xây dựng quy trình khuếch đại gen met trong ung thư đường tiêu hóa ở việt nam

BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT (TOÀN VĂN) ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG XÂY DỰNG QUY TRÌNH KHUẾCH ĐẠI GEN MET TRONG UNG THƯ ĐƯỜNG TIÊU HÓA Ở VIỆT NAM Mã số: Chủ nhiệm đề tài: CN NGUYỄN NHẬT QUỲNH NHƯ Tp Hồ Chí Minh, 11/2017 BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT (TÓM TẮT) ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG XÂY DỰNG QUY TRÌNH KHUẾCH ĐẠI GEN MET TRONG UNG THƯ ĐƯỜNG TIÊU HÓA Ở VIỆT NAM Mã số: Chủ nhiệm đề tài (ký, họ tên) Tp Hồ Chí Minh, 11/2017 DANH SÁCH NHỮNG THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI VÀ ĐƠN VỊ PHỐI HỢP CHÍNH Danh sách thành viên tham gia nghiên cứu: Chuyên ngành Cơ quan công tác STT Họ tên Võ Văn Thành Niệm Đại Học Y Dược TPHCM Bùi Chí Bảo Đại Học Y Dược TPHCM Nguyễn Nhật Quỳnh Như Đại Học Y Dược TPHCM Trương Đinh Kiều Diễm Đại Học Y Dược TPHCM Võ Văn Vũ Đại học Quốc Tế Đơn vị phối hợp chính: -Nơi thực đề tài: Đại Học Y Dược TPHCM -Nơi cung cấp bệnh phẩm: Bệnh viện Nhi Đồng II MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG BIỂU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC HÌNH DANH MỤC BẢNG THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU A MỞ ĐẦU TỔNG QUAN ĐỀ TÀI ĐỐI TƯƠNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .25 B KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 29 KẾT LUẬN 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO 37 DANH MỤC BẢNG BIỂU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT HCC Ung thư biểu mô tế bào gan OLT Cấy ghép gan chỉnh hình HBV Vi-rút viêm gan B HCV Vi-rút viêm gan C HBsAg Kháng nguyên bề mặt viêm gan B NAFLD bệnh gan nhiễm mỡ không rượu DCP prothrombin des-γ-carboxy ALT alanine transaminase CT chụp cắt lớp vi tính MRI chụp ảnh cộng hưởng từ AASLD Hiệp hội Nghiên cứu Bệnh gan Hoa Kỳ AFP-L3 α-fetoprotein MELD bệnh gan giai đoạn cuối PVE Tiêm mạch tĩnh mạch qua cổng OLT Ghép gan chỉnh hình DANH MỤC HÌNH Hình 1: HCC điển hình cho thấy huyết khối động mạch giai đoạn động mạch với độ rửa tương phản pha tĩnh mạch cân cổng thông tin 11 Hình 2: Các chất ức chế điều trị đường tín hiệu c-MET .18 Hình 3: Sản phẩm mồi MET 30 Hình 4: Sản phẩm mồi MTHFR 31 Hình 5: Đồ thị điểm nóng chảy cho mồi MTHFR 55oC 32 Hình 6: Đồ thị điểm nóng chảy cho mồi MTHFR 58oC 32 Hình 7: Sự khuếch đại MET mẫu ung thư gan nghiên cứu .33 Hình 8: Tương quan khuếch đại MET với yếu tố lâm sàng 34 DANH MỤC BẢNG Bảng 1: Hướng dẫn sàng lọc cho HCC Bảng 2: Giá trị tiên lượng giá trị dự đoán cho biomarker ung thu gan 21 Bảng 3: Trình tự mồi cho phản ứng qPCR 25 Bảng 4: Thành phần phản ứng real-time qPCR 27 Bảng 5: Thông tin lâm sàng mẫu 29 THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU A MỞ ĐẦU TỔNG QUAN ĐỀ TÀI Ung thư biểu mô tế bào gan (HCC) bệnh ác tính gan nguyên phát phổ biến nguyên nhân hàng đầu gây tử vong ung thư toàn giới Tại Hoa Kỳ, HCC nguyên nhân thứ gây tử vong ung thư[1] Tổng cộng có 30.640 bệnh ung thư gan ung thư ống mật ước tính xảy vào năm 2013 21.670 ca tử vong[2] HCC xảy thường xuyên nam so với nữ (2.4 : 1), với tỷ lệ cao Đông Nam Á, Trung Tây Phi, Melanesia, Micronesia / Polynesia[3] Tỷ lệ mắc bệnh ung thư gan điều chỉnh theo tuổi tăng từ 1,6 100.000 người lên 4,6 100.000 người số người Mỹ da đỏ người địa Alaska theo sau người da đen, người da trắng người gốc Tây Ban Nha[4] Có túi Hoa Kỳ, nơi số nhóm dân tộc thiểu số có tỷ lệ mắc HCC tăng đáng kể Quan trọng hơn, tỷ lệ mắc HCC tiếp tục leo thang viêm gan siêu vi C đạt đến mức trưởng thành viêm gan nhiễm mỡ khơng rượu (NASH) béo phì trở nên phổ biến Hoa Kỳ Các yếu tố rủi ro Bệnh gan mãn tính xơ gan yếu tố nguy quan trọng cho phát triển HCC, bệnh viêm gan siêu vi uống rượu mức yếu tố nguy hàng đầu toàn giới Viêm gan siêu vi mạn tính dẫn đến xơ gan / HCC Viêm gan B C nguyên nhân phổ biến gây viêm gan mạn tính giới Vi-rút viêm gan B (HBV) phân tử DNA tròn, hai sợi với tám kiểu gen (A đến H) Kiểu gen A D phổ biến châu Âu Trung Đông, kiểu gen B C phổ biến châu Á[5] Viêm gan B truyền qua truyền máu bị nhiễm, tiêm tĩnh mạch tiếp xúc tình dục Truyền lây dọc từ mẹ sang thai nhi nguyên nhân hàng đầu gây nhiễm HBV toàn giới Năm phần trăm dân số giới bị nhiễm viêm gan B[6] Một số nghiên cứu dịch tễ học chứng minh khả gây ung thư gan đáng kể với nhiễm HBV mạn tính Các chất mang mầm bệnh viêm gan B có nguy phát triển HCC từ 10 đến 25% Không giống nguyên nhân khác bệnh viêm gan mãn tính, HBV HCC phát triển mà khơng có chứng xơ gan Kiểu gen C có liên quan với nguy cao HCC so với kiểu gen A, B D[7] HCC với nồng độ HBV DNA> 105 / mL virus liên quan đến 2,5-3 lần tăng nguy phát triển HCC 8–10 năm theo dõi[8] Kháng nguyên bề mặt viêm gan B (HBsAg) điểm huyết học mang nguy đáng kể cho phát triển HCC Bệnh nhân có kháng thể kháng viêm gan B dương tính (anti-HBc) có HBsAg âm tính có nguy phát triển HCC Khả gây ung thư gan HBV giảm đáng kể điều trị thuốc kháng vi-rút B Việc ức chế virút làm giảm đáng kể tỷ lệ mắc HCC năm từ 13,7% (đối chứng) xuống 3,7%, giảm nhiều xơ gan bệnh nhân [9] Việc sử dụng vắc-xin HBV làm giảm đáng kể tỷ lệ mắc HCC từ HBV Chương trình tiêm chủng sơ sinh Đơng Á ước tính dẫn đến giảm 70% –85% tỷ lệ mắc HCC liên quan đến viêm gan B[10] Mặc dù chủng ngừa chu sinh, 5% – 10% trẻ có nguy mắc bệnh viêm gan B Việc sử dụng chất tương tự nucleoside điều trị bà mẹ mắc bệnh viêm gan B mãn tính ba tháng cuối thai kỳ chứng tỏ ưu việt việc chủng ngừa việc ngăn ngừa lây truyền sơ sinh[11] Siêu vi viêm gan siêu vi C (HCV) loại vi-rút RNA sợi đơn, nhỏ, thể tính biến đổi di truyền cao Có sáu kiểu gen khác HCV phân lập Các kiểu gen I, II III chiếm ưu nước phương Tây Viễn Đông, loại IV chiếm ưu Trung Đông Tỷ lệ nhiễm viêm gan C mãn tính cao xảy Ai Cập (18%), với tỷ lệ thấp xảy châu Âu (0,5% –2,5%), Hoa Kỳ (1,8%) Canada (0,8%)[12] 80% bệnh nhân tiến triển thành viêm gan mãn tính, với ~ 20% phát triển xơ gan Viêm gan C, phát triển HCC xảy gan với xơ gan xác định; Tuy nhiên, thử nghiệm HALT-C, 8% HCC xảy bệnh nhân xơ hóa tiến triển[13] Nhiễm trùng kép với HBV HCV bệnh nhân xơ gan làm tăng nguy HCC với tỷ lệ chênh lệch (OR) 165 so với 17 viêm gan C 23 cho bệnh viêm gan B[14] Nguy mắc HCC giảm đáng kể bệnh nhân thu đáp ứng virus bền vững sau điều trị HCV với 54% giảm tỷ lệ tử vong tất nguyên nhân Trong tiến loại thuốc gần làm cho việc điều trị HCV dễ dàng hơn, việc chủng ngừa virus cịn khó nắm bắt[15] Tiêu thụ rượu yếu tố nguy quan trọng cho phát triển HCC Mối quan hệ rượu bệnh gan tương quan với lượng rượu tiêu thụ suốt đời, với việc sử dụng rượu nặng uống rượu xã hội nguy HCC[16] Tỷ lệ lạm dụng rượu Hoa Kỳ cao gấp năm lần so với viêm gan C Lạm dụng rượu chiếm 40% –50% tất ca HCC châu Âu Các nghiên cứu châu Âu báo cáo gia tăng nguy phát triển bệnh gan tương đối 7-13 đồ uống tuần phụ nữ 14–27 đồ uống tuần nam giới [17] Tại Hoa Kỳ, nghiên cứu cho thấy nguy ung thư gan tăng gấp hai đến bốn lần người uống 60 g ethanol/ ngày[18] Một phân tích tổng hợp 19 nghiên cứu tiền cứu cho thấy tiêu thụ từ ba thức uống trở lên ngày dẫn đến nguy ung thư gan tăng 16% tiêu thụ từ thức uống trở lên ngày dẫn đến nguy tăng 22%[19] Sáu mươi phần trăm bệnh nhân 50 tuổi bị tiểu đường béo phì cho có NASH với xơ hóa tiến triển[20] Các tình trạng bệnh lý mãn tính đái tháo đường béo phì làm tăng nguy mắc bệnh HCC Đái tháo đường trực tiếp ảnh hưởng đến gan vai trị thiết yếu gan đóng vai trị chuyển hóa glucose Nó dẫn đến viêm gan mạn tính, gan nhiễm mỡ, suy gan xơ gan Tiểu đường yếu tố nguy độc lập HCC[21] Bệnh nhân tiểu đường có nguy mắc bệnh HCC cao gấp 1,8 lần Khi so sánh với HCV, cấy ghép gan HCC liên quan đến NASH tăng gần bốn lần thập kỷ 2002-2012[21] Trong năm 2006, ElSerag cộng xem xét số nghiên cứu tập kiểm soát trường hợp cho thấy đái tháo đường có liên quan đáng kể với HCC[22] Hyperinsulinemia có liên quan đến nguy tăng gấp ba lần HCC Người ta tin tác dụng pleotropic insulin điều chỉnh thác chống viêm đường khác gây tăng sinh tế bào đóng vai trò chất gây ung thư Yếu tố tăng trưởng giống insulin quan thụ thể insulin-1 thúc đẩy tăng sinh tế bào ức chế apoptosis, tương ứng[23] Người ta biết béo phì có liên quan đến nhiều bệnh gan mật, bao gồm bệnh gan nhiễm mỡ không rượu (NAFLD), nhiễm mỡ, cryptogenic xơ gan tất dẫn đến phát triển HCC[24] Béo phì làm tăng nguy HCC đến 1,5 đến lần Nguy tương đối HCC 117% đối tượng thừa cân 189% bệnh nhân béo phì[25] Phần lớn HCC-NAFLD xảy nam giới So với phụ nữ, nam giới phát triển HCC bị xơ hóa xơ gan Tuổi thọ trung bình 70 năm Có tới 50% trường hợp HCC liên quan đến NAFLD xảy trường hợp khơng có xơ gan Những khối u có khuynh hướng tổng hợp α-fetoprotein thấp (AFP) có nhiều khả có prothrombin des-γ-carboxy (DCP) cao HCC có liên quan đến HCC[26] Các điều kiện khác Tình dục đóng vai trị phát triển HCC HCC xảy thường xuyên nam giới, với tỷ lệ 2: 1–4: 1; Tuy nhiên, điều khơng quan hệ tình dục mình.42 Nam giới có nhiều khả bị nhiễm viêm gan siêu vi, tiêu thụ nhiều rượu hơn, hút thuốc có số khối thể cao phụ nữ Nó mức testosterone cao chiếm tỷ lệ cao nam giới Người ta biết nồng độ testosterone cao có liên quan đến HCC người mang mầm bệnh viêm gan B xơ gan tiến triển nam giới bị nhiễm viêm gan C mãn tính Tăng testosterone lượng steroid đồng hóa có liên quan đến tăng HCC gan u tuyến[27] Aflatoxin sản xuất loài Aspergillus (khn) tìm thấy ngũ cốc, ngơ, đậu phộng, đậu nành lưu trữ điều kiện ẩm ướt ấm áp chất gây ung thư gan mạnh Nguy HCC với aflatoxin phụ thuộc vào liều thời gian phơi nhiễm Phơi nhiễm Aflatoxin phổ biến nơng thơn Hoa Kỳ Aflatoxin có tác dụng hiệp đồng ung thư gan virus viêm gan B C gây ra, nguy mắc bệnh viêm gan B mãn tính nhiều 30 lần cộng với phơi nhiễm aflatoxin so với phơi nhiễm aflatoxin đơn độc Aflatoxin mạnh nhất, AFB1, loại bỏ môi trường giảm tỷ lệ mắc HCC[28] Các bệnh chuyển hóa di truyền liên quan đến HCC bao gồm bệnh hemochromatosis, bệnh Wilson, bệnh antitrypsin α-1, tyrosinemia, loại bệnh lưu trữ glycogen I II porphyrias Nguy mắc HCC với hemochromatosis di truyền ước tính từ 100 đến 200 lần Các tình trạng tải sắt khác thalassemia không liên quan đến HCC mà cịn có tỷ lệ HCV cao góp phần làm tăng nguy ung thư gan nguyên phát Người da đen Nam Phi tiêu thụ bia ủ trống thép nongalvanized tăng cửa hàng sắt dẫn đến tăng nguy HCC 10 lần so với người có cửa hàng sắt bình thường[29, 30] Các yếu tố nguy khác bao gồm hút thuốc Hút thuốc có liên quan với gia tăng đáng kể phát triển HCC Một phân tích gộp gần xem xét mối liên hệ hút thuốc ung thư gan chứng minh OR 1,6 (khoảng tin cậy 95% [CI], 1,3–1,9) người hút thuốc 1,5 (95% CI, 1,1–2,1) người hút thuốc Các nghiên cứu điều tra việc sử dụng thuốc tránh thai đường uống nguy phát triển HCC trước không kết luận; nhiên, đánh giá gần sáu nghiên cứu cho thấy có gia tăng đáng kể nguy HCC với thời gian dài (> năm) tiếp xúc với thuốc tránh thai đường uống[31] Sàng lọc Quan sát (Bảng 1) cho HCC nên có mục tiêu giảm tỷ lệ tử vong cải thiện kết bệnh nhân Các nghiên cứu tìm thấy lợi ích sống cịn để sàng lọc sớm bệnh nhân HCC Bệnh nhân xác định sớm có nhiều lựa chọn điều trị dẫn đến kết cải thiện Việc mẫu thử nghiệm so với mẫu đối chứng Định lượng tương đối không cần định lượng gen mục tiêu mà cịn cần có mặt gen “giữ nhà” (housekeeping gene), tức gene ổn định hầu hết tế bào, giai đoạn phát triển, không bị ảnh hưởng việc xử lý thí nghiệm Trong số trường hợp, khơng cần thiết phải xác định số lượng tuyệt đối, cần báo cáo thay đổi tương đối biểu gen đủ Trong nghiên cứu này, sử dụng phương pháp định lượng tương đối để đánh giá khuếch đại gen MET ung thư gan Để so sánh sự khuếch đại gen MET so với mẫu đối chứng, sử dụng cơng thức tính tốn gen đơn chuẩn hóa Livak: Mức độ thay đổi biểu gen = 2-∆∆Ct ∆∆𝐶𝑡 = (𝐶𝑡𝑀𝐸𝑇 − 𝐶𝑡𝑀𝑇𝐻𝐹𝑅 )𝑚ẫ𝑢 𝑢 𝑔𝑎𝑛 − (𝐶𝑡𝑀𝐸𝑇 − 𝐶𝑡𝑀𝑇𝐻𝐹𝑅 )𝑚ẫ𝑢 𝑐ℎứ𝑛𝑔 Trong đó, Ct chu kỳ ngưỡng 28 B KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN KẾT QUẢ: Đặc điểm lâm sàng mẫu Bảng 5: Thông tin lâm sàng mẫu Giới STT Mã số HCC1 Nam HCC2 Tuổi Nhiễm HBV- Chẩn Di mạch Tái HCB đoán máu phát 71 HBV HCC N Y Nữ 71 HBV HCC Y Y HCC3 Nam 49 HBV HCC N N HCC4 Nam 75 UN HCC N N HCC5 Nam 61 UN HCC N N HCC6 Nữ 49 HBV HCC N N HCC7 Nam 67 HCV HCC N Y HCC8 Nam 59 HBV HCC N N HCC9 Nam 62 UN HCC N N 10 HCC10 Nữ 51 UN HCC N N 11 HCC11 Nữ 63 Âm tính HCC N N 12 HCC12 Nam 55 HBV HCC N Y 13 HCC13 Nam 45 UN HCC UN N 14 HCC14 Nam 48 HBV HCC N N 15 HCC15 Nam 61 HBV HCC N N 16 HCC16 Nữ 38 HBV HCC Y N 17 HCC17 Nam 60 HCV HCC N N 18 HCC18 Nam 50 HBV HCC N N 19 HCC19 Nữ 64 HBV HCC N N 20 HCC20 Nam 77 UN HCC Y N 21 HCC21 Nam 63 UN HCC N N tính Chú thích: Y: có, N: khơng, UN: khơng có thơng tin Nhóm bệnh nhân U NBTK khảo sát bao gồm 14/20 (70%) nam 6/20 (30%) nữ Tỷ lệ mắc bệnh giới tính nam cao gần gấp 2,5 lần so với nữ Độ tuổi trung bình thời điểm chẩn đoán bệnh nhân tham gia nhiên cứu 58,8 tuổi, bệnh nhân lớn tuổi 77 tuổi 29 nhỏ tuổi 38 tuổi Trong 21 trường hợp ung thư gan, có 11 bệnh nhân lớn 60 tuổi, chiếm 55% bệnh nhân 60 tuổi, chiếm 45% Có bệnh nhân tái phát chiếm 20% có bệnh nhân có di mạch máu chiếm 15% Chuẩn hóa mồi cho phản ứng qPCR Để kiểm tra độ đặc hiệu mồi MET MTHFR Trước hết sử dụng mẫu DNA thu từ tế bào ung thư gan thương mại HEPG2 để chuẩn hóa mồi phương pháp PCR điện di sản phẩm PCR gel agarose 2% Kết mồi cho sản phẩm kích thước gen mục tiêu (Hình 3,4) Hình 3: Sản phẩm mồi MET M: thang DNA 1Kp plus, M1: thang DNA 1Kp, 1: sản phẩm mồi MET 58oC, 2: sản phẩm mồi MET 56oC, 3: giếng chứng âm (H2O) 30 Hình 4: Sản phẩm mồi MTHFR M: thang DNA 1Kp plus, 1: sản phẩm mồi MTHFR 57oC, 2: sản phẩm mồi MTHFR 57oC, 3: sản phẩm mồi MTHFR 55oC, 4:sản phẩm mồi MTHFR 53oC, 5: giếng chứng âm (H2O) Mồi MET cho sản phẩm sáng rõ 58oC, mồi MTHFR nhiệt độ khác khơng có khác rõ rệt nên chon nhiệt độ 55oC để tiến hành chạy Realtime PCR Kết chạy Realtime PCR cho thấy mồi MTHFR mồi MET cho sản phẩm chứng tỏ mồi sử dụng để tiến hành chạy mẫu bệnh nhân (Hình 5,6) 31 Hình 5: Đồ thị điểm nóng chảy cho mồi MTHFR 55oC Hình 6: Đồ thị điểm nóng chảy cho mồi MTHFR 58oC Sự khuếch đại gen MET Sau chạy Realtime PCR để kiểm tra khuếch đại MET, mẫu có thơng số 2-∆∆Ct > 1,5 xem có khuếch đại MET 32 Trong tổng số 20 mẫu bệnh nhân, có 14 mẫu khơng có khuếch đại MET chiếm 70%, có mẫu có khuếch đại MET chiếm 30% (Hình 7) Hình 7: Sự khuếch đại MET mẫu ung thư gan nghiên cứu 33 Hình 8: Tương quan khuếch đại MET với yếu tố lâm sàng Các yếu tố lâm sàng giới tính, độ tuổi,sự di mạch máu, tái phát có vai trò quan trọng tiên lương bệnh Kết cho thấy khơng có khác biệt khuếch đại MET nhóm bệnh nhân lớn 60 tuổi nhóm bệnh nhân nhỏ 60 tuổi Về giới tính, không thấy khác biệt khuếch đại MET nhóm nam nữ Khi so sánh nhóm bệnh nhân tái phát với nhóm bệnh nhân khơng tái phát khuếch đại MET khơng có khác biệt Nhưng nhóm bệnh nhân có tăng sinh mạch máu có khác biệt rõ rệt, nhóm bệnh nhân có tăng sinh mạch máu có khuếch đại MET cao hẳn so với nhóm khơng có di mạch máu (P 1,5 xem có khuếch đại MET 32 Trong tổng số 20 mẫu bệnh nhân, có 14 mẫu khơng có khuếch đại MET. .. chuẩn hóa thành cơng quy trình xác định khuếch đại gene MET bệnh nhân ung thư gan Trong tổng số 20 bệnh nhân nghiên cứu có 30% có bệnh nhân có sụ khuếch đại MET khối u Kết nghiên cứu cho thấy khuếch