PC program, we could draw the phylogenic tree of Rhizophora apiculata Blume Eleven samples scattered into several groups with coefficient of similarity ranging from 0.56 to 0.88 It suggested that Rhizophora apiculata Blume in the core region had a relatively closed relationship Thus, it is highly recommended that a strategy to enrich gene pool of R apiculata need to be set up in order to preserve one of the most important mangrove forest of Vietnam v MỤC LỤC Nội dung Trang Lời cảm ơn iii Tóm tắt iv Sumary v Mục lục iv Danh sách chữ viết tắt vii Danh sách hình x Danh sách bảng sơ đồ xi Chương 1: GIỚI THIỆU .1 1.1 Đặt vấn đề .1 1.2 Mục đích, yêu cầu giới hạn đề tài 1.2.1 Mục đích 1.2.2 Yêu cầu 1.2.3 Giới hạn đề tài .2 Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Vài nét rừng ngập mặn Cần Giờ Tp Hồ Chí Minh .3 2.1.1 Giới thiệu Khu dự trữ sinh rừng ngập mặn Cần Giờ 2.1.2 Cấu trúc Khu dự trữ sinh rừng ngập mặn Cần Giờ 2.1.3 Vai trò Khu dự trữ sinh rừng ngập mặn Cần Giờ 2.1.4 Công tác bảo vệ phát triển Khu dự trữ sinh rừng ngập mặn Cần Giờ 2.2 Giới thiệu đước đôi 10 2.2.1 Phân loại 10 2.2.2 Đặc điểm hình thái đước đôi 11 2.2.3 Phân bố 11 2.2.4 Giá trị sử dụng đước đôi .12 2.3 Đa dạng sinh học 12 2.3.1 Định nghĩa phân loại đa dạng sinh học 12 2.3.2 Giới thiệu chung tính đa dạng di truyền 12 2.4 Các kỹ thuật đánh giá tính đa hình di truyền 13 vi 2.4.1 Kỹ thuật RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) 14 2.4.2 Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphism DNA) 16 2.4.3 Kỹ thuật Microsatellite/SSR (Simple Sequence Repeat) 18 2.4.4 Kỹ thuật AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) 19 2.5 Các nghiên cứu nước 23 2.5.1 Các nghiên cứu nước 23 2.5.2 Các nghiên cứu nước liên quan đến đước đôi (Rhizophora apiculata Blume) Khu DTSQ RNM Cần Giờ 23 Chương 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 3.1 Thời gian địa điểm thực 25 3.2 Vật liệu nghiên cứu .25 3.2.1 Thu thập mẫu nghiên cứu 25 3.2.2 Các hoá chất cần thiết 25 3.2.2.1 Hóa chất dùng cho tách chiết kiểm tra DNA đước đơi 25 3.2.2.2 Hóa chất dùng cho kỹ thuật AFLP 26 3.2.2.3 Hóa chất dùng để đọc kết AFLP 26 3.2.3 Thiết bị dụng cụ thí nghiệm 26 3.3 Phương pháp nghiên cứu .27 3.3.1 Các giai đoạn thí nghiệm 27 3.3.2 Phương pháp ly trích DNA .27 3.3.2.1 Quy trình 27 3.3.2.2.Quy trình .28 3.3.3 Kiểm tra kết ly trích DNA 28 3.3.3.1 Định tính DNA phương pháp điện di 28 3.3.3.2 Định lượng DNA quang phổ kế .29 3.3.4 Thực kỹ thuật AFLP 30 3.3.5 Phân tích kết phần mềm NTSYS MINITAB 33 Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34 4.1 Kết thu thập mẫu đước đôi vùng lõi Khu DTSQ RNM Cần Giờ 34 4.1.1 Kết thu thập mẫu đước đôi 34 4.1.2 Bảo quản mẫu 35 4.2 Hồn thiện quy trình ly trích DNA .36 vii 4.3 Kết đánh giá đa dạng di truyền quần thể đước đôi vùng lõi Khu DTSQ RNM Cần Giờ kỹ thuật AFLP 42 4.3.1 Kết thực phản ứng cắt gắn adapter DNA mẫu đước đôi thu thập vùng lõi Khu DTSQ RNM Cần Giờ 42 4.3.2 Kết nhân tiền chọn lọc mẫu đước đôi thu thập vùng lõi Khu DTSQ RNM Cần Giờ 43 4.3.3 Kết khảo sát 16 tổ hợp primer nhân chọn lọc tuyển chọn primer có kết tốt 43 4.3.4 Kết thực kỹ thuật AFLP tổ hợp primer .46 4.3.5 Phân tích tính đa dạng di truyền mẫu đước đôi thu thập vùng lõi Khu DTSQ RNM Cần Giờ 52 Chương 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 57 5.1 Kết luận 57 5.2 Đề nghị 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO 59 CÁC PHỤ LỤC viii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT  AFLP: Amplified Fragment length Polymorphism  A, T, G, C, U: Adenine, Thymine, Guanine, Cytosine, Uracine  Bp: Base Pair  CTAB: Cetyltrimethyl Ammonium Bromide  dNTP: Deoxynucleotide Triphosphate  DNA: Deoxyribonucleic Acid  DTSQ: Dự Trữ Sinh Quyển  EB: Extraction Buffer  EDTA: Ethylene Diaminetetra Acetic Acid  M: Mẫu  M/NNN - E/NNN - 172 - 392: Tên Chỉ Thị Phân Tử  ng: Nanogram  OD: Optical Density  PCR: Polymerase Chain Reaction  PVP: Polyvinylpyrrolidone  RNA: Ribonucleic Acid  RNase: Ribonuclease  RNM: Rừng Ngập Mặn  SDS: Sodium Dodecyl Sulfate  TAE: Tris Glacial Acetic Acid EDTA  TE: Tris EDTA  UNESCO: United Nations Educational Scientific and Cultural Organization  UV: Ultra Violet  WB: Washing Buffer ix DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình Trang Hình 2.1 Bản đồ khu dự trữ sinh rừng ngập mặn Cần Giờ Hình 2.2 Cấu trúc rễ, thân, lá, hoa, trái đước đôi 10 Hình 2.3 Nguyên tắc kỹ thuật RFLP 14 Hình 2.4 Nguyên lý kỹ thuật RAPD 17 Hình 2.5 Nguyên lý kỹ thuật AFLP 20 Hình 2.6 Nguyên lý cắt hai enzyme 21 Hình 2.7 Nguyên lý gắn adapter MseI EcoRI 21 Hình 2.8 Nguyên lý khuếch đại tiền chọn lọc 22 Hình 4.1 Vị trí thu thập mẫu đồ Cần Giờ .34 Hình 4.2 Kết điện di sản phẩm ly trích DNA từ mẫu tươi mẫu bảo quản sau ngày theo quy trình 35 Hình 4.3 DNA tổng số mẫu đước thu thập vùng lõi Khu DTSQ RNM Cần Giờ ly trích theo quy trình (Hình A, C), quy trình (Hình B, D) 38 Hình 4.4 Sản phẩm phản ứng cắt gắn adapter mẫu .42 Hình 4.5 Sản phẩm nhân chọn lọc mẫu đước đôi M14, M18, M21, M22, M25 43 Hình 4.6 Cây di truyền 11 mẫu đước thu thập vùng lõi Khu dự trữ sinh rừng ngập mặn Cần Giờ 52 x 2.4.2 Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphism DNA) 16 2.4.2.1 Khái niệm 16 2.4.3 Kỹ thuật Microsatellite/SSR (Simple Sequence Repeat) 18 2.4.4 Kỹ thuật AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) 19 2.5 Các nghiên cứu nước 23 2.5.1 Các nghiên cứu nước 23 2.5.2 Các nghiên cứu nước liên quan đến đước đôi (Rhizophora apiculata Blume) Khu DTSQ RNM Cần Giờ 24 Chương 25 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 3.1 Thời gian địa điểm thực 25 3.2 Vật liệu nghiên cứu .25 3.2.1 Thu thập mẫu nghiên cứu 25 3.2.2 Các hoá chất cần thiết 25 3.2.2.1 Hóa chất dùng cho tách chiết kiểm tra DNA đước đơi 25 3.2.2.2 Hóa chất dùng cho kỹ thuật AFLP 26 3.2.2.3 Hóa chất dùng để đọc kết AFLP 26 3.2.3 Thiết bị dụng cụ thí nghiệm 26 3.3 Phương pháp nghiên cứu 27 3.3.1 Các giai đoạn thí nghiệm 27 3.3.2 Phương pháp ly trích DNA 27 3.3.2.1 Quy trình 1: (gồm 14 bước) 27 3.3.2.2.Quy trình 2: gồm 18 bước sau: 28 3.3.3 Kiểm tra kết ly trích DNA 29 3.3.3.1 Định tính DNA phương pháp điện di 29 3.3.3.2 Định lượng DNA quang phổ kế 29 3.3.4 Thực kỹ thuật AFLP 30 3.3.5 Phân tích kết phần mềm NTSYS MINITAB 33 Chương 34 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34 4.1 Kết thu thập mẫu đước đôi vùng lõi Khu DTSQ RNM Cần Giờ 34 4.1.1 Kết thu thập mẫu đước đơi 34 4.1.2 Bảo quản mẫu 35 4.2 Hồn thiện quy trình ly trích DNA .36 4.3 Kết đánh giá đa dạng di truyền quần thể đước đôi vùng lõi Khu DTSQ RNM Cần Giờ kỹ thuật AFLP 42 62 4.3.1 Kết thực phản ứng cắt gắn adapter DNA mẫu đước đôi thu thập vùng lõi Khu DTSQ RNM Cần Giờ 42 4.3.2 Kết nhân tiền chọn lọc mẫu đước đôi thu thập vùng lõi Khu DTSQ RNM Cần Giờ 43 4.3.3 Kết khảo sát 16 tổ hợp primer nhân chọn lọc tuyển chọn primer có kết tốt 43 4.3.4 Kết thực kỹ thuật AFLP tổ hợp primer 46 4.3.5 Phân tích tính đa dạng di truyền mẫu đước đôi thu thập vùng lõi Khu DTSQ RNM Cần Giờ 52 Chương 57 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 57 5.1 Kết luận 57 5.2 Đề nghị 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO 59 PHỤ LỤC .1 Phụ lục 5: MÃ HOÁ CÁC SẢN PHẨM KHUẾCH ĐẠI ĐIỆN DI One-way ANOVA: So SP khuech dai versus To hop Analysis of Variance for So SP kh Based on Pooled StDev .9 Trên 15 mẫu 10 One-way ANOVA: So SP khuech dai versus To hop 10 Analysis of Variance for So SP kh 10 Trên 11 mẫu cho kết 10 One-way ANOVA: So SP khuech dai versus To hop 10 Analysis of Variance for So SP kh 10 Based on Pooled StDev 10 Phụ lục : BẢNG ĐẶC ĐIỂM 30 MẪU ĐƯỚC ĐÔI THU THẬP Ở VÙNG LÕI KDTSQ RNM CẦN GIỜ 63 PHỤ LỤC Phụ lục 1: CÁC BAND ĐIỆN DI CỦA 11 MẪU ĐƯỚC ĐƠI PHÂN TÍCH TRÊN TỔ HỢP MseI - CAT/EcoRI - ACT M18 102 108 109 115 132 134 139 140 174 175 183 189 199 201 217 218 225 241 242 248 259 272 319 344 347 358 369 M9 109 134 175 183 218 217 M25 M30 109 M14 109 175 248 M21 109 175 360 M22 M23 M26 109 102 175 109 248 134 140 175 183 189 218 242 248 259 344 369 M5 109 134 175 247 M6 102 109 115 118 132 134 139 140 162 164 175 183 189 199 202 217 218 224 241 242 248 271 272 296 319 336 344 347 358 359 360 369 371 386 402 522 Phụ lục 2: CÁC BAND ĐIỆN DI CỦA 11 MẪU PHÂN TÍCH TRÊN TỔ HỢP MseI - CAT/EcoRI - ACA M18 102 107 108 111 116 117 118 123 126 137 142 156 159 166 169 177 181 182 184 187 188 195 200 205 226 228 235 239 245 260 261 264 265 283 294 295 314 368 416 433 M9 102 108 111 116 117 126 142 156 166 169 181 182 184 187 188 195 200 205 222 224 226 228 239 261 264 265 283 295 299 314 415 446 M25 M30 102 107 111 156 314 M14 102 108 111 116 117 123 125 142 156 159 167 169 182 183 186 187 188 195 200 203 205 211 223 224 226 228 236 239 260 261 264 265 283 290 295 299 313 314 324 409 413 415 426 433 445 M21 102 108 111 116 117 126 142 156 159 166 169 182 182 184 187 188 195 200 205 211 223 224 226 239 264 265 283 295 299 313 314 324 409 413 416 426 430 433 445 M22 102 107 111 117 142 156 169 181 182 187 188 199 205 225 260 265 283 314 M23 142 314 M26 102 107 111 142 156 181 182 187 188 205 225 M5 102 108 156 205 226 315 M6 102 107 108 117 118 125 137 142 142 156 159 169 182 183 188 195 200 205 223 226 228 239 264 283 294 315 324 413 426 427 440 507 Phụ lục 3: CÁC BAND ĐIỆN DI CỦA 11 MẪU ĐƯỚC ĐƠI PHÂN TÍCH TRÊN TỔ HỢP MseI - CAG/EcoRI - ACA M18 107 110 111 121 125 133 134 135 156 176 191 198 212 217 226 227 243 250 253 257 268 290 309 336 379 380 397 398 406 413 464 479 M9 107 110 111 121 125 133 134 135 156 176 179 191 198 206 212 217 226 228 243 251 254 257 268 275 290 294 309 317 337 379 380 396 398 406 413 423 462 464 479 525 M25 133 226 243 257 268 336 398 M30 107 110 111 121 133 156 176 191 198 212 217 226 228 243 250 254 257 268 276 295 337 379 380 396 398 462 464 479 487 516 676 M14 107 110 111 121 125 133 134 135 156 176 191 198 212 217 226 228 243 248 251 254 258 263 268 291 295 309 337 379 380 396 398 406 413 423 462 464 479 487 516 524 M21 107 110 111 121 125 133 134 135 156 176 191 198 206 212 217 226 228 244 251 254 258 268 291 309 317 337 379 380 396 398 406 413 422 437 462 464 479 487 516 525 614 620 M22 107 110 111 121 125 133 134 135 156 176 191 198 206 212 217 226 228 238 243 251 254 258 268 291 295 309 317 337 379 380 396 398 406 413 462 464 479 M23 107 110 111 121 125 133 135 156 176 191 198 212 217 226 228 243 251 254 258 268 291 294 337 380 396 398 406 413 464 479 M26 107 110 111 121 125 133 134 135 156 176 191 198 206 212 217 228 243 251 258 291 292 293 294 309 337 406 462 479 520 M5 M6 107 110 111 122 125 133 156 176 198 217 226 228 244 251 258 396 479 Phụ lục 4: CÁC BAND ĐIỆN DI CỦA 11 MẪU ĐƯỚC ĐƠI PHÂN TÍCH TRÊN TỔ HỢP MseI - CAA/EcoRI - AAG M18 103 116 118 121 136 141 146 155 169 171 172 176 177 188 189 212 215 229 230 248 255 267 290 315 318 322 332 365 392 430 455 469 500 527 M9 103 116 118 121 128 136 141 156 156 169 174 188 189 215 229 230 233 255 267 315 319 332 430 455 469 M25 121 500 M30 116 118 121 229 315 469 527 M14 103 116 118 121 129 136 157 188 189 229 231 255 315 332 469 M21 103 116 118 121 128 136 169 177 188 189 215 229 231 255 256 267 315 365 454 469 527 M22 103 111 116 118 121 136 141 146 147 156 157 169 171 173 176 177 188 190 199 208 212 215 230 231 232 249 256 256 267 315 319 323 333 365 430 455 469 M23 121 M26 103 107 116 118 121 134 136 141 146 147 155 159 171 176 177 188 189 199 207 215 230 233 255 258 265 267 315 318 322 430 454 M5 103 116 118 121 129 146 469 M6 103 116 118 121 129 136 146 156 157 169 171 188 190 229 230 255 256 263 332 365 469 Phụ lục 5: MÃ HOÁ CÁC SẢN PHẨM KHUẾCH ĐẠI ĐIỆN DI DƯỚI DẠNG MA TRẬN Mẫu Kích thước band (bp) 18 25 30 14 21 22 23 26 102 103 107 108 109 110 111 115 116 117 118 121 122 123 125 126 128 129 132 133 134 135 136 137 139 140 141 142 146 147 155 156 157 159 162 164 166 167 169 171 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 1 1 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 0 0 0 1 1 0 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0 0 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 0 1 0 1 1 0 0 0 1 0 1 1 1 1 1 0 0 0 1 1 0 1 1 1 1 0 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 0 1 1 0 1 172 173 174 175 176 177 179 181 182 183 184 186 187 188 189 190 191 195 198 199 200 201 202 203 205 206 207 208 211 212 215 217 218 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 1 0 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 1 0 0 1 1 1 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 1 1 1 1 1 0 1 0 1 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 1 1 1 1 0 1 0 1 1 0 1 1 1 0 0 1 1 1 0 1 1 1 0 0 1 0 1 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 1 1 1 1 0 0 0 1 1 1 1 0 235 236 238 239 241 242 243 244 245 247 248 249 250 251 253 254 255 256 257 258 259 260 261 263 264 265 267 268 271 272 275 276 283 290 291 292 293 294 295 296 299 309 313 314 315 0 1 1 1 0 1 1 1 1 1 0 1 0 1 0 1 0 0 0 0 1 1 0 1 1 0 1 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 1 0 1 1 1 0 0 1 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 1 1 0 0 1 0 1 1 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 1 0 1 0 1 0 0 0 1 0 0 317 318 319 322 323 324 332 333 336 337 344 347 358 359 360 365 368 369 371 379 380 386 392 396 397 398 402 406 409 413 415 416 422 423 426 427 430 433 437 440 445 446 454 455 462 1 0 1 1 0 1 1 1 1 1 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 1 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 464 469 479 487 500 507 516 520 522 524 525 527 614 620 676 1 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 Phụ lục 6: KẾT QUẢ XỬ LÝ THỐNG KÊ 16 TỔ HỢP PRIMER CHỌN LỌC ĐỂ CHỌN RA NHỮNG TỔ HỢP PRIMER TỐT NHẤT BẰNG PHẦN MỀM MINITAB 13 One-way ANOVA: So SP khuech dai versus To hop Analysis of Variance for So SP kh Source DF SS MS To hop 15 5544.6 369.6 Error 32 765.3 23.9 Total 47 6310.0 Level 10 11 12 13 14 15 16 N 3 3 3 3 3 3 3 3 Pooled StDev = Mean 1.000 31.000 2.667 7.000 0.667 11.333 21.333 8.667 35.000 23.333 9.667 4.000 2.667 5.333 3.667 0.333 4.890 StDev 1.000 4.583 2.517 2.000 1.155 11.504 4.509 7.506 4.583 7.767 3.055 4.000 2.517 3.786 3.512 0.577 F 15.46 P 0.000 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev + -+ -+ -+( -* -) ( -* -) ( -* -) ( -* -) ( * -) ( -* ) ( -* -) ( -* -) ( -* -) ( -* ) ( * -) ( -* -) ( -* -) ( -* ) ( * -) ( -* -) + -+ -+ -+0 15 30 45 Phụ lục 7: KẾT QUẢ XỬ LÝ THỐNG KÊ TỔ HỢP PRIMER CHỌN LỌC ĐÃ LỰA CHỌN TRÊN CẢ 15 MẪU VÀ 11 MẪU CHO KẾT QUẢ BẰNG PHẦN MỀM MINITAB 13 Trên 15 mẫu One-way ANOVA: So SP khuech dai versus To hop Analysis of Variance for So SP kh Source DF SS MS Primer 1499 500 Error 56 12660 226 Total 59 14159 F 2.21 P 0.097 Individual 95% CIs For Mean Level N 15 15 15 15 Pooled StDev = Mean 6.40 15.33 20.33 13.40 StDev 10.89 17.27 17.31 13.70 15.04 Based on Pooled StDev + -+ -+ -+ -( -* -) ( -* -) ( * -) ( -* ) + -+ -+ -+ -0.0 8.0 16.0 24.0 Trên 11 mẫu cho kết One-way ANOVA: So SP khuech dai versus To hop Analysis of Variance for So SP kh Source DF SS MS To hop 2044 681 Error 40 7919 198 Total 43 9964 Level N 11 11 11 11 Pooled StDev = Mean 8.73 20.91 27.73 18.27 14.07 StDev 11.98 17.01 13.93 12.84 F 3.44 P 0.026 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev + -+ -+ -( * -) ( * -) ( * -) ( -* ) + -+ -+ -10 20 30 Phụ lục : BẢNG ĐẶC ĐIỂM 30 MẪU ĐƯỚC ĐÔI THU THẬP Ở VÙNG LÕI KDTSQ RNM CẦN GIỜ Ghi Tên mẫu Tọa độ 100 31’ 253 1060 52’ 349 6b 100 31’ 307 1060 52’ 269 6b 100 31’ 221 1060 52’ 341 6b 10030’115 1060 52’ 004 11 Cây cao to, có nhánh, phân tán đều, nhiều sâu, u cành, có nâu xanh, có nụ Cây cao to, nhánh, có nụ, sum xuê, thân thẳng Cây nhỏ, thân, thưa thớt, có nụ, hoa Cây cao to, mọc khỏe, tươi tốt 10030’220 1060 52’ 160 11 10034’225 1060 52’ 330 11 100 30’ 585 1060 53’ 210 12 100 30’ 598 1060 53’ 295 12 100 30’ 598 1060 53’ 295 12 10 100 30’ 593 1060 53’ 469 12 11 100 30’ 552 1060 53’ 559 12 Tiểu khu 12 10 31’356 106 54’ 439 6b 13 100 31’ 79 1060 54’ 136 6b Đặc điểm Tái sinh tự nhiên Trồng Năm trồng Nguồn gốc 1980 Cà Mau 1980 Cà Mau 1978 Cà Mau Cây cao, ốm yếu, 1979 Cà Mau Cây nhỏ, ốm yếu, bị mối 1991 Cà Mau 1979 Cà Mau 1979 Cà Mau 1979 1978 Cà Mau Cây to cao, có hoa, sum xuê, số bị sâu Cây nhỏ, thấp, sum xuê Cây nhỏ thấp, thưa, xanh nhợt Cây to cao, thưa bị sâu, có hoa, Cây to cao, thưa bị sâu, có nụ Cây cao to, mọc khỏe, tươi tốt Cây thân, nhỏ, nhiều nụ, ít, sum xuê, tươi tốt X X X X Cà Mau 14 10o31’181 15 100 31’ 114 1060 54’ 287 6b 16 100 31’ 165 1060 54’ 349 6b 17 100 31’ 272 1060 54’ 376 6b 18 10034’035 1060 53’ 525 19 100 34’ 559 1060 54’ 391 13 20 100 34’ 592 1060 54’ 319 13 21 10034’101 1060 53’ 434 22 100 32’ 112 1060 54’ 274 23 100 32’ 186 1060 54’ 304 24 100 32’ 273 1060 54’ 353 25 10034’492 106054’338 26 10033’392 1060 53’ 454 4b 27 10033’082 1060 54’ 016 4b Cây nhỏ, tươi tốt, sum xuê Cây nhỏ, thấp, thưa, u cành, có sâu Cây to cao, tươi tốt bị sâu, có nhiều quả, hoa Cây thân, cao to, sum xuê, tươi tốt, có nhiều nâu xanh, có nụ hoa nhiều Cây thấp nhỏ, thân Cây thấp nhỏ, sum xuê, tươi tốt, nhiều Cây cao to, thẳng, sum xuê, tươi tốt, có nụ Thân thẳng, thấp, phân nhiều cành, có nhiều nụ Cây nhỏ thân thẳng, nhiều sâu, có nụ Cây nhỏ, thân thẳng, sum xuê, có sâu, có hoa Cây nhỏ, thân thẳng, có nụ, có hoa, có sâu Cây cao to, thân, có hoa, xanh nâu Cây nhỏ, thẳng, phân nhánh cao, có hoa, thưa Cây nhỏ, cao, thân, có quả, có nụ 106055’33 6b X X 1980 Cà Mau 1980 Cà Mau 1979 Cà Mau 1980 Cà Mau 1981 Cà Mau X X X X X X X 28 10 34’575 106 53’ 571 4b Cây nhỏ, thấp X 29 10033’232 1060 53’ 532 4b Cây nhỏ, thấp, có nụ, thưa X 30 10033’286 1060 53’ 515 4b Cây tươi tốt, thân thẳng, nhỏ, có hoa X ... Xây dựng quy trình AFLP để đánh giá đa dạng di truyền quần thể đước đơi  Bước đầu phân tích đánh giá tính đa dạng di truyền quần thể đước đơi vùng lõi Khu dự trữ sinh rừng ngập mặn Cần Giờ 1.2.2... đa dạng sinh học hệ sinh thái Trong đề tài sử dụng kỹ thuật AFLP đánh giá đa dạng di truyền quần thể đước đôi (Rhizophora apiculata Blume) vùng lõi Khu dự trữ sinh rừng ngập mặn Cần Giờ Những... tháng 9/2008 Đề tài: ? ?Ứng dụng kỹ thuật AFLP đánh giá đa dạng di truyền quần thể đước đôi (Rhizophora apiculata Blume) vùng lõi Khu dự trữ sinh quyễn rừng ngập mặn Cần Giờ? ?? Giáo viên hướng dẫn: