Nghiên cứu tính đa dạng di truyền của bò nuôi tại tỉnh hà giang và bò hoang dã ở việt nam bằng các kỹ thuật di truyền phân tử

MỤC LỤC CÁC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT vi DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ HÌNH vi MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU .4 1.1 ĐA DẠNG DI TRUYỀN 1.1.1 Khái niệm .4 1.1.2 Tầm quan trọng đa dạng di truyền 1.1.3 Bảo tồn đa dạng di truyền 1.2 PHƢƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN 1.3 KỸ THUẬT MICROSATELLITE 10 1.3.1 Giới thiệu 10 1.3.2 Sự phân bố microsatellite thể sinh vật 11 1.3.3 Phân loại microsatellite dạng trình tự microsatellite 12 1.3.4 Vai trò microsatellite 13 1.3.5 Phƣơng pháp xác định microsatellite 14 1.4 KỸ THUẬT PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ ADN HỆ GEN TY THỂ (mtDNA) 16 1.5 MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM CỦA BÕ NUÔI 18 1.5.1 Sự phân loại bị ni 18 1.5.2 Nguồn gốc hoá bị ni 21 1.5.3 Sự đa dạng phân bố bò nuôi ngày 22 1.6 ĐẶC ĐIỂM QUẦN THỂ BÕ NUÔI Ở TỈNH HÀ GIANG 23 1.6.1 Điều kiện địa lý, xã hội tỉnh Hà Giang 23 1.6.2 Đặc điểm quần thể bị ni tỉnh Hà Giang 24 1.7 NHỮNG NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA BÕ NUÔI TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM 25 1.7.1 Nghiên cứu đa dạng di truyền bị ni giới 25 1.7.2 Tình hình nghiên cứu đa dạng di truyền vật ni nói chung bị nói riêng Việt Nam 28 1.8 MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM CỦA BÕ TÓT (BOS GAURUS) VÀ BÕ RỪNG (BOS JAVANICUS) 29 1.8.2 Đặc điểm phân bố bị tót (Bos gaurus) 30 1.8.3 Hiện trạng phân bố bị tót Việt Nam 32 1.8.4 Đặc điểm phân bố bò rừng (Bos javanucus) 35 1.8.5 Hiện trạng phân bố bò rừng Việt Nam 36 1.9 NHỮNG NGHIÊN CỨU DI TRUYỀN Ở BÕ TÓT VÀ BÕ RỪNG 39 CHƢƠNG ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 41 2.1 ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU .41 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 41 2.2.1 Phƣơng pháp nghiên cứu quần thể bị ni Hà Giang 41 2.2.1.1 Thu thập mẫu 41 2.2.1.2 Tách chiết ADN 41 2.2.1.3 Phƣơng pháp phân tích đa dạng di truyền hệ gen nhân 42 iv 2.2.1.4 Phƣơng pháp phân tích đa dạng di truyền hệ gen ty thể 45 2.2.1.5 Phƣơng pháp phân tích thống kê 46 2.2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu quần thể bò hoang dã 50 2.2.2.1 Thu thập mẫu 50 2.2.2.2 Tách chiết ADN từ mẫu phân 51 2.2.2.3 Xác định ảnh hƣởng số yếu tố bảo quản mẫu phân đến kết tách chiết ADN 52 2.2.2.4 Xác định lồi giới tính 53 2.2.2.5 Phân tích đa dạng di truyền 54 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 56 ĐA DẠNG DI TRUYỀN QUẦN THỂ BÕ NUÔI TẠI HÀ GIANG 56 3.1.1 Tính đa dạng kiểu hình .56 3.1.1.1 Đa dạng màu sắc lông 56 3.1.1.2 Đa dạng hình dáng sừng 56 3.1.2 Tính đa dạng di truyền .57 3.1.2.1 Kết phân tích kích thƣớc alen locút microsatellites 57 3.1.2.2 Tính đa hình locút microsatellites 61 3.1.2.3 Tính đa dạng di truyền cân Hardy-Weinberg 61 3.1.2.4 Tính đa dạng sai khác di truyền quần thể bò phân bố huyện 66 3.1.2.5 Mối tƣơng quan khoảng cách di truyền khoảng cách địa lý 70 3.1.2.6 Đặc điểm cấu trúc di truyền quần thể bị ni Hà Giang 71 3.1.2.7 Tính đa dạng di truyền hệ gen ty thể 75 3.1.2.8 Mối quan hệ di truyền bò Hà Giang với số quần thể bò khác 77 3.2 ĐA DẠNG DI TRUYỀN QUẦN THỂ BÕ TÓT VÀ BÕ RỪNG 81 3.2.1 Kết tách chiết ADN 81 3.2.2 Ảnh hƣởng mốt sô yếu tố bảo quản mẫu đến kết tách ADN .85 3.2.2.1 Ảnh hƣởng thời gian bảo quản mẫu phân 85 3.2.2.2 Ảnh hƣởng dung dịch bảo quản đến kết tách chiết ADN 86 3.2.2.3 Ảnh hƣởng nhiệt độ bảo quản mẫu phân 87 3.2.3 Kết xác định loài 87 3.2.4 Kết xác định giới tính .92 3.2.5 Đa dạng di truyền quần thể bị tót 93 3.2.6 Đa dạng di truyền quần thể bò rừng 100 KẾT LUẬN 1045 ĐỀ NGHỊ 106 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ 107 TÀI LIỆU THAM KHẢO 108 v CÁC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT ADN: Deoxyribonucleic acid (một dạng vật chất di truyền) PCR: Polymerase Chain Reaction (phản ứng chuỗi trùng hợp) SSCPs: Single Strand Conformation Polymorphisms (đa hình cấu trúc sợi đơn) AFLPs: Amplified Fragment Length Polymorphisms (đa hình độ dài đoạn nhân chọn lọc) SNP: Single Nucleotide Polymorphisms (đa hình đơn nucleotid) RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphisms (đa hình độ dài đoạn cắt enzyme giới hạn) RAPD: Random Amplified Polymorphic DNA (đa hình độ dài đoạn ADN nhân ngẫu nhiên) VNTR: Variable Number of Tandem Repeats (chỉ vùng hệ gen đặc trƣng lặp lại trình tự ADN) MPX: Multiplex PCR (phản ứng PCR đa mồi) FAO : Food and Agriculture Organization (Tổ chức nông lƣơng giới) IUCN: International Union for Consevation of Nature (Tổ chức bảo vệ tài nguyên thiên nhiên quốc tế) ISAG: International Society of Animal Genetis (Hội di truyền động vật quốc tế) EDTA: Ethylen-Diamin-Tetra-Acetic acid Bp: Base pair (cặp bazơ) Cyt b: Cytochrome b (một gen phân tử ADN ty thể) D-loop: Displacement loop (vùng điều khiển phân tử ADN ty thể) NJ: Neighbor – Joining Method (phƣơng pháp liên kết nhóm liền kề) UPGMA: Unweighted Paired Group Method of Arithmetic Average vi DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ HÌNH TRONG LUẬN ÁN Các bảng Bảng 1.1: Đặc điểm số kỹ thuật phân tử việc đánh giá đa dạng di truyền Bảng 1.2:Một số nghiên cứu đa dạng di truyền vật nuôi sử dụng kỹ thuật microsatellite 16 Bảng 2.1: Một số thông tin 30 cặp mồi microsatellite sử dụng nghiên cứu 43 Bảng 2.2: Cơng thức tính giá trị thống kê quần thể 47 Bảng 2.3: Địa điểm thu thập mẫu sinh học bò hoang dã 51 Bảng 2.4: Các điều kiện bảo quản mẫu phân bò để xác định yếu tố ảnh hƣởng đến kết tách chiết ADN 52 Bảng 3.1: Số lƣợng alen khoảng kích thƣớc alen locút microsatellite nghiên cứu quần thể bò Hà Giang 62 Bảng 3.2: Tần số di hợp tử lý thuyết (Hep), quan sát (Hob), hệ số cận huyết (Fis) kết kiểm tra locút microsatlite với giả thiết không cân di truyền Hardy-Weinberg 63 Bảng 3.3: So sánh tính đa dạng di truyền quần thể bò Hà Giang với số kết nghiên cứu quần thể bò khác 65 Bảng 3.4: Tần số di hợp tử lý thuyết (Hep), tần số dị hợp tử quan sát (Hob), trung bình số alen locút (K), hệ số đồng huyết (Fis), kiểm định với giả thiết không tuân theo định luật di truyền Hardy- Weinberg quần thể bò huyện 66 Bảng 3.5: Ma trận sai khác di truyền (FST) quần thể bò huyện 67 Bảng 3.6: Ma trận khoảng cách di truyền (Ds) quần thể bò phân bố huyện theo Nei (1972) 68 Bảng 3.7: Tỷ lệ hệ gen bò xã nghiên cứu đƣợc định thuộc nhóm 73 Bảng 3.8: Ma trận khoảng cách di truyền quần thể 77 Bảng 3.9: Tổng hợp kết tách chiết ADN từ mẫu phân bò hoang dã 83 Bảng 3.10: Ma trận khoảng cách di truyền số nhóm bị tót 99 Bảng 3.11: Ma trận khoảng cách di truyền bò rừng mang kiểu haplotype khác 101 vii Các hình Hình 1.1: Cấu trúc phân tử ADN ty thể bị ni 17 Hình 1.2: Hệ thống phân loại bị ni, bị hoang dã số lồi liên quan 19 Hình 1.3: Sự phân bố lồi phụ bị rừng cổ 20 Hình 1.4: Sự phổ biến bị hố khắp nới giới cổ sinh 22 Hình 1.5: Sự phân bố loại bò ngày Châu Á, Châu Phi Châu Âu 23 Hình 1.6: Hình ảnh cá thể bị tót (Bos gaurus) Thảo Cầm Viên 31 Hình 1.7 Bản đồ phân bố bị tót số khu vực giới 33 Hình 1.8: Bản đồ phân bố bị tót Việt Nam 34 Hình 1.9: Hình ảnh bị rừng (Bos javanicus) 35 Hình 1.10: Bản đồ phân bố bò rừng số khu vực giới 37 Hình 1.11: Bản đồ phân bố bò rừng Việt Nam 38 Hình 2.1: Vị trí địa điểm thu mẫu sinh học bị ni tỉnh Hà Giang 42 Hình 2.2: Hệ thống máy giải trình tự CEQ8000 44 Hình 3.1: Biểu đồ phân bố đa dạng màu sắc lơng quần thể bị Hà Giang 56 Hình 3.2: Biểu đồ phân bố đa dạng hình dáng sừng quần thể bị Hà Giang 57 Hình 3.3: Một số kết phân tích kích thƣớc alen locút microsatellite 60 Hình 3.4: Cây phân loại thể mối quan hệ di truyền quần thể bị huyện dạng có gốc (rooted tree) 69 Hình 3.5: Cây phân loại thể mối quan hệ di truyền quần thể bò huyện dạng không gốc (unrooted tree) 69 Hình 3.6: Tƣơng quan khoảng cách di truyền khoảng cách đại lý 70 Hình 3.7: Kết phân tích khả phân chia thành nhóm quần thể bị Hà Giang 71 Hình 3.8: Sự phân bố cấu trúc di truyền nhóm bị (quần thể phụ) tỉnh Hà Giang 74 Hình 3.9: Sự đa dạng trình tự vùng D-loop ty thể 67 mẫu bị 76 Hình 3.10: Cây phân loại thể mối quan hệ di truyền 67 mẫu bị 80 Hình 3.11: Điện di đồ kết sau nhân PCR vùng D-loop bị hoang dã 82 Hình 3.12: Điện di đồ kết sau nhân PCR với cặp mồi giới tính 82 Hình 3.13: Biểu đồ kết phản ứng PCR xác định giới tính đối thời gian bảo quản mẫu 86 Hình 3.14: So sánh trình tự ADN đoạn gen Cytochrome b bị ni, bị tót bị rừng 89 Hình 3.15: So sánh trình tự ADN vùng D-loop bị ni, bị tót bị rừng 91 Hình 3.16: So sánh trình tự ADN kiểu haplotype quần thể bị tót 98 Hình 3.17: So sánh trình tự ADN kiểu haplotype quần thể bị rừng 103 Hình 3.18: Cây phân loại di truyền bị tót, bị rừng, bị Tây Tạng, bị rừng Châu Âu bị ni .104 viii MỞ ĐẦU Đánh giá tính đa dạng đặc điểm di truyền quần thể, giống vật nuôi động vật hoang dã mức độ phân tử đƣợc coi công việc mở đầu cần thiết chƣơng trình bảo tồn [88] Chính vậy, từ năm 1990 tổ chức Nông lƣơng giới (FAO) xây dựng chƣơng trình tổng thể sử dụng kỹ thuật di truyền phân tử để đánh giá đa dạng di truyền thân quần thể quần thể vật nuôi nhằm định hƣớng cho việc quản lý, bảo tồn sử dụng nguồn gen động vật ni tồn cầu Trong năm gần đây, phƣơng pháp sinh học phân tử đóng vai trị quan trọng nghiên cứu di truyền quần thể đa dạng di truyền Nhiều kỹ thuật di truyền phân tử đƣợc sử dụng nghiên cứu đa dạng di truyền nhƣ: RFLP, RAPD, minisatellites, microsatellites phân tích đa hình hệ gen ty thể Trong đó, kỹ thuật microsatellite phân tích trình tự hệ gen ty thể nhanh chóng trở thành kỹ thuật hữu hiệu đƣợc sử dụng rộng rãi nghiên cứu di truyền quần thể nhiều lồi vật ni hoang dã khác Việt Nam quốc gia có đa dạng tài nguyên thiên nhiên sinh vật cao Tuy nhiên, tính đa dạng hệ động vật Việt Nam, đặc biệt số quần thể vật nuôi địa khu vực miền núi quần thể động vật hoang dã có giá trị sinh học di sản bị đe doạ kinh tế thị trƣờng phát triển khai thác, sử dụng q mức ngƣời Bị ni Hà Giang giống vật nuôi địa đƣợc hố, chọn lọc, ni dƣỡng từ lâu đời ngƣời H’mơng chúng đáp ứng tốt với điều kiện khí hậu khơ rét vùng cao có giá trị văn hố đồng thời mang tính đặc hữu tỉnh Hà Giang Tuy nhiên, hệ thống chăn nuôi thâm canh, nhập giống ngoại có suất cao đƣợc đầu tƣ lớn dẫn đến nguy giống bò Bên cạnh đó, hai lồi bị hoang dã bị tót (Bos gaurus) bị rừng (Bos javanicus), ngồi giá trị sinh học nội giá trị di sản quốc gia nguồn gen quý cần đƣợc bảo tồn Nhƣng nạn săn bắt trái phép, phá huỷ môi trƣờng sống dịch bệnh dẫn đến tình trạng suy giảm nhanh lồi bị hoang dã Số lƣợng bị tót nƣớc giảm xuống mức thấp, khoảng 300 cá thể Trong đó, số lƣợng bị rừng cịn khoảng dƣới 100 cá thể Hiện nay, hai lồi bò hoang đứng bên bờ tuyệt chủng chúng chịu chung số phận với lồi bị xám (Bos sauveli), ngày bị coi tuyệt chủng Việt Nam Hiện tại, bị H’mơng ni Hà Giang hai lồi bị tót bò rừng hoang dã đối tƣợng đƣợc bảo tồn đặc biệt chƣơng trình dự án bảo tồn cấp Quốc gia Vì vậy, thơng tin trạng di truyền quần thể bò cần thiết quan trọng để hoạch định chiến lƣợc bảo tồn bền vững Xuất phát từ ý nghĩa thực tế trên, tiến hành thực đề tài “Nghiên cứu tính đa dạng di truyền bị ni tỉnh Hà Giang bị hoang dã Việt Nam kỹ thuật di truyền phân tử” Mục đích đề tài Xác định tính đa dạng di truyền cấu trúc di truyền bị ni tỉnh Hà Giang mức độ phân tử làm sở cho việc hoạch định kế hoạch chọn lọc, lai tạo, phát triển bảo tồn lâu dài Sử dụng công cụ phân tử để xác định tính đa dạng di truyền quần thể bị tót bị rừng hoang dã tồn số khu vực Việt Nam từ mẫu phân sinh học nhằm phục vụ cho việc xây dựng hoạt động bảo tồn phù hợp Nội dung nghiên cứu đề tài Sử dụng kỹ thuật microsatellite phân tích tính đa dạng di truyền cấu trúc di truyền quần thể bị ni tỉnh Hà Giang Phân tích tính đa dạng di truyền hệ gen ty thể bị ni Hà Giang sử dụng kỹ thuật phân tích trình tự ADN vùng D-loop Chuẩn hoá phƣơng pháp tách chiết ADN từ mẫu phân sinh học mẫu bò hoang dã Xác định lồi giới tính từ mẫu phân Xác định tính đa dạng di truyền hệ gen ty thể quần thể bị tót bị rừng sử dụng kỹ thuật phân tích trình tự ADN vùng D-loop Ý nghĩa khoa học đề tài Đây nghiên cứu sử dụng kỹ thuật di truyền phân tử để đánh giá tính đa dạng cấu trúc di truyền bị ni bị hoang dã phục vụ cho mục đích bảo tồn đƣợc thực Việt Nam Lần ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử để tiến hành nghiên cứu di truyền quần thể bị tót bị rừng từ mẫu sinh học đƣợc thu thập cách gián tiếp không gây ảnh hƣởng tới vật nhƣ mẫu phân, lông Ý nghĩa thực tiễn đề tài Kết nghiên cứu đề tài cung cấp thông tin cần thiết đặc điểm di truyền mức độ phân tử, góp phần làm sở khoa học cho việc xây dựng kế hoạch bảo tồn quần thể bị ni Hà Giang hai lồi bị hoang dã bị tót bò rừng Việt Nam CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 ĐA DẠNG DI TRUYỀN 1.1.1 Khái niệm Đa dạng di truyền mức độ đa dạng sinh học liên quan tới toàn đặc điểm đƣợc quy định chất di truyền lồi hay nói cách khác liên quan đến thay đổi mức độ nucleotide, gen, nhiễm sắc thể hay toàn hệ gen thể sinh vật Thông thƣờng tự nhiên cá thể hầu hết quần thể loài đa dạng mặt di truyền Một số giả thiết đƣợc đƣa để giải thích đa dạng di truyền quần thể nhƣ: i) Thuyết tiến hoá tự nhiên giả thiết đa dạng kết tích luỹ thay alen cách tự nhiên, ii) Sự chọn lọc đa dạng hoá với giả thiết hai quần thể phụ (subpopulation) loài sống hai điều kiện môi trƣờng khác chọn lọc alen khác locút đó, iii) Chọn lọc phụ thuộc vào tần số chọn lọc nhằm vào alen để giữ chúng tồn quần thể Vì vậy, nghiên cứu di truyền quần thể nghiên cứu số lƣợng tần số alen, tần số kiểu gen dạng áp lực trì biến đổi tần số alen kiểu gen cụ thể quần thể (Đỗ Lê Thăng cộng 2007) [13] 1.1.2 Tầm quan trọng đa dạng di truyền Đa dạng di truyền đóng vai trò quan trọng tồn đáp ứng quần thể Khi điều kiện môi trƣờng quần thể thay đổi, đột biến gen cần thiết cho đáp ứng tồn chúng Một quần thể có mức độ đa dạng di truyền lớn có có nhiều lựa chọn alen thích hợp nhất, quần thể có độ đa dạng thấp đối mặt với nguy hiểm cao Đa dạng di truyền làm ổn định tính sinh sản tốt quần thể Một quần thể có mức độ đa dạng di truyền thấp làm cho khả sinh sản trở nên khó khăn dẫn đến tƣợng đồng huyết hệ sau Trong nông nghiệp, đa dạng di truyền đóng vai trị quan trọng cung cấp nguồn biến dị cho trình chọn lọc để nâng cao suất, chất lƣợng trồng vật ni Vì vậy, trì tính đa dạng di truyền trọng tâm việc bảo tồn sinh học, tổ chức Bảo vệ tài nguyên thiên nhiên quốc tế (IUCN) thừa nhận cần thiết việc bảo tồn đa dạng di truyền nhƣ ba vấn đề ƣu tiên bảo tồn toàn cầu (McNeely cộng sự, 1990) [91] 1.1.3 Bảo tồn đa dạng di truyền Bảo tồn đa dạng di truyền trì đảm bảo tính đa dạng di truyền quần thể hay giống vật nuôi tự nhiên, hạn chế yếu tố tác động môi trƣờng ngƣời làm tính đa dạng di truyền Do đó, chƣơng trình bảo tồn đƣợc thiết lập nhằm bảo tồn đa dạng di truyền gìn giữ quần thể lồi có tính nguy cấp, nhà sinh học bảo tồn cần phải biết đƣợc đa dạng di truyền đƣợc trì nhƣ suốt q trình tự nhiên hay nói cách khác biết đƣợc yếu tố tác động đến đa dạng di truyền Vì vậy, nghiên cứu nhằm đánh giá đặc điểm di truyền tính đa dạng di truyền quần thể hay giống vật nuôi đặc biệt các lồi q có tính nguy cấp trƣớc đƣa định bảo tồn công việc cần thiết quan trọng 1.2 PHƢƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN Đa dạng di truyền đƣợc đánh giá dựa nhiều đặc điểm khác bao gồm: đặc điểm ngoại hình, protein, ADN hệ gen nhân ADN hệ gen ty thể Trƣớc phƣơng pháp đánh giá đa dạng di truyền chủ yếu sử dụng kỹ using mitochondrial DNA D-loop sequence polymorphism”, Biochemical Genetics 41, pp 91-98 [64] Kim K., Yeo J and Choi C (2002), “Genetic diversity of north-east Asian cattle based on microsatellite data”, Animal Genetics 33 (3), pp 201-204 [65] Kim T., Kim K., Choi B., Yoon D., Jang G., Lee K., Chung H., Lee H., Park H and Lee J (2005), “Genetic structure of pig breeds from Korea and China using microsatellite loci analysis”, Journal of Animal Science 83, pp 22552263 [66] Kimura M (1968a), “Evolutionary rate at the molecular level”, Nature 217, pp 624-626 [67] King D and Soller M (1999), “Variation and fidelity: the evolution of simple sequence repeats as functional elements in adjustable genes”, Evolutionary Theory and Processes: Modern Perspective, Papers in Honour of Eviatar Nevo, pp 65–82 [68] King D., Soller M and Kashi Y (1997), “Evolutionary tuning knobs” Endeavour 21 (1), pp 36-40 [69] Kohn M., Knauer F., Stoffella A., Schroder W and Paabo S (1995), “Conservation genetics of the European brown bear-a study using excremental PCR of nuclear and mitochondrial sequences”, Molecular Ecology (1), pp 95-104 [70] Kondo Y., Mori M., Kuramoto T., Yamada J., Beckmann J., SimonChazottes D., Montagutelli X., Guénet J and Serikawa T (1993), “DNA segments mapped by reciprocal use of microsatellite primers between mouse and rat”, Mammalian Genome (10), pp 571-576 [71] Lagercrantz U., Ellegren H and Andersson L (1993), “The abundance of various polymorphic microsatellite motifs differs between plants and vertebrates”, Nucleic Acids Research 21(5), pp.1111 115 [72] Le Vu Khoi (1995), The statuts of wild cattle and their conservation in Vietnam, Asian wild cattle assessement and management plan worshop, IUCN/SSC conservation Breeding specialist Group, pp.121-131 [73] Lei C., Chen H., Zhang H., Cai X., Liu R., Luo L., Wang C., Zhang W., Ge Q and Zhang R (2006), “Origin and phylogeographical structure of Chinese cattle”, Animal Genetics 37 (6), pp 579 [74] Lewontin R.C and Hubby J.L (1966), “A molecular approach to the study of genic heterozygosity in natural populations II Amount of variation and degree of heterozygosity in natural populations of Drosophila pseudoobscura”, Genetics 54, pp 595-609 [75] Li S., Yang S., Zhao S., Fan B., Yu M., Wang H., Li M., Liu B., Xiong T and Li K (2004), “Genetic diversity analyses of 10 indigenous Chinese pig populations based on 20 microsatellites”, Journal of Animal Science 82, pp 368-374 [76] Linh S (2000), A survey of wild cattle and other mamals, Cattien National Park-Vietnam, Technical Report No 14 to WWF-Cattien National Park Project-Vietnam [77] Litt M and Luty J.A (1989), “A hypervariable microsatellite revealed by in vitro amplification of a dinucleotide repeat within the cardiac muscle actin gene”, American Journal of Human Genetics 44, pp 397-401 [78] Liu R., YAang G and Lei C (2006), “The genetic diversity of mtDNA Dloop and the origin of Chinese goats”, Acta Genetica Sinica 33 (5), pp 420428 [79] Loftus R T., MacHugh D E., Bradley D G., Sharp P M and Cunningham P (1994a), “Evidence for two independent domestications of cattle”, Proceedings of The National Academy of Sciences USA 91 (7), pp 275761 116 [80] Loftus R T., MacHugh D E., Ngere L O., Balain D S., Badi A M., Bradley D G and Cunningham E P (1994b), “Mitochondrial genetic variation in European, African and Indian cattle populations”, Animal Genetics 25 (4), pp 265-71 [81] Loftus R., Ertugrul O., Harba A., El-Barody M., MacHugh D., Park S and Bradley D (1999), “A microsatellite survey of cattle from a centre of origin: the Near East”, Molecular Ecology (12), pp 2015-2022 [82] Machugh D E., Loftus R T., Bradley D G., Sharp P M and Cunningham P (1994), “Microsatellite DNA variation within and among European cattle breeds”, Proceedings Biological Sciences 256 (1345), pp 25-31 [83] MacHugh D E., Loftus R T., Cunningham P and Bradley D G (1998), “Genetic structure of seven European cattle breeds assessed using 20 microsatellite markers”, Animal Genetics 29, pp 333-340 [84] MacHugh D.E (1996), Molecular biogeography and genetic structure of domesticated cattle, PhD thesis, Uviversity of Dublin [85] Mannen H., Tsuji S., Loftus R and Bradley D (1998), “Mitochondrial DNA variation and evolution of Japanese black cattle (Bos taurus)”, Genetics 150 (3), pp 1169-1175 [86] Mantel N (1967), “The detection of disease clustering and a generalized regression approach”, Cancer Research 27, pp 209-220 [87] Manwell C and Baker C (1980), “Chemical classification of cattle Phylogenetic tree and specific status of the Zebu”, Animal Blood Groups and Biochemical Genetics 11 (3), pp 151-162 [88] Martin-Burriel I., Garcia-Muro E and Zaragoza P (1999), “Genetic diversity analysis of six Spanish native cattle breeds using microsatellites”, Animal Genetics 30 (3), pp 177-182 117 [89] Maudet C., Luikart G., Dubray D., Von Hardenberg A and Taberlet P (2004), “Low genotyping error rates in wild ungulate faeces sampled in winter”, Molecular Ecology Notes 4, pp 772-775 [90] Maxam A.M and Gilbert W (1977), “A new method for sequencing DNA”, Proceedings of The National Academy of Sciences USA 74, pp 560-564 [91] McNeely J., Miller K., Reid W., Mittermeier R and Werner T (1990), Conserving the world's biological diversity, Washington, DC [92] Meadow R.H (1984), Animal domestication in the Middle East: a view from the Eastern margin In: Animals and Archaeology: Early Herders and their Flocks, Oxford: Oxford University Press pp, 309-337 [93] Meadow R.H (1993), Animal domestication in the Middle East: A revised view from the Eastern Margin In: Harappan Civilisation (2nd ed.), New Delhi: Oxford & IBH pp 295-320 [94] Meselson M and Yuan R (1968), “DNA restriction enzyme from E coli”, Nature 217, pp 1110-1114 [95] Moazami-Goudarzi K., Laloe D., Furet J and Grosclaude F (1997), “Analysis of genetic relationships between 10 cattle breeds with 17 microsatellites”, Animal Genetics 28 (5), pp 338 [96] Moore S., Sargeant L., King T., Mattick J., Georges M and Hetzel D (1991), “The conservation of dinucleotide microsatellites among mammalian genomes allows the use of heterologous PCR primer pairs in closely related species”, Genomics 10 (3), pp 654 [97] Moran C (1993), “Microsatellite repeats in pig (Sus domestica) and chicken (Gallus domesticus) genomes”, Journal of Heredity 84 (4), pp 274 [98] Morgante M and Olivieri A.M (1993), “PCR-amplified Microsatellites as marker in plant genetics”, Plant Journal (1), pp 175-182 118 [99] Mukesh M., Sodhi M., Bhatia S and Mishra B (2004), “Genetic diversity of Indian native cattle breeds as analysed with 20 microsatellite loci”, Journal of Animal Breeding and Genetics 121 (6), pp 416-424 [100] Mullis K., Faloona F., Scharf S., Saiki R., Horn G and Erlich H (1986), “Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction”, Cold Spring Harbo Symposium in Quantitative Biology 51, pp 263-273 [101] Nabholz B., Glemin S and Galtier N (2008), “Strong Variations of Mitochondrial Mutation Rate across Mammals - the Longevity Hypothesis”, Molecular Biology and Evolution 25 (1), pp 120 [102] Nei M (1972), “Genetic distance between populations”, American Naturalist.106, pp 283-292 [103] Nei M (1978), “Estimation of average heterozygosity and genetic distance from small number of individuals”, Genetics 89, pp.283-292 [104] Nguyen T., Genini S., Bui, L., Voegeli, P., Stranzinger, G., Renard, J., Maillard J and Nguyen B (2007), “Genomic conservation of cattle microsatellite loci in wild gaur (Bos gaurus) and current genetic status of this species in Vietnam”, BMC genetics (1), pp 77 [105] Oliveira J., Igarashi M., Machado T., Miretti M., Ferro J and Contel E (2007), “Structure and genetic relationships between Brazilian naturalized and exotic purebred goat domestic goat (Capra hircus) breeds based on microsatellites”, Genetics and Molecular Biology 30, pp 356-363 [106] Payne W and Hodges J (1995), Tropical cattle: Origins, breeds and breeding policy, Blackwell Science, Oxford [107] Phillips R (1961), “World distribution of the major types of cattle”, Journal of Heredity 52 (5), pp 207 119 [108] Prayurasiddhi T (1997), The ecological separation of gaur (Bos gaurus) and banteng (Bos javanicus) in Huai Kha Khaeng Wildlife Sanctuary, Thailand, University of Minnesota [109] Pritchard J.K., Stemphens M and Donnelly P (2000), “Inference of population structure using multilocus genotype data”, Genetics 155, pp 945-959 [110] Raymond M and Rousset F (2004), Genepop [111] Ritz L., Glowatzki-Mullis M., MacHugh D and Gaillard C (2000), “Phylogenetic analysis of the tribe Bovini using microsatellites”, Animal Genetics.31 (3), pp.178 [112] Röder M., Plaschke J., König S., Börner A., Sorrells M., Tanksley S and Ganal M (1995), “Abundance, variability and chromosomal location of microsatellites in wheat”, Molecular and General Genetics MGG 246 (3), pp.327-333 [113] Rozas J., Sanchez-DelBarrio J., Messeguer X and Rozas R (2003), “DnaSP, DNA polymorphism analyses by the coalescent and other methods”, in: Bioinformatics, Oxford Univ Press, pp 2496-2497 [114] Sanger F., Niclen S., Coulson A.R (1977), “DNA sequencing with chainterminating inhibitors”, Proceedings of The National Academy of Sciences USA 74, pp 5463-5467 [115] Schmid B., Saitbekova N., Gaillard C and Dolf G (1999), “Genetic diversity in Swiss cattle breeds”, Journal of Animal Breeding and Genetics 116 (1), pp 1-8 [116] Serikawa T., Kuramoto T., Hilbert P., Mori M., Yamada J., Dubay C., Lindpainter K., Ganten D., Guenet J and Lathrop G (1992), “Rat gene mapping using PCR-analyzed microsatellites”, Genetics 131 (3), pp 701721 120 [117] Sibley C.G., Ahlquist J.E (1990), Phylogeny and Classification of Birds, New Haven, CT:Yale University Press [118] Sibley C.G., Comstock JA and Ahlquist J.E (1990), “DNA hybridisation evidence of hominoid phylogeny: a reanalysis of the data” Journal of Molecular Evolution 30, pp 202 [119] Singer-Sam J., Tanguay R and Riggs A (1989), “Use of Chelex to improve the PCR signal from a small number of cells”, Amplification 3(1), pp 11-16 [120] Soriyun M (2001), “Status and distribution of wild cattle in Cambodia”, Tigerpaper (FAO).28 (3), pp 9-14 [121] Srikosamatara S and Suteethorn V (1995), “Populations of Gaur and Banteng and their management in Thailand”, Natural History Bulletin of the Siam Society 43, pp 55-83 [122] Steinmetz R (2004), “Gaur (Bos gaurus) and Banteng (B javanicus) in the lowland forest mosaic of Xe Pian Protected Area, Lao PDR: abundance, habitat use, and conservation, Mammalia 68 (2-3), pp 141-158 [123] Suzuki R., Kemp S and Teale A (1993), “Polymerase chain reaction analysis of mitochondrial DNA polymorphism in N'Dama and Zebu cattle”, Animal Genetics 24 (5), pp 339-343 [124] Taberlet P and Luikart G (1999), “Non-invasive genetic sampling and individual identification”, Biological Journal of the Linnean Society 68 (12), pp 41-55 [125] Taberlet P., Camarra J., Griffin S., Uhres E., Hanotte O., Waits L., DuboisPaganon C., Burke T and Bouvet J (1997), “Noninvasive genetic tracking of the endangered Pyrenean brown bear population”, Molecular Ecology (9), pp 869-876 121 [126] Tamura K., Dudley J., Nei M and Kumar S (2007), “MEGA4: molecular evolutionary genetics analysis (MEGA) software version 4.0”, Molecular Biology and Evolution 24 (8), pp 1596 [127] Tamura K (1993), “Estimation of the number of nucleotide substitutions in the control region of mitochondrial DNA in humans and chimpanzees”, Molecular Biology and Evolution 10 (3), pp 512-526 [128] Tautz D, Renz M (1984), “Simple sequences are ubiquitous repetitive components of eukaryotic genomes”, Nucleic Acids Research.12 (10), pp 4127-4138 [129] Tautz D (1989), “Hypervariability of simple sequenc DNA markers”, Nucleic Acids Research.17 (16), pp 6463-6471 [130] Thevenon S., Thuy, L., Ly, L., Maudet, F., Bonnet, A., Jarne, P and Maillard, J (2004), “Microsatellite analysis of genetic diversity of the Vietnamese sika deer (Cervus nippon pseudaxis)”, Journal of Heredity 95(1), pp 11 [131] Thuy N., Melchinger-Wild E., Kuss A., Cuong N., Bartenschlager H and Geldermann H (2006), “Comparison of Vietnamese and European pig breeds using microsatellites”, Journal of Animal Science 84 (10), pp 2601 [132] Troy C., MacHugh D., Bailey J., Magee D., Loftus R., Cunningham P., Chamberlain A., Sykes B and Bradley D (2001), “Genetic evidence for Near-Eastern origins of European cattle”, Nature a-z index 410 (6832), pp 1088-1091 [133] Vadhanakul N., Tansatit M and Tunwattana W (2003), “Karyotype of a Thai gaur sire of Khao Kheow Open Zoo”, Journal of the Thai Veterinary Medical Association 54 (3), pp 39-48 [134] Van Hoof W., Groen A and Prins H (2003), “Genetic structure of African buffalo herds based on variation at the mitochondrial D-loop and autosomal 122 microsatellite loci: Evidence for male-biased gene flow”, Conservation Genetics (4), pp 467-477 [135] Verkaar E., Nijman I., Beeke M., Hanekamp E and Lenstra J (2004), “Maternal and paternal lineages in cross-breeding bovine species Has wisent a hybrid origin”, Molecular Biology and Evolution 21 (7), pp 1165-1170 [136] Walsh P., Metzger D and Higuchi R (1991), “Chelex 100 as a medium for simple extraction of DNA for PCR-based typing from forensic material”, Biotechniques 10 (4), pp 506 [137] Wang Z., Weber J.L., Zhong G and Tanksley S.D (1994), “Survey of plant short tandem DNA repeats”, Theoretical and Applied Genetics 88, pp 1-6 [138] Weber J.L and May P.E (1989), “Abundant class of human DNA polymorphisms which can be typed using the polymerase chain reaction”, American Journal of Human Genetics 44, pp 388-396 [139] Wehausen J., Ramey R and Epps C (2004), “Experiments in DNA extraction and PCR amplification from bighorn sheep feces: the importance of DNA extraction method”, Journal of Heredity 95 (6), pp 503 [140] Wei B.S and Cockerham C.C (1984), “Estimating F-statistics for the analysis of population structure”, Evolution 38, pp.1358-1370 [141] Williams J.G.K., Kubelik A.R., Livak J and Tingey S.V (1990), “DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers”, Nucleic Acids Research 18, pp 6531-6535 [142] Yu Y., Nie L., He Z., Wen J., Jian C and Zhang Y (1999), “Mitochondrial DNA variation in cattle of South China: origin and introgression”, Animal Genetics 30 (4), pp 245 [143] Zhang G., Wang Z., Chen, W., Wu C., Han X., Chang H., Zan L., Li R., Wang J and Song W (2007), “Genetic diversity and population structure of 123 indigenous yellow cattle breeds of China using 30 microsatellite markers”, Animal Genetics 38 (6), pp 550 [144] Zhang Y., Sun D and Yu Y (2007), “Genetic diversity and differentiation of Chinese domestic buffalo based on 30 microsatellite markers”, Animal Genetics 38 (6), pp 569 124 PHỤ LỤC 1 Một số kết sắc đồ giải trình tự vùng D-loop mẫu bị tót bị rừng mang kiểu haplotype khác 125 PHỤ LỤC Kết tách chiết ADN xác định loài từ mẫu phân số khu vực nghiên cứu Số mẫu Tách chiết ADN thành cơng Kết xác định lồi Phân 520 191 Bị tót (191) Vƣờn quốc gia Bù Gia Mập-Bình Phƣớc Phân Bị tót (1) Bị rừng (3) Khu bảo tồn thiên nhiên Ea Sô - Đăk Lăk Phân 20 17 Bị tót (3) Bị rừng (14) Vƣờn quốc gia Yok Đơn - Đăk Lăk Phân Bị rừng Vƣờn quốc gia Phong Nha Kẻ Bàng-Quảng Bình Phân 0 Khu bảo tồn thiên nhiên Krông Trai-Phú Yên Da đầu 1 Bò rừng Thảo Cầm Viên thành phố Hồ Chí Minh Phân 1 Bị tót Vƣờn thú Paris - Cộng hoà Pháp Máu 2 Bị tót (1) Bị rừng (1) Vƣờn thú Madrid -Tây Ban Nha Phân 4 Bị tót Vƣờn thú Copahagen Đan Mạch Máu 2 Bị tót Khu bảo tồn động vật hoang dã - Campuchia Máu mô 3 Bị tót (2) Bị rừng Loại mẫu Vƣờn quốc gia Cát TiênĐồng Nai Địa điểm thu mẫu 126 Kết tách chiết ADN xác định giới tính từ mẫu phân số khu vực nghiên cứu Số mẫu Tách chiết ADN thành công Kết xác định loài 520 191 Đực: 79 Loại mẫu Vƣờn quốc gia Cát TiênĐồng Nai Phân Vƣờn quốc gia Bù Gia Mập-Bình Phƣớc Phân Khu bảo tồn thiên nhiên Ea Sô - Đăk Lăk Phân Vƣờn quốc gia Yok Đôn - Đăk Lăk Phân Cái Vƣờn quốc gia Phong Nha Kẻ Bàng-Quảng Bình Phân 0 Khu bảo tồn thiên nhiên Krông Trai-Phú Yên Da đầu 1 Cái Thảo Cầm Viên thành phố Hồ Chí Minh Phân 1 Đực Địa điểm thu mẫu Cái: 112 Đực: Cái: 20 17 Đực: Cái: 12 127 PHỤ LỤC 128 PHỤ LỤC Một số hình ảnh khảo sát thu thập mẫu phân bị hoang dã ngồi thực địa 129 ... bị ni tỉnh Hà Giang bị hoang dã Việt Nam kỹ thuật di truyền phân tử? ?? Mục đích đề tài Xác định tính đa dạng di truyền cấu trúc di truyền bị ni tỉnh Hà Giang mức độ phân tử làm sở cho việc hoạch... trọng nghiên cứu di truyền quần thể đa dạng di truyền Nhiều kỹ thuật di truyền phân tử đƣợc sử dụng nghiên cứu đa dạng di truyền nhƣ: RFLP, RAPD, minisatellites, microsatellites phân tích đa hình... nghiên cứu đề tài Sử dụng kỹ thuật microsatellite phân tích tính đa dạng di truyền cấu trúc di truyền quần thể bị ni tỉnh Hà Giang Phân tích tính đa dạng di truyền hệ gen ty thể bị ni Hà Giang