Xây dựng phương pháp nhận diện và phân tích tính đa dạng di truyền của 21 dòng cacao băng kỹ thuật Microsatellite 3

Xây dựng phương pháp nhận diện và phân tích tính đa dạng di truyền của 21 dòng cacao băng kỹ thuật Microsatellite 3

Phần 3

Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

3.1.Vật liệu

3.1.1.Các giống cacao thí nghiệm

Các dòng cacao thí nghiệm bao gồm:

 13 dòng cacao thương mại (được liệt kê ở bảng 3.1) được trồng tại vườnsưu tập giống cacao, Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh.

 8 dòng cacao CT bao gồm: CT1, CT3, CT4, CT5, CT6, CT7, CT8 và CT9được trồng tại 2 vườn giống cacao ở tỉnh Cần Thơ.

Ngoài ra còn có ba giống cacao: trồng tại vườn sưu tập giống cacao, Đại họcNông Lâm TP Hồ Chí Minh, được chọn để so sánh kết quả phân tích với Ngân hàngcacao thế giới.

Cách thức lấy mẫu như sau:

 Giống ở gần phòng thí nghiệm (13 dòng cacao thương mại và 3 giốngAMAZ15/15, NA33 và PA107): chúng tôi lấy mẫu lá tại vườn và đem về phòng thínghiệm để ly trích DNA ngay Vì chúng tôi quan sát thấy lá cacao nếu lưu trữ lâu quá24 giờ, cho dù trong tủ -20oC, sẽ xuất hiện nhiều đốm nâu trên bề mặt lá làm ảnhhưởng đến chất lượng DNA ly trích.

 Giống ở xa phòng thí nghiệm (8 dòng cacao CT): mẫu lá sau khi lấy đượcgiữ lạnh và chuyển đến phòng thí nghiệm trong vòng 24 giờ để ly trích DNA ngay.

Trên mỗi cây, chúng tôi chọn các lá tươi, có màu xanh thẫm nhưng không quágià, cũng không chọn những lá non vì chúng chứa nhiều nhựa rất khó li trích, ngoài ralá phải không có dấu hiệu bị sâu bệnh hay côn trùng tấn công Các mẫu lá được trữtrong tủ -20oC cho đến khi tiến hành ly trích.

Những cây chọn để lấy mẫu lá (mỗi giống chọn 2 cây) được cột dây nylonmàu để đánh dấu

Bảng 3.1: Các dòng cacao thương mại khảo sát.Sồ thứ tựTên thương mại Tên dòng Nguồn gốc

BAL209BAL244 BR25 KKM225PBC123 PBC154 PBC157PBC159PBC230 PBC236 QH1213QH22 QH441

MalaysiaMalaysiaMalaysiaMalaysiaMalaysiaMalaysiaMalaysiaMalaysiaMalaysiaMalaysiaMalaysiaMalaysiaMalaysia

Hình 3.1: Lấy mẫu lá cacao tại vườnHình 3.2: Đánh dấu cây được chọn

3.1.2.Hóa chất thí nghiệm3.1.2.1.Primer

Tổng hợp kết quả nghiên cứu về 15 cặp primer microsatellite để kiểm tra tínhđồng nhất di truyền của cacao do tổ chức USDA và Đại Học Pennsylvania State, Mỹ,thực hiện (xem phần 2.6.1 và 2.6.2), chúng tôi chọn ra 5 cặp primer để phát hiện cáctrình tự microsatellite nằm trên 5 nhiễm sắc thể (NST) khác nhau trên genome củacacao (Ingenic Newsletter No.9, 2004).

Năm cặp primer này cho các đoạn khuếch đại có tính đa hình cao giữa cácgiống cacao (xem bảng 2.1) do đó có thể cho kết quả phân biệt rõ giữa các dòng cacaokhảo sát.

Các primer có chiều dài từ 18-20bp, primer forward ở mỗi primer được đánhdấu bằng màu huỳnh quang ở đầu 5’, do công ty Applied-Biosystem, Mỹ, tổng hợp

Bảng 3.2: Các primer microsatellite dùng trong thí nghiệm

Trình tự microsatellite Vịtrítrên

Trình tự khuếch đại

Xanh lácây

GCTTTCAGTCCTTTGCTT

5’-VICCTAGTTTCCCATTTACCA-3’ TCCTCAGCATTTTCTTTC

3.1.2.2.Các hóa chất dùng trong ly trích DNA

 Dịch trích DNA (extraction buffer EB), 100mL EB bao gồm of 2g CTAB,28mL 5M NaCl, 20mL 0.5M Tris-HCl, 4mL 0.5M EDTA, 1mL Mercapto ethanol,nước cất 2 lần khử ion đã hấp khử trùng

 TE buffer, bao gồm 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) and 1mM EDTA (pH 8.0). CIA, bao gồm 24V chloroform: 1V isoamylalcohol.

 Isopropanol. Sodium acetate.

 Ethanol 70% and 96%. RNase.

 Low-salt TE (10 mM Tris-HCl , 1mM EDTA [pH 8.0]).

 Primer (do công ty Applied-Biosystem-Mỹ cung cấp). DNA mẫu (ly trích từ lá cacao).

 H2O cất 2 lần, siêu lọc, hấp khử trùng.

3.1.2.4.Các hóa chất dùng trong phân tích trình tự

 Sản phẩm PCR.

 Chất làm biến tính DNA: Hidi Formamide

 Chất chuẩn để xác định kích thước của các peak (size standard)  Polymer pop 6-ABI.

 Buffer.

3.1.3.Trang thiết bị thí nghiệm

 Chén sứ và chày giã (Đức)

 Eppendorf 0,2 ml; 0,5 ml; 1,5 ml (Mỹ) Cân phân tích 4 số (Ohaus - Mỹ)

 Máy hút và tủ cấy vô trùng (Anh Quốc). Pipet các loại (Nichiryo –Nhật).

 Đầu típ các loại (Đức)

 Máy ly tâm lạnh (Hettich –Đức). Máy luân nhiệt (Biorad –Thụy Điển). Máy điện di (Cosmo Bio Co –Nhật). Máy chụp ảnh DNA (Biorad –Mỹ). Lò Viba (Electrolux –Thụy Điển). Máy định ôn (Memmert –Đức). Tủ lạnh các loại (Sanyo –Nhật).

 Máy giải trình tự ABI 3100 (Applied Biosystem-Mỹ) Mao quản 36cm (Applied Biosystem-Mỹ)

3.2.Phương pháp

3.2.1.Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu của đề tài là DNA được ly trích từ lá của 21 dòng cacaokhảo sát Từ DNA tổng số thu được, chúng tôi sẽ tiếp tục nghiên cứu các al có chứacác trình tự microsatellite đặc trưng cho từng dòng.

3.2.2.Bố trí thí nghiệm

Đề tài được thực hiện tại Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm trường Đại HọcNông Lâm TP Hồ Chí Minh Thời gian từ tháng 3/20005 đến tháng 8/2005 gồm 4 giaiđoạn chính như sau:

 Giai đoạn 1: Xây dựng phương pháp nhận diện 21 dòng cacao dựa trên 5 cặpprimer microsatellite mTcCIR7, mTcCIR8, mTcCIR11, mTcCIR15 và mTcCIR18.Phương pháp nhận diện gồm 4 bước:

1- Lấy mẫu lá của 21 dòng cacao 2- Tiến hành li trích DNA

3- Thực hiện phản ứng PCR với 5 primer

4- Phân tích sản phẩm PCR thu được trên máy giải trình tự DNA Dùng phầnmềm Gene Mapper để đọc kết quả phân tích các đoạn microsatellite của mỗi dòng Ghinhận dữ liệu microsatellite của 21 dòng cacao với 5 primer.

 Giai đoạn 2: Kiểm tra độ chính xác và tính ổn định của phương pháp nhận

diện.qua 2 bước:

1 Thu nhận mẫu lá của 13 dòng cacao thương mại cũng từ vườn giống cacaotại Đại Học Nông Lâm, 13 dòng này đã được người lấy mẫu mã hoá tên giống dướidạng: A2, A3, A4, A5, A6, A7, A8, A9, A10, A11, A12, A13, A14 (các mã số nàyđược giữ kín cho đến khi thu được kết quả cụ thể) Tiến hành các bước phân tích như ở

giai đoạn 1 để thu nhận dữ liệu Microsatellite của 13 dòng đã mã hoá Nhận diện cácgiống mã hóa bằng cách dùng phần mềm Cervus để kiểm tra mức độ đồng nhất.

2 Chọn tại vườn giống cacao Đại Học Nông Lâm một số giống cacao truyềnthống đã có dữ liệu Microsatellite lưu trữ trong ngân hàng cacao thế giới ICGD Tiếnhành phân tích các giống truyền thống này và so sánh dữ liệu Microsatellite của chúngvới dữ liệu tương ứng trên ngân hàng dữ liệu cacao thế giới ICGD

 Giai đoạn 3: Tối ưu hóa phương pháp.

Thực hiện phản ứng multiuplex PCR với 3 cặp primer có cùng nhiệt độ bắt cặp46oC và được đánh dấu màu huỳnh quang khác nhau: mTcCIR8, mTcCIR11,mTcCIR15 Chúng tôi chọn thử nghiệm với một số mẫu có dữ liệu microsatellitegiống nhau trên 1 cặp primer.

 Giai đoạn 4: Phân tích tính đa dạng di truyền của 21 dòng cacao bằng phần

mềm Genetix dựa trên dữ liệu microsatellite với 5 cặp primer.

3.2.3.Kỹ thuật ly trích DNA

DNA của lá cacao được ly trích theo qui trình trong luận văn tốt nghiệp củaHoàng Thị Liễu, 2004, nhưng có thay đổi tốc độ và thời gian ly tâm cho phù hợp vớiđiều kiện máy li tâm tại phòng thí nghiệm với tốc độ tối đa cho phép là 12000vòng/phút

1- Cân 0.2g lá đã rửa sạch Cho 1.2ml dịch trích EB vào eppendorf, nghiền lávới dung dịch này Vortex kỹ Ủ ở 65oC trong 45 phút.

2- Thêm 500µl Chloroform:Isoamyl alcohol (24:1), vortex 10 phút, li tâm 7phút 12000 vòng ở 4oC.

3- Chuyển lấy dịch trong, lặp lại bước 2.

4- Chuyển lấy dịch trong, thêm vào 0.5 µl RNase, ủ ở 370C trong 1 giờ.

5- Thêm vào 250µl Isopropanol lạnh Để tủa ở -200C khoảng 30 phút (nên đểqua đêm).

6- Li tâm 7 phút 12000 vòng ở 4oC Đổ bỏ dịch trong.

7- Cho vào 300µl TE 1X, ủ 370C trong 1 giờ.

8- Thêm 20µl muối Sodium acetate 3M và 640µl Ethanol 96%, trộn đều và để-200C trong 30 phút.

12-Bảo quản mẫu ở 4oC

Hình 3.3: Giai đoạn nghiền mẫuHình 3.4: DNA tiếp tục được tinh sạch3.2.4.Kiểm tra định lượng và định tính DNA

3.2.4.1 Định tính DNA bằng phương pháp điện di

Để kiểm tra kết quả li trích có thu được DNA hay không, chúng tôi tiến hànhđiện di các mẫu DNA đã li trích trên gel agarose 1.4%, nấu agarose trong lò viba trong2.5 phút, 500W

Trộn 4 µl sản phẩm li trích với 2µl loading dye (BioRad) Vận hành máy điệndi ở 100V, 250A trong 20 phút Sau đó đem nhuộm ethium bromide trong 20 phút Gelsau khi nhuộm sẽ được chụp bằng tia tử ngoại (UV) Nếu mẫu có DNA thì băng DNAsẽ phát sáng dưới dạng vạch trên gel điện di Độ tập trung và độ đậm nhạt của băngđiện di phản ánh độ tinh sạch và nồng độ cao hay thấp của mẫu DNA.

3.2.4.2 Định lượng DNA bằng quang phổ kế

Các mẫu DNA li trích sau khi đã định tính được kiểm tra độ tinh sạch và ướclượng hàm lượng DNA bằng cách đo mật độ quang OD (optical density) với bước

sóng 260nm và 280nm bằng máy quang phổ kế với độ pha loãng 100 lần Hàm lượngDNA được tính theo công thức:

DNA (ng/µl) = [(62.9 x OD260nm) – (36 x OD280nm)] x 100

DNA được xem là sạch nếu tỉ số OD260nm/OD280nm nằm trong khoảng 1.7đến 2.2.

3.2.5.Qui trình phản ứng Microsatellite 3.2.5.1.Phản ứng PCR với 1 cặp primer

Hiện nay có rất nhiều qui trình PCR microsatellite cho cacao, nhưng chúng tôichỉ chọn áp dụng qui trình cũng như thành phần hóa chất của Đại Học Reading (AnhQuốc) vì nó phù hợp với trình tự primer tổng hợp.

Thứ tự pha trộn mẫu trong phản ứng PCR tuân theo thứ tự được liệt kê ở bảngbên dưới để đảm bảo hiệu quả phản ứng Sau khi cho Taq polymerase vào phản ứngPCR sẽ bắt đầu xảy ra, do vậy phải nhanh chóng cho vào máy PCR để bắt đầu quitrình phản ứng

Tổng thể tích cho 1 phản ứng PCR là 20µl với thành phần phản ứng như sau:

Bảng 3.3: Thành phần hóa chất cho 1 phản ứng PCR

Thành phầnDung dịch gốc Thể tích sử dụng

H2O cất hai lầnPCR bufferMgCl2

dNTPPrimer mixDNA mẫuTaq polymerase

Do các primer sử dụng có nhiệt độ bắt cặp khác nhau, chuyên biệt cho từng loạiprimer, nên trong mỗi qui trình PCR cần phải điều chỉnh nhiệt độ bắt cặp thích hợpcho từng primer

3.2.5.1.Phản ứng multiplex PCR với 3 cặp primer

Multiplex PCR rất cần thiết trong nghiên cứu về microsatellite vì nó có thểnghiên cứu nhiều al, nhiều locus có kích thước khác nhau cùng một lúc Ngày nay vớisự phát triển của các chất nhuộm màu huỳnh quang cho phép nghiên cứu cùng lúcnhững al có kích thước bằng nhau và được gắn các màu huỳnh quang khác nhau.

Để phản ứng multiplex PCR cho kết quả tốt, tất cả các locus phản ánh đúng,chính xác thì các primer phải có nhiệt độ bắt cặp gần nhau.

Dựa trên thành phần phản ứng PCR với 1 cặp primer, chúng tôi thay thànhphần nước bằng thể tích của 2 cặp primer Do đó tổng thể tích cho 1 phản ứngmultiplex PCR là 22.2µl với thành phần phản ứng như sau:

Bảng 3.5: Thành phần hóa chất cho 1 phản ứng multiplex PCRThành phần Dung dịch gốc Thể tích sử dụng

PCR bufferMgCl2

Primer mix 1Primer mix 2Primer mix 4DNA mẫuTaq polymerase

Chúng tôi áp dụng qui trình PCR trên cho phản ứng multiplex PCR với 3 primer mTcCIR8, mTcCIR11 và mTcCIR15có cùng nhiệt độ Ta = 46oC Ba primer này

được đánh dấu bằng 3 màu huỳnh quang khác nhau: primer mTcCIR8 có màu xanh lá cây, mTcCIR11 có màu vàng và mTcCIR15 có màu đỏ.

Các mẫu khác nhau nhưng được khuếch đại bởi cùng loại primer có băng điệndi rất giống nhau nên không thể phân biệt được trên gel điện di agarose, cần phải tiếptục phân tích trên máy giải trình tự DNA

3.2.7.Phương pháp phân tích trình tự bằng máy giải trình tự DNA

Sản phẩm PCR được đưa vào phân tích trình tự qua 3 bước chính:

 Bước 1: Tiến hành trộn mẫu PCR với size standard và hidi formamide.

Tổng thể tích cho 1 phản ứng trên máy giải trình tự DNA là 10µl với thànhphần phản ứng như sau:

Thành phầnThể tích dùng cho 1 phản ứng

Sản phẩm PCRSize standardHidi formamide

Bước 2: Biến tính mẫu ở 95oC trong 5 phút bằng máy PCR để DNAmạch đôi tách thành 2 mạch đơn Sau đó phải giữ lạnh mẫu trong đá ngay để 2 mạchđơn không bắt cặp lại với nhau.

 Bước 3: Bơm 10µl mẫu vào từng ô trên đĩa, sau đó đưa vào máy giải trình tựDNA đã được lắp đặt sẵn mao quản thích hợp và cài đặt chương trình phù hợp trong

phần mềm Gene Mapper, là phần mềm sẽ phân tích kích thước al chứa trình tựmicrosatellite Máy sẽ tiến hành điện di và phân tách các sản phẩm PCR bên trongmao quản.

Kết quả được phân tích tự động dựa trên số liệu trong bin set do công tyMaster Food cung cấp Bin set là một tập tin dạng text, chứa đầy đủ thông tin về kíchthước và độ tin cậy của các al tương ứng với mỗi loại primer, 5 bin set của 5 loạiprimer sau khi được thiết lập trong phần mềm Gene Mapper sẽ phân tích kết quả tựđộng để cho ra dữ liệu của 2 al có độ tin cậy cao nhất của từng mẫu với mỗi loạiprimer Do đó, có những trường hợp kết quả phân tích có nhiều hơn 2 al microsatellitenhưng bin set chỉ cho ra dữ liệu của 2 al đặc trưng nhất (có độ tin cậy cao nhất).

Hình 3.5: Đĩa bơm mẫuHình 3.6: Lắp cappilary vào máy

 Một số sản phẩm PCR được tinh sạch để so sánh hiệu quả phân tích giữa 2nghiệm thức: tinh sạch và không tinh sạch Qui trình tinh sạch gồm các bước sau:

- Bước 1: Hút 2.5µl EDTA 125mM và 60µl Ethanol 100% Đảo nhẹ ống vàđể ở nhiệt độ phòng trong 15 phút

- Bước 2: Li tâm 12000 vòng trong 30 phút ở 4oC.- Bước 3: Hút bỏ dịch trong.

- Bước 4: Hút 60µl Ethanol 70% cho vào mỗi ống Li tâm 12000 vòng trong20 phút ở 4oC.

- Bước 5: Hút bỏ dịch trong Làm khô trong 30 phút.

- Bước 6: Hoà tan DNA đã tinh sạch trong 10µl nước cất tinh khiết Sau đó làm tiếp tục với ba bước phân tích trình tự như trên.

3.2.9.Phương pháp phân tính mức độ đồng nhất di truyền bằng phần mềmCevus

Cervus là một phần mềm phân tích tần số al để kiểm tra sự đồng nhất di truyền củacác cá thể và tìm ra đời bố mẹ của cá thể dựa trên các chỉ tiêu được lựa chọn Cervusphân tích tần số al dựa trên dữ liệu về kiểu gen của các codominant- loci Dữ liệu đưavào phân tích ở dạng bảng trong Excel và kết quả phân tích sẽ được xuất ra dưới dạngfile text.

Chúng tôi đưa vào dữ liệu di truyền microsatellite 13 dòng cacao thương mại và 13mẫu mã hoá (từ A2 đến A14) với 3 primer mTcCIR15, mTcCIR18 và mTcCIR8 đểtiến hành phân tích sự đồng nhất của các cá thể dựa trên sự trùng khớp giữa các locicủa chúng (matching loci), từ đó chúng tôi sẽ định danh được các mẫu mã hoá.

Chúng tôi tiến hành phân tích kết quả dựa trên dữ liệu microsatellite của 3 loci đãloại trừ những allele dropping (xem trang 57) Mỗi loci gồm 2 al đồng hợp(VD: al 292- al 292) hoặc 2 al dị hợp (VD: al 235- al 244), đây cũng chính là đặc tínhcủa codominant-loci.

Bảng 3.7: Dữ liệu microsatellite đưa vào phân tích trong phần mềm Cervus

Cervus sẽ tiến hành kiểm tra tất cả các cá thể và đưa ra dữ liệu của những cặp cá thể cósự đồng nhất về mặt di truyền thỏa mãn các chỉ tiêu đề ra Có 3 chỉ tiêu chính sau:

 Số lượng loci phân tích.

 Số lượng loci đồng nhất tối thiểu  Số loci sai khác cho phép.

Chúng tôi dựa trên kết quả kiểm tra và nhận diện các cặp cá thể có sự đồng nhấtdi truyền do Cevus phân tích để định danh các mẫu mã hóa Do đó việc định danh sẽchính xác và khách quan

3.2.9.Phương pháp phân tích tính đa dạng di truyền bằng phần mềm Genetix

Genetix là một phần mềm tiếng Pháp dùng cho nghiên cứu di truyền quần thểdựa trên định luật Hardy-Weinberg và xử lý bằng phép toán thống kê Fichier (Weir &Cockerham,1984) thông qua giá trị thống kê F Giá trị này xác định mối quan hệ giữacác al của các cá thể và nó liên quan đến hệ số cận huyết Hệ số này có thể đánh giámối quan hệ không ngẫu nhiên giữa các al trong quần thể, nó cũng đánh giá sự giaophối thân cận giữa các đơn vị dưới quần thể và quần thể.

Từ 21 dòng cacao khảo sát, căn cứ vào tên giống, chúng tôi có 6 quần thể vớidữ liệu microsatellite tương ứng với 5 primer của mỗi cá thể được đưa vào phần mềmGenetix để tiến hành phân tích mối quan hệ di truyền gần hoặc xa giữa các quần thể vàgiữa các cá thể trong quần thể dựa trên biểu đồ 3D (3 chiều).

Khoảng cách về chiều dài của các al microsatellite chứa thông tin về khoảngcách di truyền giữa các quần thể Hai quần thể càng tách biệt nhau về mặt di truyền thìtần số các al khác nhau càng rõ rệt Những tính toán về khoảng cách di truyền giữa cácquần thể có sự giao phối ngẫu nhiên và có sự phân ly ít trong quá trình di truyền sẽgiúp chỉ ra cấu trúc của quần thể và dưới quần thể

Bảng 3.8: Dữ liệu microsatellite được đưa vào phân tích trong Genetix