Xây dựng quy trình khảo sát gen RB1 trong ung thư nguyên bào võng mạc (Retinoblastoma)

U nguyên bào võng mạc (UNBVM), một trong những loại ung thư thường gặp nhất ở trẻ nhỏ trong khoảng độ tuổi từ 1-5 tuổi. Tỷ lệ mắc phải trong khoảng từ 1/14000 đến 1/20000 trẻ em sinh ra trên toàn thế giới. Đột biến trên gen RB1 được cho là nguyên nhân quan trọng nhất dẫn đến UNBVM.

Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 20 * Phụ Số * 2016 XÂY DỰNG QUY TRÌNH KHẢO SÁT GEN RB1 TRONG UNG THƯ NGUYÊN BÀO VÕNG MẠC (RETINOBLASTOMA) Nguyễn Thế Vinh*, Hồng Anh Vũ* TĨM TẮT Mở đầu: U ngun bào võng mạc (UNBVM), loại ung thư thường gặp trẻ nhỏ khoảng độ tuổi từ 1-5 tuổi Tỷ lệ mắc phải khoảng từ 1/14000 đến 1/20000 trẻ em sinh toàn giới Đột biến gen RB1 cho nguyên nhân quan trọng dẫn đến UNBVM.Việc phát sớm đột biến gen RB1 giúp phòng ngừa, chẩn đốn sớm hạn chế hậu khơng UNBVM mà số ung thư khác (có liên quan đến đột biến gen RB1)cho bệnh nhân thân nhân người bệnh Mục tiêu: Xây dựng quy trình ứng dụng kỹ thuật giải trình tự khảo sát đột biến gen RB1 Đối tượng phương pháp: Sử dụng phương pháp khuếch đại chuỗi DNA (PCR) giải trình tự Sanger tồn exon vùng mã hóa protein gen RB1 genomic DNA từ mẫu khối u máu ngoại vi lấy từ bệnh nhân UNBVM Kết quả: Thiết kế thành công 19 cặp mồi quy trình PCR khuếch đại 27 exon gen RB1 Phát đột biến dòng mầm g.69681C>T (NG_009009) gen RB1 Kết luận: Nghiên cứu hồn thiện quy trình ứng dụng thành cơng kỹ thuật giải trình tự chẩn đốn đột biến gen RB1 Từ khóa: u ngun bào võng mạc, genRB1, kỹ thuật giải trình tự ABSTRACT DEVELOP A PROTOCOL FOR SCREENING RB1 MUTATIONS IN RETINOBLASTOMA PATIENTS Nguyen The Vinh, Hoang Anh Vu * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 20 - Supplement of No - 2016: 94 - 100 Background: Retinoblastoma is one of the most frequent cancer in children age 1-5 The incidence is between 1/14000 -1/20000 live births all over the world The RB1 mutations aremajor cause lead to retinoblastoma Early identifying mutations on RB1 gene is important for prevention, diagnosis and controlling the outcomes of retinoblastoma and several other cancers (related to mutations on RB1 gene) as well for patients and their family Objective: Develop a sequencing protocol for RB1mutations screening Method: Use PCR method and Sanger sequencing to all of exons of RB1 coding site of genomic DNA extracted from tumor tissue and blood of retinoblastoma patients Results: Successfully designed 19 pairs of primer and PCR protocol that amplifies 27 exons of RB1 Identified a nonsense mutation g.69681C>T (NG_009009) of exon 12 of RB1 Conclusion: Our research has developed and applied successfully a sequencing protocol to identify mutations of RB1 Keywords: Retinoblastoma, RB1, sequencing * Trung tâm Y sinh học Phân tử, Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: CN.Nguyễn Thế Vinh ĐT: 0935827668 email:vinhnguyen29391@gmail.com 94 Chuyên Đề Tai Mũi Họng – Mắt Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 20 * Phụ Số * 2016 ĐẶT VẤN ĐỀ U nguyên bào võng mạc xuất phát từ tế bào tiền thân nhóm tế bào thụ quan ánh sáng võng mạc mắt, thường xảy với tần suất 1/14000 đến 1/20000 trẻ độ tuổi tuổi, sau độ tuổi bệnh phát hiện(4) Bệnh xảy hai dạng: dạng ngẫu nhiên (khơng có tính di truyền từ gia đình) dạng gia đình (có tính di truyền)(3) Dạng gia đình UNBVM xuất trẻ có cha mẹ mắc bệnh này, bệnh nhân thường có nhiều ổ khối u hai mắt, tần suất dạng khoảng 20%(10) Hơn việc chữa trị khối u mắt với phương pháp xạ trị phẫu thuật, không làm giảm nguy cao mắc ung thư xương – osteosarcoma (gấp 500 lần so với bình thường) suốt tuổi niên bệnh nhân tính nhạy cảm với nhiều loại ung thư khác suốt đời(15) Hầu hết bệnh nhân phát giai đoạn bệnh tiến xa, gây chết nên phải sử dụng phương pháp múc bỏ nhãn cầu để điều trị, bệnh nhân biểu bệnh bên mắt tỷ lệ chữa khỏi 95%(1) Những bệnh nhân có khối u hai mắt thường phải điều trị nhiều phương pháp kết hợp (hóa trị, trị liệu chỗ…) Với việc phát sớm bệnh, tỷ lệ bệnh UNBVM nước phát triển chữa trị thành công bảo tồn thị lực bệnh nhân 95%(8) Đột biến gen RB1 yếu tố cho quan trọng gây UNBVM Gen RB1 gồm 27 exon, nằm nhiễm sắc thể (NST) 13 mã hóa cho chuỗi protein dài 928 acid amin Sản phẩm gen RB1 tham gia vào hệ thống điều hòa chu kỳ tế bào thơng qua phosphoryl hóa khử phosphoryl hóa suốt q trình tăng sinh biệt hóa tế bào(7) Phổ đột biến gen RB1 trải dài exon vùng tiếp nối intron-exon không tập trung vào vùng cụ thể, đa số đột biến điểm, chèn vài nucleotide số đột biến đoạn lớn(5, 11) RB1 thuộc nhóm gen ức chế khối u, Mắt Nghiên cứu Y học RB1 đột biến mang tính trạng lặn UNBVM thường phát sinh có đột biến gây bất hoạt alen gen RB1(3, 6) Đột biến alen thường đột biến sinh dưỡng, đột biến denovo trường hợp dạng ngẫu nhiên, đột biến dòng mầm trường hợp dạng gia đình Đột biến alen lại thường xảy tế bào võng mạc(12) Việc sử dụng phương pháp giải trình tự Sanger thích hợp cho nghiên cứu phổ đột biến rộng gen RB1 đột biến đa phần đột biến nhỏ Phát đột biến gen RB1 có ý nghĩa quan trọng bệnh nhân điều trị khả tái phát nguy mắc loại ung thư khác đồng thời xây dựng quy trình tầm soát nguy UNBVM cho người lành mang gen bệnh Điều trị sớm cho bệnh nhân mắc có nguy UNBVM làm tăng khả chữa trị bảo toàn thị lực(13) Ứng dụng phương pháp xét nghiệm gen y sinh học phân tử việc chẩn đoán bệnh UNBVM, bệnh di truyền khác cho kết xác, nhanh chóng Đồng thời giúp chẩn đốn sớm bệnh bệnh nhân có biểu triệu chứng bệnh chưa rõ ràng, tiềm ứng dụng chẩn đoán tiền sinh ĐỐITƯỢNG-PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU Đối tượng nghiên cứu Mẫu genomic DNA thu nhận từ khối u (đã chọn lọc vùng ung thư bác sĩ bệnh viện Mắt Thành phố Hồ Chí Minh) máu bệnh nhân mắc UNBVM bên mắt (mẫu khối u thu nhận từ vùng mắt phải bệnh nhân) Phương pháp nghiên cứu Nghiên cứu thực Trung tâm Y Sinh Học Phân Tử - Đại học Y Dược TP.HCM Mẫu xét nghiệm mẫu mô khối u máu ly trích DNA giải trình tự DNA tồn 27 exon gen RB1 95 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 20 * Phụ Số * 2016 Tách chiết genomic DNA từ mẫu máu: tiến hành lấy ml máu tĩnh mạch, cho vào ống chống đơng có EDTA, lắc nhẹ nhàng Genomic DNA tách chiết vòng 24 kit illustra blood genomicPrep Mini Spin Kit (GE Healthcare, Anh) theo hướng dẫn sử dụng nhà sản xuất bước 98oC : 10 giây, 58oC : 20 giây, 72oC : phút 30 giây; với bước 72oC : phút Trữ sản phẩm PCR 4oC Tách chiết genomic DNA từ mẫu khối u: mẫu mô tươi chuyển từ bệnh viện đến trung tâm Y Sinh Học Phân Tử vòng nhiệt độ phòng DNA từ khối u tách phương pháp Trizol/Chloroform, DNA tách chiết trữ 4oC sử dụng cho thí nghiệm sau Tinh sản phẩm: trường hợp có băng phụ xuất hiện, sản phẩm PCR mong muốn cắt từ gel tinh Sản phẩm PCR trực tiếp cắt từ gel sau tinh illustraTM GFXTM PCR DNA and Gel Band Purification Kit (GE Healthcare) theo hướng dẫn sử dụng nhà sản xuất Thiết kế mồi cho 27 exon gene RB1: sử dụng phần mềm CLC main workbench tải trình tự gene RB1 người từ NCBI(NG_009009.1), sau sử dụng cơng cụ thiết kế mồi sẵn có phần mềm để thiết kế mồi PCR cho exon gene RB1 Giải trình tự phương pháp Sanger: sản phẩm PCR tinh sạchsẽ thực phản ứng cycle sequencing với BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing kit (Applied Biosystems, Mỹ) theo hai chiều xuôi ngược Sản phẩm sau kết tủa ethanol tuyệt đối, lạnh, với hỗ trợ tủa muối NH4OAC, hòa tan Hi-Di formaldehyde, biến tính 96C trước làm lạnh đột ngột Trình tự DNA đọc máy ABI 3130 Genetic Analyzer, với POP-7 polymer capillary 50 cm (Applied Biosystems, Mỹ) Thiết lập điều kiện cho PCR khuếch đại toàn chiều dài gen RB1: Mỗi tube PCR tích 15 l chứa thành phần: 1,5μl PCR buffer 10X; 1,5μl dNTP 2,5mM; 0,75μl mồi xuôi ngược (10nM/μl); 0,1μl TaKaRa TaqTM HotStart Polymerase (Takara, Nhật Bản); 0,5μl MgCl2 25mM; 2μl genomic DNA (20-50ng/μl) 8,4μl nước cất lần khử ion Các phản ứng kèm theo chứng âm không chứa DNA để kiểm sốt ngoại nhiễm Chu trình ln nhiệt cho PCR thực máy Mastercycler@Pro S (eppendorf, Đức) Chu kỳ nhiệt: khởi đầu 98oC phút, với 40 chu kỳ lặp lại Kiểm tra sản phẩm PCR điện di thạch agarose: thạch agarose 2% có nhuộm ethium bromide quan sát với hệ thống chụp ảnh điện di Geldoc-ItTM (UVP, Mỹ) Phân tích kết giải trình tự: Kết giải trình tự phân tích phần mềm CLC Main Workbench, so sánh với trình tự chuẩn RB1 tham khảo từ ngân hàng trình tự gene website NCBI KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Kết thiết kế mồi Bảng 1: Trình tự 19 cặp mồi sử dụng khuếch đại 27 exon gen RB1 thông số STT 96 Tên mồi RB1-g1F RB1-g2F RB1-g3F RB1-g4F RB1-g5F RB1-g7F Mồi xi (5’-3’) Trình tự ttttgtaacgggagtcggga ttcactgtgtggtatcctta gccatcagaaggatgtgtta agtgatttgatgtagagctg aaccttaggtggatcagctg ggatatactctaccctgcga Mồi ngược (5’-3’) Tên mồi Trình tự RB1-g1R tcctgtcaccattctgcaga RB1-g2R tcctctgggtaatggaatta RB1-g3R gagagaatggcagttcacta RB1-g4R ggaagcattcagaatgcata RB1-g6R aagccaagcagagaatgagg RB1-g7R tcctgtcagccttagaacca Độ dài sản Vùng exon phẩm (bp) khuếch đại 418 480 417 424 1591 288 5,6 Chuyên Đề Tai Mũi Họng – Mắt Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 20 * Phụ Số * 2016 STT 10 11 12 Tên mồi RB1-g8F RB1-g9F RB1-g10F RB1-g12F RB1-g13F RB1-cF4 Mồi xi (5’-3’) Trình tự agcagagtagaagagggatg cttaccctgcattgttcaag gaaatctgtgcctctgtgtg gtgggaggcagtgtatttga cagtagttgtggttacctag gaggttgtaatggccacata Mồi ngược (5’-3’) Tên mồi Trình tự RB1-g8R ttagggagaacttacatcta RB1-g9R caattatcctccctccacag RB1-g11R accacacctggccttcaata RB1-g12R tggtgagcaaggcaaatagg RB1-g13R cagcagggatatagtatctg RB1-g17R2 gatccttgggctatagactg 13 14 15 16 RB1-g18F RB1-g19F RB1-g20F RB1-g21F2 gccactgtcaattgtgccta ctgggtgtacaaccttgaag catgtttctctgggggaaag gggacaagagccaaagttag RB1-g18R RB1-g19R RB1-g20R RB1-g23R 17 18 19 RB1-g24F RB1-g25F RB1-g27F gtggttctagggtagaggta gggtgtttaattggggatgg tatatggcagccacttgcca RB1-g24R RB1-g26R RB1-g27R Nghiên cứu Y học Độ dài sản Vùng exon phẩm (bp) khuếch đại 415 222 1318 434 394 1372 10,11 12 13 14,15, 16,17 ggtgattcagtagcactctg ccagtcagcctagtttcaga caagtaagtagggaggagag gggattattttgatccaaga 437 282 349 1962 caatatgcctggatgaggtg aacaaacctgccaactgaag gtggccataaacagaacctg 279 1017 241 18 19 20 21,22, 23 24 25,26 27 Bảng 2: Các phản ứng khuếch đại exon gen RB Cặp mồi RB1-1F/1R RB1-2F/2R RB1-3F/3R RB1-4F/4R RB1-5F/6R RB1-7F/7R RB1-8F/8R RB1-9F/9R RB1-10F/11R RB1-12F/12R RB1-13F/13R RB1-cF4/17R RB1-18F/18R RB1-19F/19R RB1-20F/20R RB1-21F/23R RB1-24F/24R RB1-25F/26R RB1-27F/27R Mắt Genomic DNA từ máu bệnh nhân Phản ứng Phản ứng Phản ứng Phản ứng Phản ứng Phản ứng 11 Phản ứng 13 Phản ứng 15 Phản ứng 17 Phản ứng 19 Phản ứng 21 Phản ứng 23 Phản ứng 25 Phản ứng 27 Phản ứng 29 Phản ứng 31 Phản ứng 33 Phản ứng 35 Phản ứng 37 Chứng âm (nước cất Kích thước vùng khuếch đại lần khử ion) (bp) Phản ứng 418 Phản ứng 480 Phản ứng 417 Phản ứng 424 Phản ứng 10 1591 Phản ứng 12 288 Phản ứng 14 415 Phản ứng 16 222 Phản ứng 18 1318 Phản ứng 20 434 Phản ứng 22 394 Phản ứng24 1372 Phản ứng 26 437 Phản ứng 28 282 Phản ứng 30 349 Phản ứng 32 1962 Phản ứng 34 279 Phản ứng 36 1017 Phản ứng 38 241 97 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 20 * Phụ Số * 2016 Thang 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 chuẩn (bp) _ _ 2000 1500 _ 1000 _ 700 _ 500 _ 300 _ 200 Hình 1: Kết điện di sản phẩm PCR Giếng (mồi RB1-1F/1R, 418bp), giếng (mồi RB1-2F/2R, 480bp), giếng (mồi RB1-3F/3R, 417bp), giếng (mồi RB1-4F/4R, 424bp),giếng (mồi RB1-5F/6R, 1591bp), giếng 11 (mồi 7F/7R, 288bp), giếng 13 (mồi 8F/8R, 415bp), giếng 15(mồi RB1-9F/9R, 222bp), giếng 17 ( mồi RB110F/11R, 1850bp), giếng 19(mồi RB1-12F/12R, 434bp), giếng số chẵn giếng chứng âm (nước cất lần khử ion) Nhận xét: giếng sử dụng genomic DNA cho sản phẩm khuếch đại có kích thước mong muốn Các giếng chứng âm khơng có sản phẩm khuếch đại Thang 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 chuẩn (bp) _ _ 2000 1500 _ 1000 _ 700 _ 500 Hình 2: Kết điện di sản phẩm PCR Giếng 21 (mồi RB1-13F/13R, 394bp), giếng 23 (mồi RB1-cF4/17R, 1372bp), giếng 25 (mồi RB1-18F/18R, 437bp), giếng 27 (mồi RB1-19F/19R, 282bp), giếng 29 (mồi RB120F/20R, 349bp), giếng 31 (mồi RB1-21F/23R, 1962bp), giếng 33 (mồi RB1-24F/24R, 279bp), giếng 35 (mồi RB1-25F/26R, 1017bp), giếng 37 (mồi RB1-27F/27R, 241bp), giếng số chẵn chứng âm (nước cất lần khử ion) 98 Chuyên Đề Tai Mũi Họng – Mắt Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 20 * Phụ Số * 2016 Nhận xét: giếng sử dụng genomic DNA cho sản phẩm khuếch đại có kích thước Nghiên cứu Y học mong muốn Các giếng chứng âm khơng có sản phẩm khuếch đại Kết giải trình tự Genebank Patient Hình 2: Kết giải trình tự exon 12 gen RB1 DNA lấy từ mẫu khối u bệnh nhân Genebank Patient Hình 3: Kết giải trình tự exon 12 gen RB1 DNA lấy từ mẫu máu bệnh nhân Nhận xét: 27 exon khảo sát gen RB1 bệnh nhân, mẫu khối u phát đột biến điểm vị trí g.69681C>T (NG_009009) dạng đồng hợp tử, mẫu máu phát đột biến điểm vị trí g.69681C>T (NG_009009) dạng dị hợp tử BÀN LUẬN Kết điện di cho thấy mồi hoạt động tốt, tạo sản phẩm đặc hiệu, không tạo băng phụ, primer dimer Các băng có độ sáng đồng chứng tỏ dung dịch phản ứng PCR hoạt động tốt, chu trình nhiệt phù hợp với nhiệt độ bắt cặp mồi thời gian kéo dài thích hợp Các giếng chứng âm khơng có sản phẩm DNA , khơng bị ngoại nhiễm chứng tỏ thao tác điều kiện thực phản ứng PCR tốt Mắt Trong phương pháp PCR, cặp mồi sử dụng để khuếch đại nhiều vùng exon liền kề (RB1-g5F/RB1-g6R, RB1-g10F/RB1-g11R, RB1-cF4/RB1-g17R2, RB1-g21F2/RB1-g23R, RB1g25F/RB1-g26R).Việc sử dụng kết hợp giúp tiết kiệm thời gian hóa chất so với khuếch đại riêng vùng exon mà khơng làm thay đổi tính trung thực kết Kết giải trình tự phát đột biến vị trí g.69681 C>T, đột biến điểm làm thay đổi ba codon CAA thành UAA, chuyển Glutamine thành Stop codon vị trí acid amin thứ 384 chuỗi protein RB1(p.Q384X) Đột biến ghi nhận Shimizu cộng (1994), bệnh nhân mang đột biến dòng mầm có biểu bệnh hai mắt(14) 99 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 20 * Phụ Số * 2016 Từ kết giải trình tự mẫu mơ khối u mẫu máu bệnh nhân thấy khác biệt rõ ràng, mẫu mô đột biến đồng hợp tử, mẫu máu đột biến dị hợp tử Đột biến dị hợp mẫu máu thể rõ ràng tỷ lệ 50:50 alen lành alen bệnh gen RB1, kết luận đột biến dòng mầm RB1 thuộc nhóm gen ức chế khối u, tính trạng lặn, để biểu kiểu hình bệnh đòi hỏi đột biến gây hỏng phải xuất alen gen Có thể thấy rõ đột biến khối u đột biến đồng hợp, tế bào ung thư bệnh nhân thành công việc loại bỏ alen bình thường lại gen RB1, làm tế bào khả điều hòa chu kỳ tế bào protein RB1 Việc chuyển từ trạng thái dị hợp tử sang đồng hợp tử gen RB1 nhiều nghiên cứu ghi nhận chứng minh trình làm tính dị hợp (loss of heterozygocity) xảy kỳ nguyên phân tế bào(16) Do tượng làm tính dị hợp làm cho bệnh nhân có mang đột biến dòng mầm gen RB1 có nguy cao khơng với bệnh UNBVM mà số loại ung thư khác (ung thư xương(15), ung thư bàng quang(9), ung thư phổi tế bào nhỏ…(2)) KẾT LUẬN 13 Nghiên cứu thiết lập thành cơng quy trình phát đột biến 27 exon gen RB1 phương pháp giải trình tự chuỗi Sanger Điều có ý nghĩa quan trọng việc tư vấn di truyền để đưa phương pháp tầm soát ung thư thích hợp cho bệnh nhân thân nhân người bệnh 10 11 12 14 15 TÀI LIỆU THAM KHẢO 100 Chintagumpala M, Chevez-Barrios P, Paysse EA, Plon SE, Hurwitz R(2007) Retinoblastoma: review of current management The Oncologist, 12(10):1237-1246 Fletcher O, Easton D, Anderson K, Gilham C, Jay M, Peto J(2004) Lifetime risks of common cancers among retinoblastoma survivors Journal of the National Cancer Institute, 96(5):357-363 Fletcher O, Houlston RS(2010) Architecture of inherited susceptibility to common cancer Nature Reviews Cancer, 10(5):353-361 16 Francois J, Matton MT, De Bie S, Tanaka Y, Vandenbulcke D(1975) Genesis and genetics of retinoblastoma Ophthalmologica, 170(5):405-425 Houdayer C, Gauthier-Villars M, Lauge A, Pages-Berhouet S, Dehainault C, Caux-Moncoutier V, Karczynski P, Tosi M, Doz F, Desjardins L(2004) Comprehensive screening for constitutional RB1 mutations by DHPLC and QMPSF Human mutation, 23(2):193 Kufe DW, Pollock RE, Weichselbaum RR, Bast RC, Gansler TS, Holland JF, Frei E, Park BH, Vogelstein B(2003) Retinoblastoma A Paradigm for Tumor-Suppressor Gene Function, 10(7): 399 Lapenna S, Giordano A(2009) Cell cycle kinases as therapeutic targets for cancer Nature Reviews Drug Discovery, 8(7):547-566 MacCarthy A, Draper G, Steliarova-Foucher E, Kingston J(2006) Retinoblastoma incidence and survival in European children (1978–1997) Report from the Automated Childhood Cancer Information System project European Journal of Cancer, 42(13):2092-2102 Miyamoto H, Shuin T, Torigoe S, Iwasaki Y, Kubota Y(1995) Retinoblastoma gene mutations in primary human bladder cancer British journal of cancer, 71(4):831 Newsham I, Hadjistilianou T, Cavenee W(1998) Retinoblastoma Scriver CH, Beaudet A, Sly W, Valle D The metabolic and molecular bases of inherited disease Cap, 11(7):42-613 Ottaviani D, Parma D, Giliberto F, Ferrer M, Fandino A, Davila MT, Chantada G, Szijan I(2013) Spectrum of RB1 Mutations in Argentine Patients: 20-years Experience in the Molecular Diagnosis of retinoblastoma Ophthalmic genetics, 34(4):189-198 Pagon RA, Lohmann DR, Gallie BL (2000) Retinoblastoma In: Adam MP, Ardinger HH, Wallace SE, Amemiya A, Bean LJH, Bird TD, Fong CT, Mefford HC, Smith RJH, Stephens K, editors GeneReviews® [Internet] 259-263 University of Washington, Seattle Richter S, Vandezande K, Chen N, Zhang K, Sutherland J, Anderson J, Han L, Panton R, Branco P, Gallie B(2003) Sensitive and efficient detection of RB1 gene mutations enhances care for families with retinoblastoma The American Journal of Human Genetics, 72(2):253-269 Shimizu T, Toguchida J, Kato MV, Kaneko A, Ishizaki K, Sasaki MS(1994) Detection of mutations of the RB1 gene in retinoblastoma patients by using exon-by-exon PCR-SSCP analysis American journal of human genetics, 54(5):793 Thomas DM, Carty SA, Piscopo DM, Lee J-S, Wang W-F, Forrester WC, Hinds PW(2001) The retinoblastoma protein acts as a transcriptional coactivator required for osteogenic differentiation Molecular cell, 8(2):303-316 Zhu X, Dunn J, Goddard A, Squire J, Becker A, Phillips R, Gallie B(1992) Mechanisms of loss of heterozygosity in retinoblastoma Cytogenetic and Genome Research, 59(4):248-252 Ngày nhận báo: 24/11/2015 Ngày phản biện nhận xét báo: 27/11/2015 Ngày báo đăng: 01/02/2016 Chuyên Đề Tai Mũi Họng – Mắt ... đại exon gen RB Cặp mồi RB1- 1F/1R RB1- 2F/2R RB1- 3F/3R RB1- 4F/4R RB1- 5F/6R RB1- 7F/7R RB1- 8F/8R RB1- 9F/9R RB1- 10F/11R RB1- 12F/12R RB1- 13F/13R RB1- cF4/17R RB1- 18F/18R RB1- 19F/19R RB1- 20F/20R RB1- 21F/23R... loại ung thư khác (ung thư xương(15), ung thư bàng quang(9), ung thư phổi tế bào nhỏ…(2)) KẾT LUẬN 13 Nghiên cứu thiết lập thành cơng quy trình phát đột biến 27 exon gen RB1 phương pháp giải trình. .. trình tự gene website NCBI KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Kết thiết kế mồi Bảng 1: Trình tự 19 cặp mồi sử dụng khuếch đại 27 exon gen RB1 thông số STT 96 Tên mồi RB1- g1F RB1- g2F RB1- g3F RB1- g4F RB1- g5F RB1- g7F