ứng dụng phương pháp mô học truyền thống khảo sát sự biến đổi cấu trúc tế bào tôm cành xanh bị bệnh đục thân

ứng dụng phương pháp mô học truyền thống khảo sát sự biến đổi cấu trúc tế bào tôm cành xanh bị bệnh đục thân

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC 

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP

ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP MÔ HỌC TRUYỀN THỐNG KHẢO SÁT SỰ BIẾN ĐỔI CẤU TRÚC TẾ BÀO TÔM CÀNG

XANH (Macrobrachium rosenbegii De Man 1879)

BỊ BỆNH ĐỤC THÂN

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khoá: 2003 – 2007

Sinh viên thực hiện: NGUYỄN MINH VÀNG

Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC 

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP MÔ HỌC TRUYỀN THỐNG KHẢO SÁT SỰ BIẾN ĐỔI CẤU TRÚC TẾ BÀO TÔM CÀNG

XANH (Macrobrachium rosenbegii De Man 1879)

BỊ BỆNH ĐỤC THÂN

Giáo viên hướng dẫn: TS LÝ THỊ THANH LOAN

CN ĐOÀN VĂN CƯỜNG

Sinh viên thực hiện: NGUYỄN MINH VÀNG

Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007

Em xin chân thành cảm ơn toàn thể các anh chị làm việc tại Trung Tâm quốc gia Quan Trắc, thuộc Viện nghiên cứu và nuôi trồng thuỷ sản II, nhất là các anh chị tại phòng Mô học: anh Đoàn Văn Cường, anh Phạm Văn Điền, chị Tuyết Anh, chị Lan đã tận tình chỉ bảo cho em các phương pháp thao tác và thực hành đề tài trong suốt thời gian em làm đề tài này

Sau cùng, xin cảm ơn toàn thể gia đình mến yêu cùng toàn thể các bạn học chung khoá 29, ngành Công Nghệ Sinh Học, Đại Học Nông Lâm thân thương vì đã luôn động viên, chỉ bảo, giúp đỡ, thương yêu nhau

Vì là bước đầu làm quen với việc nghiên cứu khoa học, cho nên không trách khỏi khiếm khuyết và sai lầm, mong được sự góp ý chỉ bảo của các thầy cô cùng các bạn sinh viên

TP HCM, tháng 9 năm 2007Sinh viên thực hiện,

NGUYỄN MINH VÀNG

Bệnh đục thân trên Macrobrachium rosenbergii De Man, 1879 là một bệnh

nguy hiểm gây thiệt hại kinh tế nghiêm trọng có thể gây chết 100% ấu trùng và hậu ấu trùng tôm càng xanh Bằng phương pháp mô học truyền thống, chúng tôi đã khảo sát những biến đổi cấu trúc tế bào của các tổ chức mô trên tôm càng xanh

(Macrobrachium rosenbergii) bị đục thân

Để khảo sát những biến đổi cấu trúc mô học, chúng tôi tiến hành thu mẫu tôm càng xanh tại hai địa điểm: An Giang (thu mẫu bệnh không có dấu hiệu đục thân) và Bến Tre (thu mẫu bệnh có dấu hiệu đục thân) Kết quả phân tích mô học cho thấy có những bất thường trong cấu trúc tế bào của các tổ chức mô trên cơ quan mang, gan tụy, cơ ở tôm càng xanh bị bệnh đục thân Sự xuất hiện các thể ẩn bên trong nhân của các tế bào cơ quan gan tụy, các thể vùi bên trong nhân của các tế bào của cơ quan mang và sự hoại tử cơ là những đặc điểm chung quan sát được trên các mẫu tôm ấu trùng bị bệnh đục thân

v

DNA: Deoxyribonucleic Acid

ELISA: Enzyme linked immunosorbent assay F (F-cells): Fibrillenzellen cells (Tế bào F)

FAO: Food and Agriculture Organization of the United Nations (Tổ chức lương nông thế giới)

HP: Hepatopancreas (Cơ quan gan tụy) HPV: Hepatopancreatic parvovirus

IHHNV: Infectious hypodermal and haematopoietic necrosis virus ILS: Interlamellar space

INIs: Các thể vùi trong nhân tế bào INOs: Các thể ẩn trong nhân tế bào L: Lamellae (Phiến mang)

MBV: Monodon baculovirus

MrNV: Macrobrachium rosenbergii nodavirus

PCR: Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuổi Polymerase) R (R-cells): Restzellen cells (Tế bào R)

RNA: Ribonucleic Acid

RT-PCR: Reverse – transcription polymerase chain reaction (Phản ứng chuổi Polymerase phiên mã ngược)

vi

TRANG

Hình 2.1: Hình dạng bên ngoài của loài Macrobrachium rosenbergii De Man 1879 4

Hình 2.2: Cấu tạo bên ngoài của Macrobrachium rosenbergii De Man 1879 4

Hình 2.3: Bản đồ vùng phân bố tự nhiên của Macrobrachium rosenbergii trên thế giới 7

Hình 2.4: Các khu vực sản xuất TCX chính trên thế giới 8

Hình 2.5: Biểu đồ phân bố sản lượng TCX trên thế giới qua các năm 8

Hình 2.6: Dấu hiệu lâm sàng bệnh đục thân trên TCX 14

Hình 2.7: Hình dạng tế bào của Enterococus KM002 dưới kính hiển vi điện tử 15

Hình 2.8: Hình dạng XSV và MrNV dưới kính hiển vi điện tử 16

Hình 2.9: Vị trí của Macrobrachium rosenbergii nodavirus (MrNV) trong họ nodavirus 16

Hình 2.10: Cấu trúc tế bào cơ quan gan tụy TCX 18

Hình 2.11: Cấu trúc tế bào cơ quan mang TCX 19

Hình 4.1: Cấu trúc tế bào tổ chức mô cơ TCX 27

Hình 4.2: Các tổ chức tế bào bình thường của cơ quan gan tụy 28

Hình 4.3a: Thể ẩn bên trong nhân của các tế bào trên gan tụy TCX 29

Hình 4.3b: Thể ẩn bên trong nhân của các tế bào trên gan tụy TCX 30

Hình 4.4: Cấu trúc tế bào cơ quan mang TCX 31

Hình 4.5: Thể vùi bên trong nhân của các tế bào trrên cơ quan mang TCX 33

Hình 4.6: Sự hoại tử cơ trên TCX bị đục thân 34

vii

TRANG

Bảng 4.1: Dấu hiệu lâm sàng mẫu tôm thu ngẫu nhiên tại An Giang 25

Bảng 4.2: Kết quả phân tích mô học mẫu TCX thu định kỳ tại An Giang 26

Bảng 4.3: Kết quả phân tích mô học các mẫu TCX bệnh đục thân 32

Bảng 4.4: So sánh các mẫu TCX bị đục thân và không bị đục thân 35

Phần II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2 1 Hình thái tôm càng xanh 3

2 2 Đặc điểm sinh học tôm càng xanh 4

2.2.1 Sinh sản tôm càng xanh 4

2.2.2 Môi trường và chu kỳ sống 6

2.2.3 Phân bố 7

2 3 Tình hình nuôi tôm càng xanh tại Việt Nam và trên thế giới 7

2 4 Các bệnh thường gặp trên tôm càng xanh 9

2.7.1 Bệnh trên ấu trùng tôm càng xanh 9

2.7.2 Những bệnh thường gặp trên tôm trưởng thành 12

2 5 Bệnh đục thân 13

2 6 Các phương pháp nghiên cứu mô học 17

2.6.1 Phương pháp mô học truyền thống 17

2.6.2 Phương pháp phóng xạ tự chụp 17

2.6.3 Phương pháp hóa mô miễn dịch 17

2.6.4 Phương pháp lai tại chổ 17

2 7 Cấu trúc tế bào chơ quan gan tụy và mang tôm càng xanh 18

2.7.1 Cấu trúc tế bào cơ quan gan tụy 18

2.7.2 Cấu trúc tế bào cơ quan mang 19

Phần III BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM VÀ PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN 20

3.1 Bố trí thí nghiệm 20

3.1.1 Thời gian và địa điểm thực hiện 20

Trong chu kỳ phát triển của ấu trùng tôm càng xanh, bệnh đục thân trên ấu trùng TCX là một trong những bệnh nguy hiểm nhất đối với người sản xuất giống bởi khả năng gây chết rất cao, có thể lên đến 100% trong vòng 5 ngày Trường hợp đầu tiên được ghi nhận là vào năm 1995 ở Martinique, Pháp (Arcier và c.t.v., 1999), sau đó ở Hàn Quốc (Tung và c.t.v., 1999), Trung Quốc (Qian và c.t.v., 2003), gần đây nhất ở Ấn Độ (Hameed, 2003) Bệnh tác động chủ yếu vào giai đoạn TCX giống, tác nhân gây bệnh này hiện vẫn chưa rõ

Hiện có nhiều phương pháp hiện đại được ứng dụng vào chẩn đoán bệnh thủy sản như là PCR (Polymerase Chain Reaction), RT-PCR (Reverse – transcription polymerase chain reaction), ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), hóa mô

miễn dịch, lai tại chổ (in situ hybridization), miễn dịch huỳnh quang, cho kết quả

chính xác Nhưng đối với những bệnh mới có tác nhân gây bệnh mới chưa biết được về cấu trúc di truyền, không thể tạo được mẫu dò (probe), đoạn mồi (primer), kháng thể, vì thế, không thể chẩn đoán được tác nhân gây bệnh Phương pháp mô học (histopathology) truyền thống được phát triển từ những năm đầu có kính hiển vi đã được ứng dụng một cách rộng rãi trên thế giới, từ các bệnh viện, các phòng nghiên cứu, các trung tâm xét nghiệm, các viện nghiên cứu, Đây là phương pháp nghiên cứu căn bản, chủ yếu quan sát về cấu trúc mô, cấu trúc tế bào, xác định được chức năng cũng như các trạng thái bệnh lý của tế bào, đặc biệt là đối với một số bệnh mới ta chưa có primer, probe, thì phương pháp mô học truyền thống rất hiệu quả trong chẩn đoán mầm bệnh

Hiện nay tại Việt Nam, tỉ lệ ấu trùng TCX bệnh đục thân khá cao, vẫn chưa xác định chính xác tác nhân gây bệnh Đáp ứng nhu cầu bức thiết của thực tế sản xuất và tình hình dịch bệnh, dưới sự hướng dẫn và giúp đỡ của TS Lý Thị Thanh Loan cùng các anh chị tại phòng thí nghiệm Mô học, Trung tâm Quốc gia Quan Trắc Cảnh báo môi trường và Phòng ngừa dịch bệnh thuỷ sản (thuộc Viện nghiên cứu và nuôi trồng thuỷ sản II), chúng tôi xin được thực hiện đề tài:

“Ứng dụng phương pháp mô học truyền thống khảo sát sự biến đổi cấu

trúc tế bào tôm càng xanh (Macrobrachium rosenbergii De Man, 1879) bị bệnh

đục thân”

Mục đích của đề tài:

Khảo sát sự biến đổi cấu trúc tế bào của ấu trùng TCX bị bệnh đục thân để tìm ra tác nhân gây bệnh

Nội dung thực hiện:

 Khảo sát cấu trúc tế bào (cơ quan mang, gan tụy, cơ) của ấu trùng TCX không bị bệnh đục thân

 Khảo sát cấu trúc tế bào (cơ quan mang, gan tụy, cơ) của ấu trùng TCX bị bệnh đục thân

 So sánh những biến đổi cấu trúc tế bào của các cơ quan, từ đó xác định nguyên nhân gây bệnh

Phần II

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2 1 Hình thái tôm càng xanh

Macrobrachium rosenbergii De Man, 1879 được Holthius (1950) phân loại như

sau:

Ngành chân khớp : Arthropoda

Lớp phụ giáp xác bậc cao : Malacostraca

Bộ phụ chân bơi : Natantia

Macrobrachium rosenbergii De Man, 1879 là loài TCX lớn nhất trong giống Macrobrachium: con đực có thể dài tới 320 mm, con cái 250 mm (đo từ mút chủy

(rostrum) đến mút đuôi (telson)) Toàn thân thường có màu xám hơi lục hoặc hơi nâu, đôi khi có màu hơi xanh, màu sắc đậm dần lên ở những con lớn hơn Có những sọc nâu, xám, trắng đục dọc theo chiều dài thân

Tác giả Forster và Wickins (1972) mô tả đặc điểm cấu tạo ngoài TCX (Hình 2.2), toàn thân được phân thành 20 phần phụ (segment) (somite) và được chia thành hai phần riêng biệt: phần đầu (cephalothorax) có 14 phần phụ và phần đuôi (abdomen) có 6 phần phụ Phần đầu lại được chia thành 2 phần riêng biệt nhau là cephalon và

thorax Tên gọi và chức năng của 20 phần phụ của Macrobrachium rosenbergii được

liệt kê trong phần Phụ lục A

Hình 2.1: Hình dạng bên ngoài của loài

Macrobrachium rosenbergii De Man, 1879

Hình 2.2: Cấu tạo bên ngoài của Macrobrachium rosenbergii De Man, 1879

Giải phẩu cơ quan sinh dục đực gồm có các phần: màng treo, dịch thể, ống xoắn dẫn tinh (gồm có ống dẫn tinh giữa, ống phóng tinh ra ngoài, đường ống dẫn tinh trong suốt) (Nguyễn Việt Thắng, 1993)

Con cái có đầu và đôi chân ngực thứ 2 nhỏ hơn ở con đực cùng tuổi nhiều lần, vị trí của lổ sinh dục cái ở giữa hai gốc của đôi chân bò thứ 3 Ở con cái thành thục, có

thể nhìn thấy trứng màu đỏ da cam qua lớp vỏ giáp đầu ngực Màng bụng uốn vào phía trong tạo thành một buồng chứa trứng Phần gốc của những chân bụng, đặc biệt là ba đôi chân bụng đầu tiên phát triển dài ra và có những tấm lông cứng, dài để mang trứng khi sinh sản

Tôm đực trưởng thành, thành thục có thể trạng khoẻ mạnh (vỏ cứng) có thể tiến hành giao vĩ trong khi con cái chỉ có thể tiến hành giao vĩ khi đã hoàn tất lột vỏ tiền giao vĩ (Nguyễn Việt Thắng, 1993), quá trình giao vĩ có thể chia thành 4 giai đoạn:

Tiếp xúc,

Ôm giữ tôm cái, Trèo lên lưng,

Lật ngửa và gắn túi tinh

Sau khi giao vĩ từ 6 – 20 giờ, tôm cái bắt đầu đẻ trứng Những con cái chưa giao vĩ nhưng đã thành thục, chín mùi sinh dục cũng có thể đẻ trong vòng 24 giờ sau khi lột vỏ tiền giao vĩ, nhưng không được thụ tinh và trứng chỉ lưu lại trong buồng ấp trứng của con cái vài giờ mà thôi

Khi đẻ trứng con cái cong mình về phía trước đến khi ngực bụng tiếp xúc nhau, đẩy trứng từ buồng trứng ra ngoài qua lổ sinh dục, trứng sẽ đi qua túi tinh (khi con cái đã được giao vĩ) và được thụ tinh, sau đó trứng rơi vào buồng ấp Vị trí của buồng ấp trứng ở chân bụng thứ tư nhận được trứng đầu tiên, sau đó lần lượt tới chân bụng thứ ba, thứ hai và cuối cùng là chân bụng thứ nhất, trong đó, trứng được bao bọc bởi một màng nhày trong suốt, và được sắp rất đều và ngăn nắp vào các sợi lông ở 4 cặp chân ngực này

Theo Nguyễn Việt Thắng (1993), thời gian ấp trứng từ 19 – 23 ngày nếu nhiệt độ từ 25 – 31oC, thời gian này dao động từ 17 – 23 ngày với nhiệt độ từ 26 – 30o

C Suốt thời gian ấp trứng, tôm cái dùng chân bụng quạt nước, tạo dòng nước luôn chuyển động qua vùng bụng làm thoáng khí cho trứng Tôm cái khéo léo dùng chân ngực thứ nhất loại bỏ những trứng hư và những vật lạ bám vào buồng trứng Trứng của loài tôm nước ngọt này có dạng hình bầu dục rất nhỏ, chiều dài trục lớn của trứng chỉ khoảng 0,6 – 0,7 mm, có màu sáng da cam trong suốt 2 – 3 ngày sau nở, sau đó chuyển dần sang màu da cam, đến ngày thứ 12 có màu xám xanh nhạt, sau đó màu đậm dần đến khi nở

2.2.2 Môi trường và chu kỳ sống

Ấu trùng TCX sau khi nở ra cần có môi trường nước lợ (6 – 18 o/oo) để sống và phát triển, chính vì vậy cho nên dù là loài tôm nước ngọt, khu vực sống tự nhiên của chúng phải tiếp giáp với vùng nước lợ Những con tôm cái đang mang trứng sẽ di chuyển xuống cửa sông nơi có độ mặn 12 – 18o/oo, tại đây, trứng sẽ nở và phóng thích ấu trùng vào sống tự do môi trường nước Trong suốt giai đoạn biến thái của ấu trùng sang dạng hậu ấu trùng (postlarvae) (PL), ấu trùng phải trải qua 11 giai đoạn biến thái khác nhau (Nguyễn Việt Thắng, 1993) (Phụ lục B) Tuy nhiên từ giai đoạn thứ VI trở đi có khác biệt về kích thước của các con ấu trùng, điều này giải thích tại sau một số

nhà khoa học cho rằng chỉ có 8 giai đoạn biến thái của ấu trùng TCX (Macrobrachium rosenbergii)

Đến giai đoạn hậu ấu trùng, tôm chuyển sang sống ở tầng đáy và bắt đầu di chuyển ngược lên môi trường nước ngọt Tác giả New (2000) cho biết nhiệt độ thấp có thể làm chậm quá trình di chuyển tìm nước ngọt của những hậu ấu trùng, nhiệt độ thích hợp nhất cho cả hai giai đoạn hình thái ấu trùng và hậu ấu trùng là 29 – 31oC Ấu trùng sống trôi nổi và bơi theo kiểu giật lùi, lộn ngược bằng các phần phụ ở ngực với phần bụng quay lên phía trên thay vì là phần lưng như ở tôm hậu ấu trùng và tôm trưởng thành Ngược lại, khi ấu trùng chuyển sang giai đoạn hậu ấu trùng, được nhận diện bởi khả năng bơi lội giống tôm trưởng thành, toàn thân có màu hơi mờ đục và có một vùng màu vàng sáng trên đầu Hậu ấu trùng có khả năng đi bằng các chân bò, không chỉ bò trên các bề mặt mềm mà còn có thể đi trên mặt đá ở các bãi sông cạn và trong những con suối Chúng cũng có thể trèo qua các thác nước, đập nước nhỏ, và cũng có thể bò trên mặt đất nếu có đủ độ ẩm TCX trưởng thành hoạt động về đêm, hoạt động bơi lội lên mặt nước để kiếm thức ăn trong khi về ban ngày chúng lẫn vào trong các vùng nước tối và hoạt động ở tầng đáy

Khẩu phần ăn của ấu trùng Macrobrachium rosenbergii là những phiêu sinh vật

nhỏ, những côn trùng rất nhỏ, và có thể ăn cả đồng loại là các ấu trùng nhỏ hơn TCX ở giai đoạn hậu ấu trùng và giai đoạn trưởng thành có khẩu phần ăn đa dạng, bao gồm tảo, thực vật sống trong nước, các loài thân mềm, côn trùng và sâu bọ, kể cả các động vật giáp xác khác, chúng là loài động vật ăn tạp Chúng cũng có thể ăn thịt lẫn nhau nếu thiếu thức ăn hay do mật độ quá đông trong một diện tích chật hẹp (ví dụ khi nuôi

số lượng lớn trong các ao hồ) Hình thái các giai đoạn biến thái (12 giai đoạn) được ghi nhận trong phần Phụ lục A

2.2.3 Phân bố

Tôm càng nước ngọt phân bố khắp các vùng nhiệt đới và á nhiệt đới trên thế giới Hiện nay được biết có trên 100 loài, trong đó hơn một phần tư số này có ở châu Mỹ Chúng có mặt ở hầu hết các vùng nước ngọt nội địa như sông, hồ, đầm lầy, mương, ao cũng như các vùng cửa sông Hầu hết các loài đều cần có nước lợ cho các giai đoạn biến thái của ấu trùng Một số loài thích nghi môi trường nước trong, một số loài khác gặp trong điều kiện nước rất đục như TCX

Hình 2.3: Bản đồ vùng phân bố tự nhiên của Macrobrachium

rosenbergii trên thế giới (FAO) Vùng màu đỏ là vùng có thể tìm thấy TCX trong tự nhiên

TCX phân bố ở tất cả các thủy vực nước ngọt (đầm, ao, sông, rạch, ruộng lúa ) kể cả ở vùng nưóc lợ cửa sông Trong tự nhiên có thể tìm thấy TCX ở khu hệ Ấn Độ Dương và Tây Nam Thái Bình Dương (Hình 2.3) Ở Việt Nam, TCX phân bố chủ yếu các tỉnh Nam Bộ, đặc biệt là các vùng nước ngọt và các vùng cửa sông ven biển ở Đồng Bằng Sông Cửu Long Một số quốc gia không có TCX phân bố trong tự nhiên như Pháp, Mỹ, khu vực Đài Loan hiện đã di giống về nuôi trong tự nhiên

2 3 Tình hình nuôi tôm càng xanh tại Việt Nam và trên thế giới

Theo New (2000), lịch sử phát triển của nghề nuôi TCX được bắt đầu từ năm 1961 bởi Ling, người đầu tiên phát hiện TCX có một giai đoạn sống cần nước lợ - giai

đoạn ấu trùng, và chính ông là người đầu tiên thành công trong việc ương nuôi ấu trùng TCX; tiếp theo nghiên cứu của Ling, Fujimura T (1972) đã thành công trong nghiên cứu sản xuất giống TCX đại trà được thực hiện từ năm 1965 đến 1968 áp dụng qui trình nước xanh để cung cấp giống cho các trại nuôi tôm giống tại Hawaii và các vùng khác; từ năm 1973, Aquacop đã bắt đầu nghiên cứu và áp dụng qui trình nước trong hở, qui trình cơ bản được thực hiện vào năm 1976 và hoàn thiện từ năm 1980, một chu trình sản xuất giống khá phổ biến hiện nay

Năm 1978, FAO tiến hành đề án “Mở rộng nuôi TCX” do UNDP tài trợ và được thực hiện tại Thái Lan đến 1981, nhờ đó sản lượng tôm thịt ở Thái Lan tăng nhanh đáng kể từ dưới 5 tấn/ha năm 1976 lên khoảng 400 tấn/ha năm 1981 (FAO, 2002) Jee (1986) nghiên cứu và ứng dụng qui trình nước xanh cải tiến trên cơ sở cải tiến qui trình nước xanh trước đó, sau đó qui trình này được áp dụng phổ biến ở Malaysia và Việt Nam (FAO, 2002)

Nghề nuôi TCX ở nước ta là một nghề truyền thống, đặc biệt là vùng đồng bằng sông Cửu Long Việc nghiên cứu sản xuất giống TCX đã được bắt đầu từ đầu thập niên 80 với qui trình nước trong hở và tuần hoàn Tuy nhiên, việc sản xuất giống nhân tạo chỉ phát triển từ 1999 khi nhu cầu con giống ngày càng cao, khi nghiên cứu và áp dụng thành công quy trình nước xanh cải tiến

Trong nuôi tôm thịt, năm 2002 cả nước đạt 10.000 tấn, chủ yếu tập trung sản lượng tại các tỉnh vùng đồng bằng sông Cửu Long như An Giang, Cần Thơ, Đồng Tháp, Bến Tre với diện tích nuôi mỗi tỉnh khoảng 200 – 800 ha Có nhiều mô hình nuôi trồng thuỷ sản khác nhau được nông dân ứng dụng, phổ biến nhất là mô hình nuôi TCX luân canh với lúa, đạt 686 kg/ha/vụ, nuôi tôm kết hợp với lúa đạt năng suất bình quân 4,12 tấn/ha/vụ, nuôi ao đạt 1,2 tấn/ha/vụ, nuôi tôm đăng quầng trên sông (phát triển mạnh tại Đồng Tháp) với khoảng 300 quầng năm 2001 và 1.500 quầng vào năm 2002

Nhìn chung, nghề nuôi TCX trên thế giới hiện nay đang trên đà phát triển mạnh và sản lượng sẽ tăng 12 - 30 % mỗi năm và có thể đạt 750.000 – 1.000.000 tấn/năm vào năm 2010, trong đó Trung Quốc chiếm ưu thế nhất về sản lượng, tiếp theo là Việt Nam, Ấn Độ, Bangladesh, Thái Lan Tuy nhiên, sự phát triển nhanh chóng nhất của nghề nuôi TCX là trong những năm 1999 – 2001 với tốt độ tăng trưởng đạt 30%/năm, đặt ra nhiều vấn đề cần xem xét để phát triển bền vững nghề nuôi tôm với bài học sâu sắc từ sự phát triển của nghề nuôi tôm biển (New, 2005) Rất nhiều vấn đề liên quan đến TCX đã và đang tiếp tục nghiên cứu và góp phần quan trọng vào ứng dụng thực tế (New, 2005)

2 4 Các bệnh thường gặp trên tôm càng xanh 2.7.1 Bệnh trên ấu trùng tôm càng xanh

2.4.1.1 Bệnh hoại tử cơ (idiopathic muscle necrosis) (IMN)

Bệnh được biết bởi nhiều tên khác nhau: bệnh trắng cơ (white muscle disease), bệnh hoại tử cơ (muscle necrosis), bệnh đục cơ (muscle opacity hoặc milk prawn disease) (Tonguthai, 1997) Bệnh gây nên tỉ lệ chết cao ở ấu trùng TCX bởi các sợi cơ hoại tử Nash và c.t.v (1987) cho rằng IMN gây chết đến 60% ở hậu ấu trùng 28 ngày

tuổi trong các trại sản xuất giống ở Thái Lan Trên Macrobrachium rosenbergii, IMN

xảy ra khi tôm bị sốc môi trường, do không đảm bảo vệ sinh, do thay đổi nhiệt độ, do giảm oxi hoà tan, do hoạt động quá mức hay do môi trường sống chật hẹp Bệnh cũng có thể xảy ra sau khi đem hậu ấu trùng đưa vào ao nuôi thịt 1 hoặc 2 ngày, có thể do tôm bị sốc khi vào sống trong môi trường mới Để khống chế sự việc này, nên giữ hậu ấu trùng tôm trong ao ương vài ngày trước khi chính thức thả vào ao nuôi

2.4.1.2 Bệnh giữa chu kỳ (mid-cycle disease) (MCD)

Nhìn chung bệnh xảy ra từ giai đoạn ấu trùng thứ VI đến XI Anderson và c.t.v (1990) cho biết một tỉ lệ chết cao xảy ra trên ấu trùng ở các trại ương TCX ở Malaysia trong khoảng thời gian 16 ngày sau khi nở Triệu chứng bệnh tương tự trong trường hợp thối rữa do vi khuẩn xảy ra trong tự nhiên Ấu trùng bỏ ăn hay giảm ăn và xảy ra hiện tượng ăn thịt lẫn nhau (các con yếu bị con khoẻ hơn ăn thịt) Ấu trùng bị bệnh thường có màu nâu xanh và bơi một cách yếu ớt và không thể định phương hướng

Hiện không xác định được tác nhân gây bệnh, có thể là do Enterobacter aerogenes

(Johnson, 1978; Brock, 1988)

Brock (1983) cho rằng chế độ vệ sinh tốt không thể chống lại mầm bệnh, cần nên có chế độ dinh dưỡng đặc biệt với đầy đủ artermia cần thiết

2.4.1.3 Bệnh hoại tử cơ do vi khuẩn (bacterial necrosis)

Những con ấu trùng bị bệnh, thân tôm thường có màu xanh xám, không ăn, yếu ớt và rơi xuống đáy bể, trên râu và trên các phần phụ xuất hiện những đốm nâu Tác

nhân gây bệnh này đã được xác định, bao gồm các vi khuẩn hình sợi Leucothrix spp.,

các cầu khuẩn và các vi khuẩn hình que hiện diện trên các sợi mang và trên các phần phụ Bệnh thường xâm hại trên các ấu trùng IV-V, gây nên sự chết hàng loạt (100%) trong 48 giờ (Aquacop, 1977)

2.4.1.4 Bệnh phát sáng (luminous disease)

Vibrio harveyi được xác định là tác nhân gây nên bệnh này trên các ấu trùng

giai đoạn sớm, một bệnh rất thường gặp cả trên đối tượng tôm nước ngọt và tôm nước mặn Ngoài đặc điểm phát sáng vào ban đêm, một đặc điểm rất dễ nhận thấy, còn có thể quan sát thấy trên các con tôm bệnh các vùng cơ mờ đục, bơi lội yếu dần và chết Đây là một căn bệnh nghiêm trọng, có khả năng gây chết đến 100%, và có thể kháng lại một số thuốc sử lý Sae-oui và c.t.v (1978) đã làm một thí nghiệm kiểm tra tính

nhạy cảm của Vibrio harveyi tìm thấy trên P merguiensis, kết quả chứng minh rằng

Ca(HOCl)2 với nồng độ 20 – 30 ppm hoặc formalin nồng độ 50 ppm có khả năng giết chết hoàn toàn loài vi khuẩn này trong môi trường

2.4.1.5 Bệnh lột vỏ không hoàn toàn (exuvia entrapment disease) (EED)

Bệnh ảnh hưởng nặng nhất trên TCX ở giai đoạn ấu trùng cuối và giai đoạn PL sớm, được xem như một hội chứng Ấu trùng bị hội chứng này không thể lột vỏ hoàn toàn ra khỏi các phần phụ khi chúng thay vỏ, như không thể trút vỏ khỏi mắt, chủy hay các phần phụ khác của cơ thể, hoặc sau khi lột vỏ chúng trở nên dị tật, kết quả tạo sự cản trở khi chúng di chuyển và có thể khiến chúng bị chết Nguyên nhân của hội chứng này không được rõ, có thể do chất lượng nước trong bể nuôi quá bẩn hay do khẩu phần dinh dưỡng không hợp lý

2.4.1.6 Bệnh do động vật nguyên sinh

Zoothamnium sp., Epistylis sp., Vorticella sp., Acineta sp là những động vật nguyên sinh được biết là có khả năng gây bệnh trên ấu trùng loài tôm Macrobrachium rosenbergii Chúng gây nên những vệt mờ đục trên tôm ấu trùng, có thể được loại bỏ

khi ấu trùng lột xác, nhưng cũng có khả năng gây cản trở quá trình lột xác và gây chết Ấu trùng có nhiều khả năng bị tấn công hơn tôm trưởng thành, nguyên nhân do các ao nuôi kém vệ sinh, chất lượng nước xấu, khi cải thiện chất lượng nước ao nuôi bệnh sẽ hết

2.4.1.7 Bệnh do virus

Cho đến ngày nay, những loài virus được phát hiện là tác nhân gây bệnh dịch

trên TCX bao gồm Macrobrachium rosenbergii nodavirus (MrNV) và Extra small

virus (EXV) (Qian và c.t.v., 2003); Parvolike virus (Anderson và c.t.v., 1990; Lightner và c.t.v., 1994); Infectious hypodermal and haematopancreatic necrosis virus (IHHNV) (Hsieh và c.t.v., 2006) Đối với WSSV (White Spot Syndrome Virus), TCX hoàn toàn có khả năng kháng lại mầm bệnh xâm nhiễm bằng một cơ chế đặc biệt vẫn chưa hiểu rõ (Hameed, 2000)

2.4.1.8 Bệnh do cấu trúc lớp vỏ không bình thường

Lớp vỏ được cấu tạo chủ yếu bằng canxi hay có thể nói canxi chính là bộ xương của loài giáp xác này Chính vì thế nếu thành phần canxi trong lớp vỏ thay đổi, trở nên quá ít hay quá nhiều, lớp vỏ sẽ trở nên mềm hoặc bị dị dạng, cản trở sự di chuyển và

sự phát triển của tôm (ảnh hưởng đến khả năng săn mồi, trốn tránh kẻ thù, khó lột vỏ, ), có thể gây chết tôm nhưng thường ở tỉ lệ thấp

2.7.2 Những bệnh thường gặp trên tôm trưởng thành 2.4.2.1 Bệnh tổn thương lớp vỏ

Bệnh này được biết bởi nhiều tên khác nhau: bệnh đốm nâu, bệnh đốm đen Chưa rõ nguyên nhân gây nên bệnh này, có thể do nhiều tác nhân khác nhau gây nên, bao gồm những tổn thương của lớp kitin hay những bất thường do cơ học, do dinh dưỡng, do tác nhân hoá học hoặc những nhân tố khác, tạo điều kiện cho vi khuẩn hay nấm xâm nhập gây bệnh Những con tôm bị bệnh có triệu chứng hoại tử, sưng viêm và sau đó để lại các vết đen trên thân và trên các phần phụ khác

Môi trường nước quá bẩn, nhiều chất hữu cơ với mật độ vi khuẩn cao được coi

là nguyên nhân gây nên sự thương tổn lớp vỏ của TCX (Macrobrachium rosenbergii),

bao gồm các vi khuẩn có khả năng sinh enzyme ngoại bào (lipase và protease) như

Aeromonas sp., Pseudomonas sp., Vibrio sp

2.4.2.2 Bệnh đen mang (black gill disease)

Mang tôm xuất hiện những vết đen là do sự tập trung của các sản phẩm hóa học hay do quá trình nitơ hoá dẫn đến sự đen hóa cơ quan mang của tôm (Tonguthai, 1997), tôm có thể bị chết do stress vì nồng độ amonia hay nitrite trong ao nuôi, quá cao so với ngưỡng nồng độ nitrite thấp nhất có thể gây chết tôm khoảng 2 mg/l (Tonguthai, 1997) Những nghiên cứu mô bệnh học cho thấy có sự tập trung sắt trong tế bào mang TCX, đây có thể là kết quả của sự ô nhiễm sắt trong ao nuôi

2.4.2.3 Bệnh trắng thân (white prawn disease)

Đôi khi được gọi là hội chứng trắng, chỉ tấn công TCX (Macrobrachium rosenbergii) trưởng thành, thường trên tôm cái Bệnh tấn công làm lớp mô bên dưới

lớp kitin chuyển trắng đục và mềm nhưng các mô cơ vẫn bình thường

2.4.2.4 Bệnh đỏ thân (red discoloration)

Bệnh chỉ gây hại trên tôm trưởng thành, làm biến đổi màu sắc phần đuôi sang màu đỏ nhạt, có thể do sự phân tán sắc tố hay mất một số sắc tố Hiện nay chưa xác định được tác nhân gây nên bệnh này

2.4.2.5 Bệnh do kí sinh trùng

2.4.2.6.1 Protozoa

Hall (1979) cho rằng Corthunia sp., Epistylis sp., Vorticella sp là những động

vật nguyên sinh gây bệnh phổ biến nhất Thông thường chúng ký sinh trên lớp vỏ bên ngoài, trong hốc mắt, râu, chân đuôi (uropod) và trứng (trên tôm cái đang mang trứng) Một khi chúng kí sinh trên thân tôm, chúng sẽ làm cản trở quá trình lột xác của tôm và có thể gây chết do thiếu oxi huyết

2.4.2.6.2 Metazoan

Macrobrachium spp đóng vai trò như một vật chủ trung gian mang ấu trùng của loài sán lá Carnaeophallus choanophallus (Johnson, 1978) Trên tôm Macrobrachium rosenbergii trưởng thành nuôi ở Thái Lan cũng đã phát hiện một loài

sán lá ký sinh nhưng chưa định danh được (Nash, 1989)

2.4.2.6.3 Isopod

Nhóm động vật chân chèo gây hại trên tôm nước ngọt thuộc về họ Bopyridae

(Johnson, 1978) Một loài Isopod tìm thấy trong mang của những con tôm bệnh đã

được nghiên cứu và phân loại, có thể là loài Probopyrus buitendijki, được cho là tác nhân ký sinh trên Macrobrachium rosenbergii ở vùng Đông Nam Á

2 5 Bệnh đục thân

Bệnh xuất hiện ở một số quốc gia và vùng lảnh thổ: Khu vực châu Á (Trung Quốc, Đài Loan, Ấn Độ, Thái Lan, Philippin, Malaisia) và vùng Caribbean (Cộng hoà Dominican, những hòn đảo phía Tây nước Pháp) Gần đây bệnh đã xuất hiện tại các trại sản xuất giống của Việt Nam

Bệnh đục thân gây một số triệu chứng lâm sàng sau:

Các bó cơ mờ đục (Akiyama và c.t.v., 1982; Nash và c.t.v., 1987; Brock, 1988) Xảy ra với xác xuất cao nhất ở giai đoạn ấu trùng thứ IV - VI

Tôm bỏ ăn, rớt xuống đáy bể nuôi và bị ăn thịt bởi những ấu trùng khỏe hơn Hình dáng ngoài của tôm có màu xám xanh, bơi yếu ớt, thường bơi theo đường xoắn ốc

Tỉ lệ chết cao, đột ngột, có thể lên đến 100% trong vòng 5 ngày kể từ khi phát hiện có dấu hiệu bị đục cơ

Lờ đờ, giảm ăn, phần cơ bụng có màu trắng đục Vùng đuôi (telson) bị đục trước và dần dần chuyển sang phần thân tôm, và sau một thời gian thì tất cả cơ phần bụng và phần đầu ngực đều chuyển sang màu trắng đục

Triệu chứng mô học

o Hao mòn khối gan tụy (Bower, 1998)

o Hoại tử các sợi cơ (Vijayan, 2005; Bonami, 2005; Qian, 2003)

Hình 2.6: Dấu hiệu lâm sàng bệnh đục thân trên TCX (Hameed (A, C); Vijayan, 2005

(B), Cheng và Chen, 1998 (D)) (A) và (B) Sự trắng cơ xảy ra trên PL TCX, cho thấy sự biến đổi hoàn toàn màu sắc PL (C) và (D) Sự trắng cơ xảy ra trên tôm trưởng thành; (D) So sánh hai mẫu tôm bệnh và không bệnh đục cơ, ở trạng thái bình thường có màu hơi đục, khối gan tụy có màu gạch tươi (hình phía trên), khi bệnh, cơ chuyển sang đục và khối gan tụy chuyển màu vàng nhạt (hình phía dưới)

Theo Tonguthai (1977), trên TCX có nhiều bệnh gây triệu chứng đục cơ: Idiopathic muscle necrosis (IMN) (Nash và c.t.v., 1987; Brock, 1988), Larval mid-cycle disease (MCD) (Anderson và c.t.v., 1990; Johson, 1979; Brock, 1988), Bacterial

necrosis (Aquacop, 1977), Viral disease (Anderson và c.t.v., 1990), white muscle disease (white tail disease) (Hameed, 2005) Tác nhân gây nên căn bệnh này hiện vẫn

chưa rõ Brower (1998) cho rằng Enterobacter aerogenes có khả năng gây hiện tượng

đục cơ trên ấu trùng TCX ở giai đoạn IV-XI, Cheng và Chen (1998) đề nghị một loài

vi khuẩn giống Enterococcus (Enterococcus-like bacterium) (Hình 2.7) Gần đây dịch

bệnh trắng đuôi bùng phát tại nhiều quốc gia trên thế giới, gây triệu chứng đục các bó

cơ ở phần đuôi TCX Nhiều tác giả đã nghiên cứu và công bố tác nhân chính là MrNV (Macrobrachium rosenbergii nodavirus) và XSV (extral small virus) (Yoganandhan,

2006; Vijayan, 2005); Bonami, 2005; Qian, 2003) Hiện không có bất kỳ một bài báo khoa học nào ghi nhận những biến đổi mô học trên cơ thể TCX bị đục thân, ngoại trừ dấu hiệu hoại tử các bó cơ ở phần đuôi

Hình 2.7: Hình dạng tế bào của Enterococus KM002 dưới kính hiển

vi điện tử (Cheng & Chen, 1998)

Enterococcus-like bacterium là một song cầu khuẩn Gram (+), có quan hệ gần gũi với Enterococcus seriolicida, vi khuẩn giống Enterococcus này được phát hiện

trên tôm bị đục thân tại Hàn Quốc (Cheng và Chen, 1998) Thực nghiệm của tác giả

này cho thấy rằng khi xâm nhiễm vi khuẩn này vào Macrobrachium rosenbergii sẽ gây

tỉ lệ chết cao, gây chết 100% trong vòng một tuần

MrNV là một RNA virus hình đa diện, tròn có đường kính 26-27 nm, một chủng trong họ Nodaviridae (Hình 2.8) Bộ gen gồm 2 phân tử RNA-1 và RNA-2 kích

thước tương ứng là 2,9 và 1,3 kb Vỏ capsid là một loại prôtein có trọng lượng phân tử

43 kDa (Bonami và c.t.v., 2005) Là một RNA virus, MrNV thực hiện quá trình sao

chép trong nguyên sinh chất của hầu hết các tổ chức mô cơ thể TCX XSV, một tiểu

thể giống virus có liên quan đến MrNV, có hình đa diện đường kính 14-16 nm Bộ gen

của XSV là một phân tử RNA kích thước 0,9 kb, mã hoá tạo nên vỏ capsid là hai chuỗi polipeptide trọng lượng phân tử 16 và 17 kDa (Bonami và Widada, 2004) Là một tiểu thể giống virus có kích thước nhỏ, lại không mang các đoạn gen mã hoá enzyme cho quá trình sao chép, Widada và Bonami (2004) cho rằng cần có sự hiện diện của

MrNV như là một yếu tố xúc tác không thể thiếu cho quá trình sao chép XSV trong

các tổ chức mô TCX Tuy vậy quan hệ này vẫn chưa được hiểu rõ ràng

Hình 2.8: Hình dạng XSV (A) và MrNV (B) dưới kính hiển vi điện tử

(Bonami và c.t.v., 2005) Bar = 100 nm

Vị trí của MrNV trong họ Nodaviridae được ghi nhận trong Hình 2.9

Hình 2.9: Vị trí của Macrobrachium rosenbergii nodavirus (MrNV) trong

họ nodavirus (Bonami, 2005)

A

2 6 Các phương pháp nghiên cứu mô học 2.6.1 Phương pháp mô học truyền thống

Phương pháp mô học truyền thống là phương pháp dùng kính hiển vi quang học (độ phóng đại tối đa 1.200 lần) quan sát cấu trúc mô, cấu trúc tế bào, xác định các trạng thái bệnh lý của mô - tế bào Mẫu được cố định trong dung dịch Davision (mẫu giáp xác) hoặc dung dịch Bouin (mẫu cá), sau đó đem xử lý, đúc parafin, cắt và nhuộm Quan sát lát cắt bằng kính hiển vi quang học

2.6.2 Phương pháp phóng xạ tự chụp

Phương pháp này dùng để khảo sát các hiện tượng bên trong mẫu mô bằng cách dùng phóng xạ Người ta đưa các tiền chất là các phân tử phóng xạ như: acid amin phóng xạ, nucleotide phóng xạ vào tế bào Các phân tử này được tế bào tổng hợp thành các phân tử có cấu trúc lớn hơn Tiêu bản được phủ một lớp tráng (lớp phim) và được bảo quản trong hộp tối Các hạt Bromide bạc khi gặp phóng xạ sẽ hình thành các hạt bạc đen Cấu trúc có chứa phân tử phóng xạ sẽ thấy có những hạt bạc đen Mẫu được quan sát dưới kính hiển vi quang học hoặc kính hiển vi điện tử Phương pháp này cho biết nhiều hoạt động của nhiều cấu trúc ở cấp độ vi thể

2.6.3 Phương pháp hóa mô miễn dịch

Dựa trên lý thuyết kết gắn kháng nguyên với kháng thể Kháng thể được dùng có chất đánh dấu để phát hiện và định vị các prôtein đặc hiệu Tùy theo chất đánh dấu (huỳnh quang, men, hạt vàng) mà tiêu bản được quan sát ở các loại kính hiển vi khác nhau

2.6.4 Phương pháp lai tại chổ

Kỹ thuật này phù hợp để phát hiện các DNA bất thường Chuỗi DNA được biến tính bằng nhiệt độ hay hóa chất tạo dạng sợi đơn Sau đó được gắn với đoạn dò (probe) chuyên biệt có đánh dấu