xây dựng quy trình khảo sát sự di căn trên dòng tế bào ung thƣ biểu mô phổi a549

BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƢỢC TP HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT (TOÀN VĂN) ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP TRƢỜNG XÂY DỰNG QUY TRÌNH KHẢO SÁT SỰ DI CĂN TRÊN DÒNG TẾ BÀO UNG THƢ BIỂU MÔ PHỔI A549 Mã số: Chủ nhiệm đề tài: CN VÕ VĂN THÀNH NIỆM Tp Hồ Chí Minh, 11/2017 BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƢỢC TP HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT (TỒN VĂN) ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƢỜNG XÂY DỰNG QUY TRÌNH KHẢO SÁT SỰ DI CĂN TRÊN DỊNG TẾ BÀO UNG THƢ BIỂU MÔ PHỔI A549 Mã số: Chủ nhiệm đề tài (ký, họ tên) Tp Hồ Chí Minh, 11/2017 DANH SÁCH NHỮNG THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI VÀ ĐƠN VỊ PHỐI HỢP CHÍNH Danh sách thành viên tham gia nghiên cứu: Chuyên ngành Cơ quan công tác STT Họ tên Võ Văn Thành Niệm ĐH Y Dƣợc TPHCM Nguyễn Văn Linh ĐH Cần Thơ Đào Trọng Thức ĐH Quốc Tế Trƣơng Đinh Kiều Diễm ĐH Y Dƣợc TPHCM Bùi Chí Bảo ĐH Y Dƣợc TPHCM Đơn vị phối hợp chính: -Nơi thực đề tài: Đại học Y Dƣợc TP.HCM -Nơi cung cấp bệnh phẩm: MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG BIỂU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU A MỞ ĐẦU 1.TỔNG QUAN ĐỀ TÀI ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 26 B KẾT LUẬN 30 TÀI IỆU TH HẢO 30 DANH MỤC BẢNG BIỂU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng Giai đoạn ung thƣ phổi không tế bào nhỏ 12 Bảng Giai đoạn ung thƣ phổi tế bào nhỏ 15 Bảng Các thành phần môi trƣờng nuôi cấy tế bào 20 Bảng Thể tích Trypsin khác cho loại đĩa nuôi cấy 23 DANH MỤC BẢNG HÌNH Hình Tế bào ung thƣ phổi phát triển không kiểm soát hai phổi Hình Biểu đồ tỷ lệ chết ngƣời Mỹ đƣợc chẩn đoán ung thƣ phổi năm Hình Các lĩnh vực khí quản tiền chất sinh bệnh phân tử ung thƣ phổi Hình Giai đoạn IIIA IIIB ung thƣ phổi 14 Hình Giai đoạn IV ung thƣ phổi 14 Hình Các dạng tế bào ung thƣ phổi 21 Hình Quy trình rã đơng tế bào 22 Hình Quy trình cấy truyền tế bào 24 Hình Quy trình đơng lạnh tế bào 25 Hình 10 Tóm tắt quy trình thí nghiệm xâm lấn 26 Hình 11 Tế bào di chuyển lấp kín vết xƣớc theo thời gian A: giờ, B: giờ, C: 20 giờ, D: 24 giờ, E: 48 Bar = 100µm 27 Hình 12 Độ rộng vết xƣớc đĩa nuôi cấy tế bào A549 theo thời gian 28 Hình 13 Tế bào di chuyển qua màng dƣới tác động chất hƣớng hoá A: đối chứng khơng có huyết thanh, B: sau 48 ni cấy có huyết Bar = 50 µm 29 Hình 14 So sánh khả xâm lấn tế bào ung thƣ dƣới tác động chất hƣớng hoá theo thời gian 29 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt Viết đầy đủ Giải nghĩa NSCLC Non-Small Cell Lung Cancer ung thƣ biểu mô phổi tế bào nhỏ ung thƣ biểu mô phổi không tế bào nhỏ SCLC Small Cell Lung Cancer ung thƣ phổi tế bào nhỏ BM Basement membrane màng đáy ECM Extracellular matrix mạng lƣới chất ngoại bào THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU A MỞ ĐẦU TỔNG QU N ĐỀ TÀI Ung thƣ bệnh lý ác tính tế bào, tế bào bị biến đổi, tăng sinh vơ hạn, khơng chịu kiểm sốt thể Trong trình phát triển trì sống, tế bào bị biến đổi nhiều yếu tố khác nhƣ môi trƣờng, chế độ ăn uống sinh hoạt yếu tố nội tiết Sự biến đổi tế bào từ nhẹ đến nặng theo nhiều mức độ khác Nếu biến đổi mức nhẹ, thể tự sửa chữa hỏng hóc nhỏ Nếu biến đổi nặng đến mức ác tính, thể khơng thể sửa chữa đƣợc có thể bỏ tế bào thay tế bào khác Tuy nhiên, thời điểm đó, hệ thống sửa chữa bị yếu ―lơ cảnh giác‖ khiến tế bào bị biến đổi có hội tồn nhân lên với số lƣợng lớn đến mức tiêu diệt đƣợc Đồng thời hệ thống điều hòa thể trở nên vô dụng ―đội quân tế bào ác tính‖ Đây mốc quan trọng khởi phát bênh ung thƣ sau Ở giai đoạn tiếp theo, đội quân ác tính nhân lên, ―bành trƣớng‖ xung quanh (từ 1.000 tế bào lên 1.000.000 tế bào) Với số lƣợng tế bào nhƣ vậy, tạo thành khối u nhƣng cịn nhỏ khó phát hiện, kể loại máy móc đại Q trình nói chiếm tới 75% thời gian phát triển bệnh ung thƣ (trung bình 15 - 20 năm) Tiếp theo, khối u ác tính xâm lấn vào vùng xung quang tế bào ung thƣ có khả di động dễ dàng khối u có khả làm tiêu protein xung quanh, làm cho vùng lỏng lẻo Ung thƣ phổi bệnh ung thƣ nguy hiểm nam nữ(1) Tỷ lệ tử vong vƣợt ba loại ung thƣ phổ biến (đại tràng, vú tụy) kết hợp(2) Hơn nửa số bệnh nhân đƣợc chẩn đoán bị ung thƣ phổi chết vịng năm chẩn đốn tỷ lệ sống năm khoảng 17,8%(3) Ung thƣ phổi phát triển khơng kiểm sốt đƣợc tế bào bất thƣờng hai phổi Những tế bào bất thƣờng không thực chức so với tế bào phổi bình thƣờng không phát triển thành mô phổi khỏe mạnh Khi chúng phát triển, tế bào bất thƣờng hình thành khối u can thiệp vào chức phổi, cung cấp oxy cho thể qua máu Hình Tế bào ung thƣ phổi phát triển khơng kiểm sốt hai phổi Trong ba thập kỷ tới, ung thƣ phổi nữ tăng nhanh gấp ba mƣơi lăm lần so với ung thƣ phổi nam giới, nhà khoa học từ trƣờng King's College London báo cáo vào tháng 10 năm 2012 Các nhà khoa học ƣớc tính Anh, tử vong ung thƣ phổi nữ đạt 95.000 năm vào năm 2040, từ 26.000 năm 2010 - tăng 350% Tử vong ung thƣ phổi hàng năm nam giới tăng 8% so với kỳ, lên 42.000 vào năm 2040 từ 39.000 năm 2010 Các báo cáo nói ung thƣ phổi tiếp tục kẻ giết ngƣời lớn ba mƣơi năm tới Năm 2040, tỷ lệ ngƣời sống với bệnh ung thƣ phổi cao gấp lần so với năm 2010 Lý cho gia tăng ckéo dài tuổi thọ - bạn già, nguy ung thƣ cao, bao gồm ung thƣ phổi Ung thƣ phổi giết chết gần 162.000 ngƣời Mỹ năm, nhiều loại bệnh ác tính khác, nhƣng có giá trị tài trợ nghiên cứu cho chết loại ung thƣ lớn khác So với ung thƣ vú – bệnh đƣợc ý nhiều nhƣng giết chết 30.000 phụ nữ năm so với ung thƣ phổi Hình Biểu đồ tỷ lệ chết ngƣời Mỹ đƣợc chẩn đoán ung thƣ phổi năm Có hai loại phụ ung thƣ phổi, ung thƣ biểu mô phổi tế bào nhỏ ung thƣ biểu mô phổi không tế bào nhỏ (NSCLC), chiếm lần lƣợt 15% 85% tổng số ung thƣ phổi(4) NSCLC đƣợc phân loại thành ba loại: ung thƣ biểu mô tế bào vảy, ung thƣ biểu mô tuyến ung thƣ biểu mô tế bào lớn Ung thƣ biểu mô tế bào vảy chiếm 25-30% tất ca ung thƣ phổi Nó phát sinh từ phiên ban đầu tế bào vảy tế bào biểu mô đƣờng hô hấp ống phế quản trung tâm phổi Loại phụ NSCLC có liên quan chặt chẽ với việc hút thuốc lá(5) Loại ung thƣ phổi phổ biến ung thƣ biểu mơ; bao gồm khoảng 40% tất bệnh ung thƣ phổi Nó phát sinh từ tế bào biểu mơ đƣờng hô hấp nhỏ, loại II, tiết chất nhầy chất khác(6) Ung thƣ tuyến loại phổ biến ung thƣ phổi ngƣời hút thuốc không hút thuốc nam giới phụ nữ tuổi tác họ (7) Nó có xu hƣớng xảy vùng ngoại vi phổi(8), việc bổ sung lọc thuốc ngăn hạt lớn xâm nhập vào phổi Điều dẫn đến hít phải khói thuốc sâu hơn, dẫn đến tổn thƣơng ngoại biên(9) So với loại ung thƣ phổi khác, ung thƣ biểu mơ có xu hƣớng phát triển chậm có nhiều hội đƣợc phát trƣớc lan ngồi phổi Ung thƣ biểu mô tế bào lớn (không phân biệt) chiếm 5–10% ung thƣ phổi Đây loại ung thƣ biểu mơ cho thấy khơng có chứng trƣởng thành vảy tuyến kết thƣờng đƣợc chẩn đốn theo mặc định Ung thƣ biểu mơ tế bào lớn thƣờng bắt đầu phần trung tâm phổi, vào hạch bạch huyết gần vào thành ngực nhƣ quan xa(10) Các khối u ung thƣ biểu mô tế bào lớn liên quan chặt chẽ với việc hút thuốc lá(11) Tất tế bào thể chứa vật liệu di truyền đƣợc gọi axit deoxyribonucleic (DNA) Mỗi tế bào trƣởng thành phân chia thành hai tế bào mới, DNA đƣợc nhân đơi xác Các tế bào tế bào ban đầu, giống hệt theo cách Bằng cách này, thể liên tục bổ sung cho chúng Các tế bào cũ chết hệ thay chúng Một bệnh ung thƣ bắt đầu với lỗi, đột biến, DNA tế bào Biến đổi DNA đƣợc gây q trình lão hóa bình thƣờng thông qua yếu tố môi trƣờng, chẳng hạn nhƣ khói thuốc lá, hít thở sợi amiăng tiếp xúc với khí radon Các nhà nghiên cứu phát phải loạt đột biến để tạo tế bào ung thƣ phổi Trƣớc trở thành ung thƣ hoàn toàn, tế bào tiền ung thƣ, chúng có số đột biến nhƣng hoạt động bình thƣờng nhƣ tế bào phổi Khi tế bào với đột biến di truyền phân chia, theo gen bất thƣờng đến hai tế bào mới, sau phân chia thành bốn tế bào có lỗi DNA chúng vân vân Với đột biến mới, tế bào mô phổi trở nên đột biến khơng hiệu việc thực chức nhƣ tế bào phổi Ở giai đoạn sau bệnh, số tế bào di chuyển khỏi khối u ban đầu bắt đầu phát triển phận khác thể Quá trình đƣợc gọi di vị trí xa đƣợc gọi di Hút thuốc yếu tố nguy hàng đầu gây ung thƣ phổi(2) Khi thuốc trở thành sản phẩm thuốc đƣợc sản xuất vào năm 1900, ung thƣ phổi trở nên phổ biến Tăng số lƣợng năm số gói hút thuốc ngày làm tăng mức độ nguy ung thƣ phổi(12) Hút thuốc gây 80% tử vong ung thƣ phổi Một nguy tƣơng đối phát triển ung thƣ phổi từ hút thuốc thụ động đƣợc tìm thấy 1,14 đến 5,20 ngƣời chƣa hút thuốc nhƣng sống với ngƣời hút thuốc dựa phân tích tổng hợp đánh giá toàn diện(13) Theo Tổng bác sĩ phẫu thuật Hoa Kỳ, sống với ngƣời hút thuốc làm tăng nguy phát triển ung thƣ phổi ngƣời không hút thuốc khoảng 20–30%(14) thẩm thấu, nhiệt độ) Hầu hết tế bào đòi hỏi bề mặt chất nhân tạo tế bào khác đƣợc thả tự mơi trƣờng nuôi cấy Các tế bào đƣợc nuôi trì nhiệt độ thích hợp hỗn hợp khí (điển hình 37°C, 5% CO2 cho tế bào động vật có vú) lồng ấp tế bào Ngồi hỗn hợp nhiệt độ khí, yếu tố phổ biến hệ thống nuôi cấy môi trƣờng tăng trƣởng tế bào Bí cho tăng trƣởng tế bào khác pH, nồng độ glucose, yếu tố tăng trƣởng diện chất dinh dƣỡng khác Các yếu tố tăng trƣởng đƣợc sử dụng để bổ sung cho trình tế bào tồn sinh trƣởng bắt nguồn từ huyết máu động vật, chẳng hạn nhƣ huyết bò (FBS), huyết ngựa, huyết lợn Một biến chứng thành phần có nguồn gốc từ máu khả gây ô nhiễm môi trƣờng với virus prion, đặc biệt ứng dụng công nghệ sinh học y tế Mật độ mạ (số thể tích mơi trƣờng ni cấy) đóng vai trị quan trọng số loại tế bào Ví dụ, mật độ mạ thấp làm cho tế bào granulosa thể sản xuất estrogen, mật độ mạ cao làm cho chúng xuất dƣới dạng tế bào lutein sản xuất progesterone Các tế bào đƣợc nuôi hệ thống bám dính Một số tế bào tự nhiên sống hệ thống nổi, mà không đƣợc gắn vào bề mặt, chẳng hạn nhƣ tế bào tồn máu Bên cạnh đó, tế bào bám dính địi hỏi bề mặt, nhƣ nhựa cấy mô microcarrier, đƣợc phủ thành phần ngoại bào (nhƣ collagen laminin) để tăng tính bám dính cung cấp tín hiệu khác cần thiết cho tăng trƣởng khác biệt Bảng Các thành phần môi trƣờng nuôi cấy tế bào THÀNH PHẦN CHỨC NĂNG Nguồn cacbon (glucose / Nguồn lƣợng glutamine) Axít amin Tổng hợp protein Vitamin Thúc đẩy sống tế bào tăng trƣởng Dung dịch muối cân Một hỗn hợp đẳng trƣơng ion để trì áp suất thẩm thấu tối ƣu tế bào cung cấp ion kim loại cần thiết để hoạt động nhƣ cofactors cho phản ứng enzym, bám dính tế bào Chỉ thị pH nhuộm màu Màu sắc phenol đỏ thay đổi từ màu cam / đỏ pH 7-7,4 đến Phenol màu vàng pH có tính axit (thấp hơn) màu tím pH (cao hơn) Đệm Bicarbonate / HEPES Nó đƣợc sử dụng để trì độ pH cân mơi trƣờng Hình Các dạng tế bào ung thƣ phổi ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu Tế bào ung thƣ biểu mô phổi A549 2.2 Phương pháp a Nuôi cấy tế bào Trong nghiên cứu tế bào ung thƣ biểu mô phổi A549 đƣợc nuôi môi trƣờng DMEM bổ sung 10% huyết thai bò (FBS), 1% penicillin streptomycin, 37oC, 5% CO2 b Quy trình rã đơng Đầu tiên, làm tan tế bào đông lạnh nhanh chóng (