Xây dựng phương pháp nhận diện và phân tích tính đa dạng di truyền của 21 dòng cacao băng kỹ thuật Microsatellite 2

Xây dựng phương pháp nhận diện và phân tích tính đa dạng di truyền của 21 dòng cacao băng kỹ thuật Microsatellite 2

Phần 2

Tổng quan tài liệu

2.1.Giới thiệu tổng quan về cây cacao

Cây cacao có tên khoa học là Theobroma cacao L (2n = 20), thuộc họ

Sterculiacea, là cây duy nhất trong số 22 loài của thứ Theobroma được trồng sản xuất.

Hiện nay có 3 vùng chính trên thế giới trồng cacao:- Nam Mỹ: Brazil, Ecuador.

- Tây Phi: Bờ Biển Ngà, Ghana, Cameroon, Nigeria.- Đông Nam Á: Indonesia, Malaysia, Việt Nam.

2.1.1.Nguồn gốc cây cacao

Cacao là một loại cây trồng bản địa của các nước nhiệt đới ẩm và được ngườiMaya trồng ở Châu Mỹ từ rất lâu, trước khi người Châu Âu có mặt Từ “cacao” từtiếng Maya mà ra, và cho đến ngày nay, khắp nơi đều dùng từ này Cacao xuất hiện lầnđầu tiên trong danh mục từ thực vật từ năm 1605

2.1.2.Đặc điểm hình thái

Hình 2.1: Theobroma cacao

Rễ: rễ cacao có dạng trụ, dài khoảng 1.5-2 m Trên suốt chiều dài của rễ trụ có

nhiều rễ ngang phân nhánh và rất nhiều rễ con tập trung chủ yếu dưới cổ rễ khoảng 20cm.

Thân: Cacao là loài cây thân gỗ nhỏ, có thể cao từ 10-20 m nếu mọc tự nhiên.Trong điều kiện sản xuất, chiều cao trung bình của cây cacao khoảng 5-7 m, đườngkính khoảng 10-18 cm Trên mỗi thân cacao có thể có từ 4-5 tầng cành.

Lá: Lá cacao phát triển theo từng đợt, buông thỏng xuống Màu sắc lá thay đổitùy theo giống, từ màu xanh nhạt đến vàng, từ màu hồng đến đỏ đậm Trong quá trìnhtrưởng thành, lá mất sắc tố nên có màu xanh hoặc xanh thẫm, cứng cáp hơn và có thểnằm ngang Lá dưới bóng che có phiến rộng và xanh hơn lá ở ngoài nắng Khí khổngchỉ có mặt ở dưới phiến lá Trên mặt lá, mô dậu có nhiều khoang giữa các tế bào vàchứa đầy chất nhựa, lớp ngoại bì bị cutin hóa rất mạnh Lá tồn tại được từ 4-5 tháng,sau đó đi vào giai đoạn lão suy và rụng.

Hoa: Hoa cacao xuất hiện trên sẹo lá của thân, cành Hằng năm, hoa xuất hiệntrên cùng một chỗ ở vết sẹo lá, lâu ngày chỗ ra hoa phình to và nhô lên thành đệm hoa.Hoa có cuống dài 1-3 cm, có 5 cánh đều đặn xen kẽ với 5 cánh đài Hoa nở từ 3 giờchiều đến 9 giờ sáng hôm sau.

Quả: Những đặc tính về màu sắc, kích thước và hình dạng quả thay đổi rấtnhiều tùy thuộc vào giống.

+ Màu sắc: Quả chưa chín có thể có màu xanh, đỏ tím hoặc xanh điểm sắc đỏtím…Khi quả đạt độ chín, màu xanh chuyển qua vàng, màu đỏ tím thường chuyển quamàu da cam.

+ Hình dạng, kích thước: Hình dạng quả thay đổi từ hình cầu, hình oval đến hơidài, nhọn hoặc hình trứng Thường quả có chiều dài 7-30 cm, rộng 7-9 cm.

Hạt: Hạt cacao không có nhân, mập, dài 2-3 cm và có cùi nhớt màu trắng, có vịhơi chua bao bên ngoài Kế lớp cùi nhớt là lớp vỏ mỏng, nhiều đường gân bao bọc lấyhạt ở bên trong Hạt chứa tử diệp màu tím (màu trắng ngà hoặc vàng nhạt đối vớigiống Criollo) và hóa nâu sau khi lên men Kích thước hạt có thể thay đổi tùy theogiống và mùa vụ Mỗi quả cacao có từ 30-40 hạt.

2.1.3.Yêu cầu sinh thái

Khí hậu: Cacao thường được trồng ở các vùng có độ cao 800 m so với mực

nước biển, trên các vùng có lượng mưa khoảng 1500-2000 mm/năm Cây cacao thíchnghi tốt ở nhiệt độ tối đa là 30-32oC và nhiệt độ tối thiểu là 18-21oC Cây bị thiệt hạinghiêm trọng ở nhiệt độ nhỏ hơn 10oC Ẩm độ thích hợp cho cây khoảng 70-80%.Cacao đặc biệt sinh trưởng phát triển tốt trong điều kiện che bóng (chỉ cho 70% lượngánh sáng lọt qua).

Đất: Cacao thích hợp với nhiều loại đất khác nhau, đất cát, đất phù sa vensông, đất trên các triền dốc và cả trên đất nghèo dinh dưỡng nhưng có bóng che và gầnnguồn nước Cacao sinh trưởng và phát triển tốt nhất với đất có độ pH trong khoảng5.5-6.7 Đất phải đảm bảo khả năng thoát nước tốt nhưng đồng thời cũng giữ nước tốt.Vì thế, ở nước ta, cacao thường được trồng ở Tây Nguyên, Duyên Hải Miền Trung,Đông Nam Bộ và một số tỉnh miền Tây Nam Bộ.

2.1.4.Các giống cacao

Trên thế giới, cacao có nhiều dòng, nhóm Mỗi dòng, nhóm đều mang nhữngđặc tính khác nhau, thích hợp trên những vùng sinh thái khác nhau Hiện nay giốngcacao được chia làm 3 nhóm chính:

- Nhóm Criollo: Hoa có nhị màu vàng nhạt, trước khi chín quả có màu xanhhoặc đỏ, quả dài, chóp nhọn và có 10 khía đều nhau, vỏ quả sần sùi, mỏng, dễ cắt, hạtcó tiết diện tròn, phôi nhũ có màu trắng ngà.

- Nhóm Forastero – Amazone: Hoa có nhị màu tím, quả màu xanh, sauchuyển sang màu vàng, đuôi quả tròn, vỏ dày, khó cắt, ít hoặc không có khía, hạt cóphôi nhũ màu đỏ tím.

- Nhóm Trinitario: Có đặc tính trung gian giữa 2 nhóm Forastero và Criollo.Ở Việt Nam, giống cacao hiện có là con lai giữa nhóm Forastero và nhómTrinitario Tuy nhiên, trước đây, giống được trồng ở các địa phương là thế hệ con cháucủa sự tạp giao giữa 3 nhóm trên.

2.1.5.Đặc điểm chính của 21 dòng cacao nghiên cứu trong đề tài

Các dòng cacao nghiên cứu trong đế tài thuộc những giống có năng suất cao,có giá trị thương mại nhờ được chọn lọc từ những cây bố, mẹ có đặc tính tốt trong quátrình lai tạo giống

13 dòng cacao thương mại được nhập từ Malaysia có đời bố mẹ của một sốdòng như sau:

Tên dòngĐời bố mẹ

TD1 PA 35 x NA 32TD3 Con lai của Trinitario

TD5 UAWA 18 x T.S.15/43.352TD10 NA 31 x PA 15

TD13 UIT 1 x NA 33TD14 PA 173 x SCA 9

TD12 (PA 76 x SCA 20) x (UIT 1 x SCA 6)

Mọi nghiên cứu và ứng dụng sinh học phân tử đều bắt đầu bằng việc thunhận một lượng lớn nucleic acid đủ lớn và đủ tinh sạch để tiến hành các thí nghiệm kếtiếp Mối quan tâm hàng đầu của các kỹ thuật tách chiết nucleic acid là thu nhận đượccác phân tử này ở trạng thái nguyên vẹn tối đa không bị phân hủy bởi các tác nhân cơhọc (phân tử bị gẫy do nghiền, lắc mạnh) hay hóa học (phân tử bị thủy giải bởi cácenzyme nội bào giải phóng ra môi trường khi tế bào bị phá vỡ) Các nucleic acid cầnđược tách chiết ở nhiệt độ thấp để ức chế hoạt động của các enzyme nội bào(Desoxyribonuclease-Dnase và Ribonuclease-Rnase)

Một qui trình ly trích DNA ở tế bào thực vật gồm 3 bước cơ bản:

Bước 1: Phá vỡ màng tế bào.

Thông thường người ta nghiền tế bào hoặc mô trong một hỗn hợp dung dịchđệm chiết gồm Tris – HCl 1M (pH 7.5), NaCl 5M, EDTA 0.5M, sodium dodecyl sulfat10% (SDS) Hỗn hợp này sẽ phá vỡ màng tế bào và màng nhân, giải phóng DNA ramôi trường đồng thời phân hủy các protein liên kết với DNA.

Bước 2: Loại bỏ các thành phần không mong muốn trong mẫu chủ yếu là

các protein.

Có thể sử dụng CTAB/NaCl (CTAB: Cetyltrimethylammonium bromide)tạo phức hợp với polysaccharide và protein rồi kết tủa chúng Loại bỏ protein và phức

hợp CTAB – polysaccharide – protein bằng hỗn hợp phenol/chloroform/isoamylalcohol (25:24:1) Phenol và chloroform sẽ làm biến tính protein Ngoài ra chloroformcòn làm cho pha nước và pha hữu cơ dễ tách rời nhau Isoamyl alcohol hạn chế sự nổibọt trong suốt quá trình ly trích Mặc dù phenol làm biến tính protein nhưng nó có thểlàm ức chế hình dạng của Rnase và làm dung môi cho phân tử Rnase có chứa nhữngchuỗi dài polyA (Brawerman và ctv,1972) Do đó, có thể khắc phục nhược điểm nàybằng cách sử dụng thêm chloroform sẽ giúp loại bỏ tất cả các dấu vết còn sót lại củaphenol trong nucleic acid Protein bị biến tính sẽ không hòa tan trong pha nước cóchứa nucleic acid và sau khi ly tâm sẽ tủa thành một lớp nằm giữa pha nước và phahữu cơ Pha nước có chứa nucleic acid được thu nhận lại.

Bước 3: Tủa nucleic acid trong isopropanol.

Các DNA có trọng lượng phân tử thấp không bị tủa nên có thể loại bỏ chúngbằng tủa trong isopropanol Nucleic acid sẽ được thu nhận lại bằng ly tâm Sau đó, cặntủa phải được rửa trong ethanol 70% để loại bỏ các muối hoặc các dấu vết củaisopropanol còn dính lại (Hồ Huỳnh Thùy Dương,1998).

 Phân tích định tính và định lượng DNA bằng quang phổ kế.

Sau khi thu nhận nucleic acid ở dạng sạch, chúng ta có thể tiến hành phân tíchđịnh tính và định lượng DNA bằng quang phổ kế.

Phương pháp này cho phép ước lượng tương đối nồng độ nucleic acid có trongmẫu sau khi ly trích được Nguyên tắc của phương pháp này dựa vào sự hấp thụ mạnhánh sáng tử ngoại ở bước sóng 260 nm của các base purine và pyrimidine Giá trị mậtđộ quang (OD: optical density) ở bước sóng 260 nm của các mẫu đo cho phép xácđịnh nồng độ nucleic acid trong mẫu dựa vào tương quan: một đơn vị OD260nm tươngứng với nồng độ 50ng/μl l cho dung dịch chứa DNA mạch kép Tuy nhiên, cách tínhnày chỉ đúng với dung dịch chứa nucleic acid sạch Để kiểm tra độ sạch của dung dịch,người ta đo thêm giá trị OD280nm Tại bước sóng 280 nm, protein có mức hấp thụ caonhất, nhưng các protein cũng hấp thu bước sóng ở 260 nm như các nucleic acid và dođó làm sai lệch giá trị thật của nồng độ nucleic acid Tỉ số OD260nm /OD280nm là tỉ số chothấy độ nhiễm các chất như phenol hoặc protein.

- Tỉ số OD260nm /OD280nm = 1.8 đối với DNA tinh khiết.

- Tỉ số OD260nm /OD280nm = 2 đối với RNA tinh khiết (Quách Tuyết Oanh,2003)

2.3.Giới thiệu về kỹ thuật PCR

2.3.1.Nguyên tắc của kỹ thuật PCR

PCR được thực hiện trên cơ sở sinh tổng hợp DNA theo nhiều chu kỳ nối tiếpnhau, mỗi chu kỳ gồm 3 trình tự như sau :

Bước 1: Biến tính

Giai đoạn này được thực hiện ở nhiệt độ cao (94-95o C) trong vòng 30 giây đến1 phút, làm cho phân tử DNA mạch kép tách thành 2 mạch đơn Chính 2 mạch đơnnày đóng vai trò là mạch khuôn cho sự tổng hợp 2 mạch bổ sung mới.

Bước 2: Phản ứng của primer gắn vào đầu dây chuỗi mã đối xứng với chuỗi mã

trên dây template để có phân tử DNA mới.

Ở giai đoạn này nhiệt độ được hạ thấp cho phép các primer bắt cặp với khuôn,nhiệt độ này dao động trong khoảng 30-70o C, kéo dài trong khoảng 30 giây đến 1phút, tùy thuộc vào nhiệt độ nóng chảy Tm (melting temperature) của các primer sửdụng Giai đoạn này gọi là giai đoạn lai.

Bước 3: Kéo dài dây mới nhờ primer

Nhiệt độ được tăng lên 72oC giúp cho DNA polymerase hoạt động tốt nhất.Thời gian của giai đoạn này tùy thuộc vào độ dài của trình tự DNA khuếch đại, thườngkéo dài từ 30 giây đến vài phút.

Kết quả cuối cùng là một đoạn mã hóa di truyền đặc biệt nào đó được khuếchđại lên rất nhiều lần Sự khuếch đại này có thể được tính như sau:

Tổng lượng DNA khuếch đại = m x 2n

m : là số bản sao của chuỗi mã hóa.n : là số chu kỳ.

Hình 2.2: Nguyên tắc phản ứng PCR

Ba trình tự này xảy ra theo chu kỳ rất nhanh để khuếch đại DNA Trong chu kỳthứ nhất và thứ hai của phản ứng khuếch đại, chỉ có sản phẩm chuỗi dài được hìnhthành, còn trong những chu kỳ tiếp theo khuếch đại cả những sản phẩm chuỗi dài vàchuỗi ngắn Sản phẩm chuỗi dài được tích tụ theo hướng tuyến tính, còn sản phẩmchuỗi ngắn tích tụ theo logarit Do dó, người ta hy vọng có khoảng 105 lượng sảnphẩm chuỗi ngắn sau khoảng 25-30 chu kỳ Theo nguyên tắc PCR được áp dụng đểkhuếch đại các đoạn DNA có chiều dài 200-2000bp.

Những phản ứng trên được thực hiện nhờ polymerase như Taq polymerase, và

sự thay đổi chu kỳ nhiệt một cách hợp lý, đặc biệt là nhiệt độ cho giai đoạn biến tínhvà giai đoạn bắt cặp.

Một polymerase của DNA và bốn deoxy (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) đượcdùng để khuếch đại một đoạn chuyên tính nào đó của DNA Khả năng “chọn lọc” nàyđược thực hiện thông qua sự hợp lại của 2 oligonucleotide (F và R) trong phản ứng.

Nhiệm vụ của những oligonucleotide này là tác động làm cho DNA bị biến chất (mởdây đôi thành dây đơn) và những phần cuối của đoạn nhằm tăng hoạt lên và cho nóhoạt động như những primer trong sinh tổng hợp DNA

Primer bên trái tác động trên dây DNA 3’-5’ còn được gọi là forward primer, kíhiệu là F Primer bên phải tác động trên dây 5’-3’ còn được gọi là reverse primer, kíhiệu là R Sự sắp xếp như vậy đảm bảo vùng bị can thiệp được tăng cường hoạt động,theo 3 trình tự đã nói ở trên Tóm lại khi các primer kết hợp với sợi DNA đối lập củanó trong điều kiện một khoảng cách đã được kích hoạt, các đoạn DNA này có thể sẽđược khuếch đại lên theo phản ứng dây chuyền với polymerase.

2.3.2.Tối ưu hóa các điều kiện cho phản ứng PCR2.3.2.1.DNA mẫu

Phản ứng khuếch đại tối ưu xảy ra trên DNA thật tinh sạch Tuy nhiên, nhữngkỹ thuật chẩn đoán bằng PCR vẫn cho kết quả tốt với DNA thu nhận trực tiếp từ dịchchiết tế bào (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2003)

Lượng DNA mẫu sử dụng cũng có khuynh hướng giảm (1μl g xuống còn 100ng)với việc sử dụng các polymerase cho hiệu quả cao Hơn nữa việc giảm lượng mẫu banđầu còn hạn chế các khuếch đại “kí sinh”, tạo những sản phẩm phụ không mong muốn(Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2003).

Thông thường, nhiễm protein trong mẫu DNA trong quá trình ly trích DNA sẽkhông ảnh hưởng xấu đến sự nhân DNA Tuy nhiên nhiễm DNA lạ sẽ dẫn đến kết quảPCR bị sai lệch.

Đối với những DNA có kích thước quá lớn (>50kb), sự biến tính có thể khônghữu hiệu và năng suất PCR thấp Trong trường hợp này, cần phải cắt DNA trước bằngenzyme cắt hạn chế mà enzyme đó không cắt trong chuỗi đích; hoặc có thể tách DNAbằng cách dùng nhiệt độ tới 100oC trong 2-5 phút.

Nồng độ Taq polymerase được sử dụng thông thường là 0.5-5 đơn vị/100μl ldung dịch phản ứng Nếu nồng độ Taq quá cao, những sản phẩm không chuyên tính cóthể nhảy vào làm sai lệch kết quả Nếu nồng độ Taq quá thấp, chúng ta sẽ không có đủ

số lượng men để xúc tác tạo ra sản phẩm PCR theo ý muốn

Trong phản ứng PCR thì Taq polymerase có khuynh hướng thêm một

nucleotide loại “A” vào đầu tận cùng 3’ của sản phẩm PCR, điều này rất quan trongtrong việc tạo dòng (TA- cloning) và nó sẽ bị loại thải đi nếu sự gắn kết xảy ra ở đầutận cùng là đầu bằng (blunt end ligation) Ngoài ra có thể làm gia tăng hoạt tính của

Taq polymerase bằng cách sử dụng kết hợp với một số enzyme khác: Tli hoặc Pfu UseTli, Pfu và một số enzyme polymerase khác.

2.3.2.3.Primer

Primer là chỉ tiêu quan trọng nhất để đạt được sự khuếch đại đặc trưng và cóhiệu quả cao Việc chọn primer là giai đoạn quyết định của phương pháp PCR, việcthiết kế primer phải tuân thủ một số chỉ tiêu cơ bản sau (Vincent R Prezioso, 2004):

1- Chiều dài primer

Đây là một chỉ tiêu quan trọng cho sự thành công của PCR, vì tính đặc hiệuvà nhiệt độ bắt cặp của primer phụ thuộc một phần vào chiều dài primer Thông thườngprimer có chiều dài từ 18-24 base (theo nguyên tắc của Wallace) có tính đặc hiệu cao,và cho nhiệt độ bắt cặp tối ưu Kích thước primer không nên quá ngắn, trừ trường hợpphục vụ cho mục đích đặc biệt, và cũng không nên quá dài vì sẽ làm giảm khả năng bắtcặp.

2- Nhiệt độ nóng chảy Tm

Hai primer xuôi và ngược trong phản ứng PCR phải có nhiệt độ nóng chảykhông cách biệt nhau quá xa, vì nếu sự chênh lệch nhiệt độ lớn thì primer có Tm caohơn sẽ bắt cặp không đặc hiệu, còn primer có Tm thấp hơn sẽ không thể lai được với

3- Độ đặc hiệu

Độ đặc hiệu của primer phụ thuộc một phần vào chiều dài primer như đã nóiở trên Để có độ đặc hiệu cao, primer phải được thiết kế sao cho chỉ khuếch đại mộttrình tự đặc trưng duy nhất trên DNA hay chỉ cho một sản phẩm chính, và không nêncó nhiều trình tự lặp lại trên primer, vì điều này sẽ dẫn đến sự xuất hiện các sản phẩm

phụ Nhiệt độ của giai đoạn kéo dài không được quá thấp so với nhiệt độ bắt cặp củaprimer để đảm bảo tính đặc hiệu.

4- Trình tự bổ sung trên primer

Trình tự primer phải được thiết kế sao cho có không quá 3 cặp base có trìnhtự bổ sung với nhau, vì điều này sẽ dẫn đến hiện tượng “kẹp tóc” do sự bắt cặp bổsung giữa các phần khác nhau của một primer, làm ngăn cản sự bắt cặp của primer vớiDNA.

Hai primer xuôi và ngược phải không có trình tự bắt cặp bổ sung với nhauđể tránh hiện tượng “dimer primer”, vì điều này sẽ dẫn đến sự cạnh tranh bắt cặp vớiDNA và cản trở sự hình thành sản phẩm mong muốn Ngoài ra, nồng độ quá thừa củaprimer cũng dẫn đến sự hình thành “dimer primer” (Bùi Chí Bửu,1999) Thôngthường, primer xuôi và primer ngược thường có nồng độ bằng nhau, khoảng 0.1μl Mtương đương với 2.5pmol trong 25 μl l dung dịch phản ứng Trình tự DNA nằm giữa haimồi “xuôi” và “ngược” không được quá lớn Phản ứng sẽ tối ưu trên những trình tựDNA nhỏ hơn 1 kb (Hoàng Thị Liễu, 2004).

5- Hàm lượng GC và AG

Thành phần nucleotide của các primer nên cân bằng, tránh cặp GC lặp lạinhiều lần Hàm lượng GC của primer nên nằm trong khoảng 45% đến 50%(Kwork và ctv., 1990), trình tự primer lý tưởng nhất là có 50% GC (theo nguyên tắccủa Wallace) Trình tự primer phải không có poly G hay poly C, poly A hay poly T, vìđiều này sẽ làm cho sự bắt cặp không đặc hiệu Trình tự polypyrimidine TC haypolypurine Agcũng cần phải tránh vì nó làm giảm hiệu quả khuếch đại.

6- Trình tự đầu 3’

Vị trí đầu 3’ của primer rất quan trọng trong việc kiểm soát hiện tượng“mismatch” - bắt cặp không đặc hiệu Cần tránh trình tự A hay T ở đầu 3’, mà thayvào đó là G hoặc C vì mối liên kết hydro giữa G-C mạnh hơn A-T sẽ bảo đảm cho sựbắt cặp đặc hiệu.

Tm = 4 (G + C) + 2 (A + T)

A, T, C, G là số lượng các base có trong oligonucleotide.Khi chiều dài primer từ 14 – 70 base

Tms = 81.5 + 16.6(log10[J+]) + 0.41(%G+C) - (600/l)+ [J+] : nồng độ mol các cation hoá trị I

+ (%G+C) : % nucleotide loại G và CKhi chiều dài primer từ 20 - 35 base

Tmp = 22 + 1.46([2 x (G+C)] + (A+T))

Tuy nhiên, việc tính toán này chỉ có tính chất tạm thời, chúng ta phải điềuchỉnh lại nhiệt độ này để có sự khuếch đại cao nhất và thu nhận tần suất đa hình caonhất Bằng kinh nghiệm và thực hiện xét nghiệm nhiều lần, chúng ta mới có thể có sốliệu đúng về nhiệt độ bắt cặp Số base càng ít nhiệt độ này càng thấp và ngược lại.

Mối quan hệ giữa nhiệt độ bắt cặp Ta và đoán nhiệt độ nóng chảy Tm củaprimer là một trong những vấn đề vẫn đang được tìm hiểu Thông thường, nhiệt độ bắtcặp thường thấp hơn nhiệt độ nóng chảy từ 2-5oC Nếu nhiệt độ bắt cặp quá thấp dẫnđến sản phẩm được nhân lên quá mức do sự bắt cặp các primer không chuyên biệt cóthể xảy ra Nếu nhiệt độ bắt cặp quá cao, năng suất của sản phẩm mong muốn sẽ giảm.Nếu primer bắt cặp một cách chính xác với đoạn DNA mẫu, nhiệt độ bắt cặpnên thấp hơn nhiệt độ lý thuyết Tm khoảng 5oC Thông thường, với mộtoligonucleotide có 20 nucleotide có thể dùng nhiệt độ bắt cặp 50-55oC Nếu chuỗi dàihơn (25 nucleotide hay nhiều hơn) hoặc có thể nhiều base G, C, nhiệt độ bắt cặp có thểđến 55-65oC Trong vài phản ứng, oligonucleotide lớn (từ 30 bp trở lên), giai đoạn bắtcặp và kéo dài có thể được kết hợp và thực hiện ở 68-72oC (Hoàng Thị Liễu, 2004).

2.3.2.5.Tỉ lệ primer/DNA khuôn mẫu

Một trong những yếu tố quan trọng nhất của PCR là tỉ lệ tối hảo giữa primerDNA mẫu Nếu tỉ lệ này quá cao, hiện tượng primer-dimer sẽ xuất hiện, giống nhưtrường hợp DNA mẫu quá loãng Nếu tỉ lệ này quá nhỏ, kết quả sản phẩm PCR sẽkhông nhiều.

Hầu hết các trường hợp áp dụng PCR, đều dùng một nồng độ primer không quá0.5μl M (12.5 pmol/25 μl L phản ứng), không tính đến nồng độ DNA mẫu, để tránh hiệntượng primer-dimer.

2.3.2.6.Các thành phần khác

 Nồng độ dNTP (các deoxynucleotide triphotphat)

Nồng độ dNTP thường được sử dụng là 20-200 μl M Nồng độ cao hơn dễdẫn đến sự khuếch đại “ký sinh" Bên cạnh đó, sự cân bằng trong thành phần cácdNTP cũng ảnh hưởng đến phản ứng PCR Sự mất cân bằng trong thành phần cácdNTP sẽ làm tăng các lỗi sao chép của DNA polymerase

Nồng độ dNTP thích hợp nhất cho một phản ứng PCR còn phụ thuộc vàonồng độ Mg2+, nồng độ primer, số lượng chu kỳ của phản ứng và chiều dài của sảnphẩm được khuếch đại Vì thế, nồng độ dNTP tối ưu cho từng phản ứng phải được xácđịnh qua thực nghiệm.

 Nồng độ MgCl2

Nồng độ MgCl2 cũng là một nhân tố ảnh hưởng mạnh đến phản ứng PCR.Mg2+ rất cần cho quá trình liên kết các dNTP, xúc tác cho enzyme Taq polymerase,

làm tăng Tm của DNA mạch kép Nồng độ Mg2+ thấp sẽ làm hạn chế quá trình kéodài Ngược lại nồng độ Mg2+ cao sẽ giúp ổn định dây đôi DNA và ngăn ngừa sự biếntính hoàn toàn (do sự mở dây đôi DNA) của sản phẩm trong mỗi chu kỳ, làm cho sảnphẩm PCR ít đi; đồng thời, có thể làm cho hiện tượng bắt cặp giả xảy ra ổn định hơnvà cho ra những sản phẩm mong muốn với số lượng quá lớn nhưng mức độ chuyênbiệt thấp.

 Chất ổn định hoạt động enzyme

Những hoạt chất ổn định hoạt động enzyme cũng được chú ý Nhiều nhàsản xuất hoá chất đã xem xét gelatin hoặc Triston X-100 trong những buffer để tồn trữ

enzyme Có trường hợp người ta sử dụng cả hai làm dung dịch đệm Nhằm bảo quảnvà ổn định enzyme trong quá trình xử lý nhiệt của PCR, mỗi dung dịch đệm trongphản ứng đều có chứa gelatin ở nồng độ 0.01% và Triston X-100 ở nồng độ 0.1%.

 Dung dịch đệm

Một nồng độ cao của dung dịch đệm PCR được sử dụng để tăng cườnghiệu quả cho phản ứng PCR Sau đây là dung dịch đệm PCR được xem là tốt hơn đốivới các đệm đang có mặt trên thị trường

2.3.2.7.Số lượng chu kỳ của phản ứng PCR

Trong thực tế số chu kỳ cho một phản ứng PCR không nên vượt quá 40 Sởdĩ như vậy vì phản ứng PCR diễn tiến qua hai giai đoạn :

 Giai đoạn đầu: Số lượng bản sao tăng lên theo cấp số nhân, tỉ lệ với lượng

mẫu ban đầu.

 Giai đoạn sau: Hiệu quả khuếch đại giảm hẳn do sự phân hủy và cạn kiệt

các thành phần của phản ứng, sự xuất hiện các sản phẩm phụ ức chế phản ứng, hoặccác bản sao vừa được tổng hợp không kết hợp với mồi mà bắt cặp với nhau.

Số chu kỳ cho một phản ứng PCR tùy thuộc số lượng mẫu DNA ban đầu.Nếu số lượng mẫu ban đầu là 105 thì cần 25-30 chu kỳ Nếu số lượng mẫu ban đầu là102-10 3 thì số chu kỳ phải là 35-40 chu kỳ.

2.3.2.8.Thiết bị và dụng cụ trong phản ứng PCR

Thực chất, một thiết bị dùng để tiến hành phản ứng PCR chỉ cần đáp ứng yêucầu thay đổi nhiệt độ thật nhanh và chính xác Các thiết bị hiện nay đã được cải tiến đểtránh tối đa sự bốc hơi nước trong trong quá trình phản ứng, hay cho phép tiến hànhPCR ngay trên mô và tế bào Tuy nhiên, mỗi thiết bị đều có đặc điểm khuếch đại riêngnên mọi thí nghiệm của một nghiên cứu cần được tiến hành trên cùng một loại thiết

bị Hơn nữa, ống nghiệm (eppendorf) dùng cho các phản ứng của cùng một nghiên cứuphải cùng kiểu vì tính đặc tính truyền nhiệt của các ống này cũng như nhiệt độ tiếp xúcgiữa các ống và bộ phận tạo nhiệt của thiết bị khuếch đại có ảnh hướng lớn đến kết quảPCR.

2.3.3.Các vấn đề thường gặp trong phản ứng PCR và hướng giải quyết

1 Có nhiều sản phẩm không chuyên biệt có kích thước dài hơn Giảm thời gian bắt cặp

 Tăng nhiệt độ bắt cặp Giảm thời gian kéo dài

 Giảm nhiệt độ kéo dài đến: 62 – 68oC

 Tăng nồng độ KCl trong dung dịch đệm đến 1.2X – 2X nhưng vẫn giữnồng độ MgCl2 ở 1.5 – 2mM

 Tăng nồng độ MgCl2 lên 3 – 4.5mM nhưng vẫn giữ nồng độ dNTP khôngđổi

 Tăng nhiệt độ kéo dài: 74- 78oC

 Giảm nồng độ muối KCl xuống còn 0.7 - 0.8X nhưng vẫn giữ nồng độMgCl2 ở 1.5 – 2mM

 Tăng nồng độ MgCl2 lên 3 – 4.5mM nhưng vẫn giữ nồng độ dNTP khôngđổi

 Giảm nồng độ DNA khuôn mẫu Giảm nồng độ Taq polymerase xuống

 Nếu không phải từng lý do trên thì phải kiểm tra lại trình tự primer bằngcách Blast để đối chiếu với giữ liệu trên ngân hàng gene

 Nếu không được thì có thể kết hợp tất cả hoặc một vài yếu tố trên3 Không thu được bất kỳ sản phẩm nào

 Đảm bảo chắc chắn các thành phần PCR đã được cho vào  Thay đổi dung dịch dNTP

 Nếu mới mua primer mới thì phải kiểm tra lại để đảm bảo độ tin cậy Tăng nồng độ primer

 Tăng lượng DNA khuôn mẫu

 Giảm nhiệt độ bắt cặp xuống 6 – 10oC

 Nếu làm như vậy mà thu được sản phẩm (kể cả không đặc hiệu) thì thựchiện như đã trình bày ở trên

 Kết hợp tất cả hoặc một vài yếu tố trên

2.3.4.Ưu, nhược điểm của kỹ thuật PCR

Kỹ thuật PCR được sử dụng trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu quan trọng do cácưu điểm sau:

- Độ nhạy rất cao- Thao tác đơn giản.

- Thời gian thực hiện nhanh.

- Độ tinh sạch của mẫu không cần cao.- Lượng mẫu cần ít.

Tuy nhiên, phương pháp này có nhiều mặt hạn chế và đòi hỏi sự thận trọng đặcbiệt khi tiến hành thí nghiệm cũng như khi phân tích kết quả Có thể có ba vấn đề lớnkhi sử dụng kỹ thuật PCR:

 Trong thực nghiệm, kích thước của trình tự cần khuếch đại là giới hạn đầutiên.

Trừ vài trường hợp rất cá biệt, phương pháp PCR không hoạt động được vớinhững đoạn DNA lớn hơn 3 kb Việc sử dụng PCR với các độ dài dưới 1.5 kb cho kếtquả tốt Với những độ dài lớn hơn, điều kiện tối ưu cho phản ứng phải được xác địnhqua thực nghiệm.

 Sự ngoại nhiễm là vấn đề lớn nhất đặt ra đối với PCR, gắn liền với khả năngkhuếch đại bản sao của phương pháp này.

Nguồn ngoại nhiễm lớn nhất là các sản phẩm khuếch đại của những lần thao táctrước Khi mở nắp các ống nghiệm sau mỗi lần khuếch đại, các phân tử khuếch đại sẽthoát ra khỏi ống nghiệm và lơ lửng trong không gian phòng thí nghiệm rồi nhiễm vàocác phản ứng tiến hành sau đó Có thể khắc phục vấn đề này bằng một số biện phápsau:

- Các công đoạn thao tác khác nhau phải tiến hành ở những địa điểm cách xanhau.

- Dụng cụ dùng để thực hiện phản ứng (micropipet không sử dụng vào các thaotác khác.

- Dùng tia tử ngoại để loại bỏ các phân tử còn lại từ các lần khuếch đại trước.- Tất cả mọi thành phần phản ứng đều chia thành những lượng nhỏ đủ với 1,2lần thao tác.

 Các sai sót gây ra do Taq polymerase

Sự sao chép bởi Taq polymerase cho tỉ lệ sai sót khá cao (10-4, nghĩa là cứ 10000nucleotid thì enzyme gắn sai một nucleotid) Ta không thể loại bỏ hoàn toàn các sai sótnày mà chỉ có thể gảm bớt.

2.4.Giới thiệu phương pháp phân tích trình tự DNA