Ứng dụng phương pháp mô học truyền thống khảo sát sự biến đổi cấu trúc tế bào tôm càng xanh

Ứng dụng phương pháp mô học truyền thống khảo sát sự biến đổi cấu trúc tế bào tôm càng xanh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ỨNG DỤNG PHƢƠNG PHÁP MÔ HỌC TRUYỀN THỐNG KHẢO SÁT SỰ BIẾN ĐỔI CẤU TRÚC TẾ BÀO TÔM CÀNG XANH (Macrobrachium rosenbegii De Man 1879) BỊ BỆNH ĐỤC THÂN Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khoá: 2003 – 2007 Sinh viên thực hiện: NGUYỄN MINH VÀNG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ỨNG DỤNG PHƢƠNG PHÁP MÔ HỌC TRUYỀN THỐNG KHẢO SÁT SỰ BIẾN ĐỔI CẤU TRÚC TẾ BÀO TÔM CÀNG XANH (Macrobrachium rosenbegii De Man 1879) BỊ BỆNH ĐỤC THÂN Giáo viên hƣớng dẫn: TS. LÝ THỊ THANH LOAN CN. ĐOÀN VĂN CƢỜNG Sinh viên thực hiện: NGUYỄN MINH VÀNG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 iii LỜI CẢM TẠ Em xin chân thành cảm ơn quý thầy cô trƣờng Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh đã tận tình chỉ dạy, truyền đạt kiến thức cho em trong suốt thời gian em học tập tại trƣờng. Em xin chân thành cảm ơn cô - TS. Lý Thị Thanh Loan đã hƣớng dẫn em giải quyết các vấn đề em thắc mắc trong suốt quá trình làm đề tài cũng nhƣ tạo điều kiện cho em hoành thành khoá luận tốt nghiệp này. Em xin chân thành cảm ơn toàn thể các anh chị làm việc tại Trung Tâm quốc gia Quan Trắc, thuộc Viện nghiên cứu và nuôi trồng thuỷ sản II, nhất là các anh chị tại phòng Mô học: anh Đoàn Văn Cƣờng, anh Phạm Văn Điền, chị Tuyết Anh, chị Lan đã tận tình chỉ bảo cho em các phƣơng pháp thao tác và thực hành đề tài trong suốt thời gian em làm đề tài này. Sau cùng, xin cảm ơn toàn thể gia đình mến yêu cùng toàn thể các bạn học chung khoá 29, ngành Công Nghệ Sinh Học, Đại Học Nông Lâm thân thƣơng vì đã luôn động viên, chỉ bảo, giúp đỡ, thƣơng yêu nhau. Vì là bƣớc đầu làm quen với việc nghiên cứu khoa học, cho nên không trách khỏi khiếm khuyết và sai lầm, mong đƣợc sự góp ý chỉ bảo của các thầy cô cùng các bạn sinh viên. TP. HCM, tháng 9 năm 2007 Sinh viên thực hiện, NGUYỄN MINH VÀNG iv TÓM TẮT NGUYỄN MINH VÀNG, lớp Công nghệ sinh học, khóa 29, niên khóa 2003 – 2007, trƣờng Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, Việt Nam. “ỨNG DỤNG PHƢƠNG PHÁP MÔ HỌC TRUYỀN THỐNG KHẢO SÁT SỰ BIẾN ĐỔI CẤU TRÚC TẾ BÀO TÔM CÀNG XANH (Macrobrachium rosenbergii De Man 1879) BỊ BỆNH ĐỤC THÂN”. Giáo viên hƣớng dẫn: TS. LÝ THỊ THANH LOAN CN. ĐOÀN VĂN CƢỜNG Thời gian thực hiện đề tài: 3/2007  9/2007. Bệnh đục thân trên Macrobrachium rosenbergii De Man, 1879 là một bệnh nguy hiểm gây thiệt hại kinh tế nghiêm trọng có thể gây chết 100% ấu trùng và hậu ấu trùng tôm càng xanh. Bằng phƣơng pháp mô học truyền thống, chúng tôi đã khảo sát những biến đổi cấu trúc tế bào của các tổ chức mô trên tôm càng xanh (Macrobrachium rosenbergii) bị đục thân. Để khảo sát những biến đổi cấu trúc mô học, chúng tôi tiến hành thu mẫu tôm càng xanh tại hai địa điểm: An Giang (thu mẫu bệnh không có dấu hiệu đục thân) và Bến Tre (thu mẫu bệnh có dấu hiệu đục thân). Kết quả phân tích mô học cho thấy có những bất thƣờng trong cấu trúc tế bào của các tổ chức mô trên cơ quan mang, gan tụy, cơ ở tôm càng xanh bị bệnh đục thân. Sự xuất hiện các thể ẩn bên trong nhân của các tế bào cơ quan gan tụy, các thể vùi bên trong nhân của các tế bào của cơ quan mang và sự hoại tử cơ là những đặc điểm chung quan sát đƣợc trên các mẫu tôm ấu trùng bị bệnh đục thân. v DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT B (B-cells): Blasenzellen cells (Tế bào B) DNA: Deoxyribonucleic Acid ELISA: Enzyme linked immunosorbent assay F (F-cells): Fibrillenzellen cells (Tế bào F) FAO: Food and Agriculture Organization of the United Nations (Tổ chức lƣơng nông thế giới) HP: Hepatopancreas (Cơ quan gan tụy) HPV: Hepatopancreatic parvovirus IHHNV: Infectious hypodermal and haematopoietic necrosis virus ILS: Interlamellar space INIs: Các thể vùi trong nhân tế bào INOs: Các thể ẩn trong nhân tế bào L: Lamellae (Phiến mang) LU: Lumen M: Muscle (Cơ) MBV: Monodon baculovirus MrNV: Macrobrachium rosenbergii nodavirus PCR: Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuổi Polymerase) R (R-cells): Restzellen cells (Tế bào R) RNA: Ribonucleic Acid RT-PCR: Reverse – transcription polymerase chain reaction (Phản ứng chuổi Polymerase phiên mã ngƣợc) TCX: Tôm càng xanh UNDP: United Nations Development Programe XSV: Extral small virus WSSV: White Spot Syndrome Virus (Virus gây hội chứng đốm trắng) vi DANH SÁCH CÁC HÌNH TRANG Hình 2.1: Hình dạng bên ngoài của loài Macrobrachium rosenbergii De Man 1879 4 Hình 2.2: Cấu tạo bên ngoài của Macrobrachium rosenbergii De Man 1879. . 4 Hình 2.3: Bản đồ vùng phân bố tự nhiên của Macrobrachium rosenbergii trên thế giới. . 7 Hình 2.4: Các khu vực sản xuất TCX chính trên thế giới. 8 Hình 2.5: Biểu đồ phân bố sản lƣợng TCX trên thế giới qua các năm. . 8 Hình 2.6: Dấu hiệu lâm sàng bệnh đục thân trên TCX. . 14 Hình 2.7: Hình dạng tế bào của Enterococus KM002 dƣới kính hiển vi điện tử. . 15 Hình 2.8: Hình dạng XSV và MrNV dƣới kính hiển vi điện tử. . 16 Hình 2.9: Vị trí của Macrobrachium rosenbergii nodavirus (MrNV) trong họ nodavirus. . 16 Hình 2.10: Cấu trúc tế bào cơ quan gan tụy TCX. 18 Hình 2.11: Cấu trúc tế bào cơ quan mang TCX. . 19 Hình 4.1: Cấu trúc tế bào tổ chức mô cơ TCX. . 27 Hình 4.2: Các tổ chức tế bào bình thƣờng của cơ quan gan tụy. . 28 Hình 4.3a: Thể ẩn bên trong nhân của các tế bào trên gan tụy TCX. . 29 Hình 4.3b: Thể ẩn bên trong nhân của các tế bào trên gan tụy TCX 30 Hình 4.4: Cấu trúc tế bào cơ quan mang TCX. . 31 Hình 4.5: Thể vùi bên trong nhân của các tế bào trrên cơ quan mang TCX . 33 Hình 4.6: Sự hoại tử cơ trên TCX bị đục thân. 34 vii DANH SÁCH CÁC BẢNG TRANG Bảng 4.1: Dấu hiệu lâm sàng mẫu tôm thu ngẫu nhiên tại An Giang . 25 Bảng 4.2: Kết quả phân tích mô học mẫu TCX thu định kỳ tại An Giang 26 Bảng 4.3: Kết quả phân tích mô học các mẫu TCX bệnh đục thân . 32 Bảng 4.4: So sánh các mẫu TCX bị đục thân và không bị đục thân 35 viii MỤC LỤC TRANG LỜI CẢM TẠ iii TÓM TẮT .iv DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT v DANH SÁCH CÁC HÌNH .vi DANH SÁCH CÁC BẢNG . vii MỤC LỤC . viii Phần I ĐẶT VẤN ĐỀ 1 Phần II TỔNG QUAN TÀI LIỆU . 3 2. 1 Hình thái tôm càng xanh . 3 2. 2 Đặc điểm sinh học tôm càng xanh 4 2.2.1 Sinh sản tôm càng xanh . 4 2.2.2 Môi trƣờng và chu kỳ sống 6 2.2.3 Phân bố 7 2. 3 Tình hình nuôi tôm càng xanh tại Việt Nam và trên thế giới . 7 2. 4 Các bệnh thƣờng gặp trên tôm càng xanh . 9 2.7.1 Bệnh trên ấu trùng tôm càng xanh . 9 2.7.2 Những bệnh thƣờng gặp trên tôm trƣởng thành 12 2. 5 Bệnh đục thân 13 2. 6 Các phƣơng pháp nghiên cứu mô học . 17 2.6.1 Phƣơng pháp mô học truyền thống 17 2.6.2 Phƣơng pháp phóng xạ tự chụp . 17 2.6.3 Phƣơng pháp hóa mô miễn dịch 17 2.6.4 Phƣơng pháp lai tại chổ . 17 2. 7 Cấu trúc tế bào chơ quan gan tụy và mang tôm càng xanh . 18 2.7.1 Cấu trúc tế bào cơ quan gan tụy 18 2.7.2 Cấu trúc tế bào cơ quan mang . 19 Phần III BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM VÀ PHƢƠNG PHÁP THỰC HIỆN 20 3.1 Bố trí thí nghiệm . 20 3.1.1 Thời gian và địa điểm thực hiện 20 ix 3.1.2 Bố trí thí nghiệm 20 3.2 Vật liệu, trang thiết bị, dụng cụ, hóa chất . 20 3.2.1 Trang thiết bị, dụng cụ, hoá chất cần chuẩn bị 20 3.2.2 Phƣơng pháp tiến hành 21 Phần IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24 4.1 Kết quả 24 4.1.1 Kết quả khảo sát mô học mẫu tôm càng xanh thu định kỳ không có dấu hiệu đục thân . 24 4.1.2. Kết quả khảo sát mô học tôm càng xanh có dấu hiệu đục thân 32 4.2 Thảo luận . 34 Phần V KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 37 Kết luận 37 Đề xuất . 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO . 38 Tiếng Việt 38 Tiếng Anh 38 Danh sách các trang website 42 1 Phần I ĐẶT VẤN ĐỀ Tôm càng xanh (TCX) (Macrobrachium rosenbergii De Man, 1879) là loài tôm nƣớc ngọt có kích thƣớc lớn nhất trong họ Palaemonidae, chỉ phân bố ở vùng Tây Nam châu Á Thái Bình Dƣơng (Nguyễn Việt Thắng, 1993). Là một đối tƣợng thủy sản quan trọng trong sản xuất và khai thác, TCX đƣợc thuần dƣỡng để sản xuất tại nhiều khu vực trên thế giới. Việt Nam, đồng bằng sông Cửu Long có sản lƣợng tôm lớn nhất nƣớc. Trong chu kỳ phát triển của ấu trùng tôm càng xanh, bệnh đục thân trên ấu trùng TCX là một trong những bệnh nguy hiểm nhất đối với ngƣời sản xuất giống bởi khả năng gây chết rất cao, có thể lên đến 100% trong vòng 5 ngày. Trƣờng hợp đầu tiên đƣợc ghi nhận là vào năm 1995 ở Martinique, Pháp (Arcier và c.t.v., 1999), sau đó ở Hàn Quốc (Tung và c.t.v., 1999), Trung Quốc (Qian và c.t.v., 2003), gần đây nhất ở Ấn Độ (Hameed, 2003). Bệnh tác động chủ yếu vào giai đoạn TCX giống, tác nhân gây bệnh này hiện vẫn chƣa rõ. Hiện có nhiều phƣơng pháp hiện đại đƣợc ứng dụng vào chẩn đoán bệnh thủy sản nhƣ là PCR (Polymerase Chain Reaction), RT-PCR (Reverse – transcription polymerase chain reaction), ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), hóa mô miễn dịch, lai tại chổ (in situ hybridization), miễn dịch huỳnh quang, . cho kết quả chính xác. Nhƣng đối với những bệnh mới có tác nhân gây bệnh mới chƣa biết đƣợc về cấu trúc di truyền, không thể tạo đƣợc mẫu dò (probe), đoạn mồi (primer), kháng thể, vì thế, không thể chẩn đoán đƣợc tác nhân gây bệnh. Phƣơng pháp mô học (histopathology) truyền thống đƣợc phát triển từ những năm đầu có kính hiển vi đã đƣợc ứng dụng một cách rộng rãi trên thế giới, từ các bệnh viện, các phòng nghiên cứu, các trung tâm xét nghiệm, các viện nghiên cứu, Đây là phƣơng pháp nghiên cứu căn bản, chủ yếu quan sát về cấu trúc mô, cấu trúc tế bào, xác định đƣợc chức năng cũng nhƣ các trạng thái bệnh lý của tế bào, đặc biệt là đối với một số bệnh mới ta chƣa có primer, probe, . thì phƣơng pháp mô học truyền thống rất hiệu quả trong chẩn đoán mầm bệnh. [...]... thống khảo sát sự biến đổi cấu trúc tế bào tôm càng xanh (Macrobrachium rosenbergii De Man, 1879) bị bệnh đục thân” Mục đích của đề tài: Khảo sát sự biến đổi cấu trúc tế bào của ấu trùng TCX bị bệnh đục thân để tìm ra tác nhân gây bệnh Nội dung thực hiện:  Khảo sát cấu trúc tế bào (cơ quan mang, gan tụy, cơ) của ấu trùng TCX không bị bệnh đục thân  Khảo sát cấu trúc tế bào (cơ quan mang, gan tụy, cơ)... phƣơng pháp nghiên cứu mô học 2.6.1 Phƣơng pháp mô học truyền thống Phƣơng pháp mô học truyền thống là phƣơng pháp dùng kính hiển vi quang học (độ phóng đại tối đa 1.200 lần) quan sát cấu trúc mô, cấu trúc tế bào, xác định các trạng thái bệnh lý của mô - tế bào Mẫu đƣợc cố định trong dung dịch Davision (mẫu giáp xác) hoặc dung dịch Bouin (mẫu cá), sau đó đem xử lý, đúc parafin, cắt và nhuộm Quan sát lát... gan tụy TCX (Cheng và Chen, 1998) Hp - tế bào F; Hpb - tế bào B; Hbr - tế bào R; Mfn – nhân tế bào biểu mô; Mef - lớp tế bào biểu mô; Sin – xoang tạo máu; Lm – lumen Haematoxylin và Eosin Hình 2.10 mô tả cấu trúc tế bào cơ quan gan tụy (Cheng và Chen, 1998) trên Macrobrachium rosenbergii không mang bệnh, cho thấy khá rõ cấu trúc của các tổ chức tế bào khác nhau Ở tôm bình thƣờng không mang bệnh, tiếp... ứng nhu cầu bức thiết của thực tế sản xuất và tình hình dịch bệnh, dƣới sự hƣớng dẫn và giúp đỡ của TS Lý Thị Thanh Loan cùng các anh chị tại phòng thí nghiệm Mô học, Trung tâm Quốc gia Quan Trắc Cảnh báo môi trƣờng và Phòng ngừa dịch bệnh thuỷ sản (thuộc Viện nghiên cứu và nuôi trồng thuỷ sản II), chúng tôi xin đƣợc thực hiện đề tài: Ứng dụng phƣơng pháp mô học truyền thống khảo sát sự biến đổi cấu. .. bản đƣợc quan sát ở các loại kính hiển vi khác nhau 2.6.4 Phƣơng pháp lai tại chổ Kỹ thuật này phù hợp để phát hiện các DNA bất thƣờng Chuỗi DNA đƣợc biến tính bằng nhiệt độ hay hóa chất tạo dạng sợi đơn Sau đó đƣợc gắn với đoạn dò (probe) chuyên biệt có đánh dấu 18 2 7 Cấu trúc tế bào chơ quan gan tụy và mang tôm càng xanh 2.7.1 Cấu trúc tế bào cơ quan gan tụy Hình 2.10: Cấu trúc tế bào cơ quan gan... Nƣớc cất 3.2.2 Phƣơng pháp tiến hành 3.2.2.1 Lấy mẫu 22 Khối gan tụy của tôm bị tiêu hủy rất nhanh sau khi tôm chết (sự tiêu hủy mô do các enzyme tiết ra từ các tế bào gan tụy đã chết), điều này có nghĩa là cấu trúc của khối gan tụy khi tôm chết sẽ bị phân huỷ rất nhanh Do đó mẫu phải đƣợc cố định nhanh khi tôm vẫn còn sống, để đảm bảo cấu trúc mô học của khối gan tụy không bị thay đổi Dung dịch Davision... ống; nhóm tế bào F (F-cells) (Fibrillezellen cells) bắt màu đen và không có không bào trên tiêu bản quan sát dƣới kính hiển vi quang học; nhóm tế bào B (B-cells) (Blasenzellen cells) hình cầu trong chứa dịch chất tiêu hóa; nhóm tế bào R (R-cells) (Restzellen cells) dự trữ năng lƣợng chứa những giọt lipid và mạng lƣới nội chất nhám Một vài tế bào trên tiêu bản đang trong giai đoạn phân chia tế bào Những... Phần IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết quả Bằng phƣơng pháp mô học truyền thống, chúng tôi đã khảo sát cấu trúc tế bào TCX (Macrobrachium rosenbergii De Man 1879) bị bệnh đục thân và không bị bệnh đục thân nhƣng có những dấu hiệu bất thƣờng Tổng số mẫu tôm chúng tôi thu đƣợc là 34 mẫu ấu trùng và hậu ấu trùng tại An Giang và Bến Tre, các mẫu ấu trùng tôm đƣợc thu đều có dấu hiệu giảm ăn, ít vận động, bơi... cắt và nhuộm Quan sát lát cắt bằng kính hiển vi quang học 2.6.2 Phƣơng pháp phóng xạ tự chụp Phƣơng pháp này dùng để khảo sát các hiện tƣợng bên trong mẫu mô bằng cách dùng phóng xạ Ngƣời ta đƣa các tiền chất là các phân tử phóng xạ nhƣ: acid amin phóng xạ, nucleotide phóng xạ vào tế bào Các phân tử này đƣợc tế bào tổng hợp thành các phân tử có cấu trúc lớn hơn Tiêu bản đƣợc phủ một lớp tráng (lớp phim)... Mang tôm xuất hiện những vết đen là do sự tập trung của các sản phẩm hóa học hay do quá trình nitơ hoá dẫn đến sự đen hóa cơ quan mang của tôm (Tonguthai, 1997), tôm có thể bị chết do stress vì nồng độ amonia hay nitrite trong ao nuôi, quá cao so với ngƣỡng nồng độ nitrite thấp nhất có thể gây chết tôm khoảng 2 mg/l (Tonguthai, 1997) Những nghiên cứu mô bệnh học cho thấy có sự tập trung sắt trong tế bào . đƣợc thực hiện đề tài: Ứng dụng phƣơng pháp mô học truyền thống khảo sát sự biến đổi cấu trúc tế bào tôm càng xanh (Macrobrachium rosenbergii. HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ỨNG DỤNG PHƢƠNG PHÁP MÔ HỌC TRUYỀN THỐNG KHẢO SÁT SỰ BIẾN ĐỔI CẤU