Xây dựng quy trình khuếch đại đẳng nhiệt Recombinase polymerase amplification (RPA) phát hiện Leptospira spp. gây bệnh

Trong nghiên cứu này, nhóm tác giả đã xây dựng thành công quy trình khuếch đại đẳng nhiệt Reacombinase polymerase amplification (RPA) phát hiện chính xác một số loài Leptospira spp. gây bệnh chỉ với thời gian 30 phút. Quy trình RPA được xây dựng có ngưỡng phát hiện, độ nhạy và độ đặc hiệu tương đương với bộ kit thương mại hiện có trên thị trường.

Khoa học Y - Dược Xây dựng quy trình khuếch đại đẳng nhiệt Recombinase polymerase amplification (RPA) phát Leptospira spp gây bệnh Hồ Hữu Thọ1, 2*, Lê Thị Thúy1, Nguyễn Đình Ứng1, Hồ Anh Sơn1, Hồng Văn Lương1, Nguyễn Văn Chuyên3, Nguyễn Văn Ba2, Nguyễn Trọng Chính2 Viện Nghiên cứu Y dược học Quân sự, Học viện Quân y Bệnh viện Quân y 103, Học viện Quân y Khoa Vệ sinh quân đội, Học viện Quân y Ngày nhận 19/7/2019; ngày chuyển phản biện 22/7/2019; ngày nhận phản biện 19/8/2019; ngày chấp nhận đăng 28/8/2019 Tóm tắt: Leptospirosis, hay vàng da xoắn khuẩn bệnh truyền nhiễm phổ biến giới với tác nhân gây bệnh loài Leptospira spp gây bệnh thuộc chi Letospira Ở Việt Nam, leptospirosis xem bệnh đặc hữu có nguy bùng phát thành dịch cao không chẩn đoán điều trị kịp thời Ứng dụng kỹ thuật PCR hướng triển vọng phát Leptospira spp giai đoạn sớm bệnh Tuy nhiên, kỹ thuật phức tạp đòi hỏi khắt khe trình vận hành máy luân nhiệt, nên thay phương pháp khuếch đại đẳng nhiệt Trong nghiên cứu này, nhóm tác giả xây dựng thành cơng quy trình khuếch đại đẳng nhiệt Reacombinase polymerase amplification (RPA) phát xác số lồi Leptospira spp gây bệnh với thời gian 30 phút Quy trình RPA xây dựng có ngưỡng phát hiện, độ nhạy độ đặc hiệu tương đương với kit thương mại có thị trường Từ khóa: độ đặc hiệu, độ nhạy, khuếch đại đẳng nhiệt, Leptospira spp., Việt Nam Chỉ số phân loại: 3.5 Leptospirosis, hay bệnh vàng da xoắn khuẩn bệnh truyền nhiễm phổ biến giới với tác nhân gây bệnh loài Leptospira spp gây bệnh thuộc chi Letospira [1, 2] Ở Việt Nam, leptospirosis xem bệnh đặc hữu có nguy bùng phát thành dịch khơng chẩn đốn điều trị kịp thời [3] Vì biểu lâm sàng bệnh giống với nhiều bệnh nhiễm trùng khác rickettsia, dengue loại sốt xuất huyết virus khác [4], nên vùng dịch tễ bệnh leptospirosis thường không đánh giá mức Do khó khăn chẩn đốn bệnh leptospirosis nên việc giám sát bệnh cách thỏa đáng chưa thực Các công cụ để chẩn đốn sớm góp phần đưa cảnh báo dịch sớm cấp thiết cấy thường hàng tuần đến hàng tháng [6] Các phương pháp huyết học thường sử dụng chẩn đốn leptospirosis nhiều hạn chế, quy trình thực phức tạp tốn nhiều công sức; thời gian xác định ca bệnh muộn kháng thể phát giai đoạn muộn bệnh, dẫn đến điều trị kháng sinh hiệu [7] Ngược lại, hầu hết phương pháp phát sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử áp dụng giai đoạn sớm bệnh [8] Hiện nay, quy trình realtime PCR xây dựng phát Leptospira spp giai đoạn cấp tính sớm bệnh với độ nhạy, độ đặc hiệu cao [1, 9] Tuy nhiên, kỹ thuật phức tạp đòi hỏi khắt khe trình vận hành máy luân nhiệt, nên thay phương pháp khuếch đại đẳng nhiệt Các phương pháp phát Leptospira spp gồm nuôi cấy, huyết học phương pháp sinh học phân tử [5] Cấy máu giai đoạn sớm bệnh áp dụng cung cấp chứng việc bị nhiễm Leptospira spp [2], nhiên kết lại khơng có giá trị phục vụ điều trị cho bệnh nhân thời gian để ni Khuếch đại DNA đẳng nhiệt phương pháp thay cho kỹ thuật PCR phát triển để phục vụ chẩn đoán chỗ [10, 11] Vì đẳng nhiệt, phản ứng khuếch đại thực nhiệt độ không đổi khơng cần đến máy ln nhiệt đắt tiền Các kỹ thuật khuếch đại DNA đẳng nhiệt đơn giản, nhanh chóng hiệu Mở đầu Tác giả liên hệ: Email: daibi0109@gmail.com * 61(12) 12.2019 14 Khoa học Y - Dược Development of isothermal Recombinase polymerase amplification (RPA) process for detection of Leptospira spp causing diseases Huu Tho Ho1, 2*, Thi Thuy Le1, Dinh Ung Nguyen1, Anh Son Ho1, Van Luong Hoang1, Van Chuyen Nguyen3, Van Ba Nguyen2, Trong Chinh Nguyen2 Military Medical Research Institute, Military Academy Military Medical Hospital 103, Military Academy Department of Military Hygiene, Military Academy Received 19 July 2019; accepted 28 August 2019 Abstract: Leptospirosis is one of the common infectious diseases in the world with the pathogen as Leptospira spp belonging to Leptospira In Vietnam, leptospirosis is considered an endemic disease, and there is a high risk of outbreaks if not diagnosed and treated promptly Application of realtime PCR technique is promoting technique in the detection of Leptospira spp at the early stages of the disease However, this technique is too complex and demanding in the operation of the thermal cycler, so it is increasingly replaced by isothermal amplification methods In this study, the team successfully developed an isothermal amplification process using Reacombinase polymerase amplification (RPA) to accurately detect Leptospira spp causing the disease with the detection time of only 30 minutes The RPA process developed by the team not only has a limit of detection (LOD) equivalent to the commercially available kit (100 copies/ reaction) but also achieves similar sensitivity and specificity (100%) Keywords: isothermal amplification, Leptospira spp., sensitivity, specificity, Vietnam Classification number: 3.5 chi phí, với độ đặc hiệu độ nhạy tương đương với PCR [11] Trong kỹ thuật khuếch đại acid nucleic đẳng nhiệt, Recombinase polymerase amplification (RPA) cho thấy nhiều ưu điểm bật Sự khuếch đại phản ứng RPA thực nhờ vào kết hợp đặc hiệu enzyme protein (recombinase, SSB protein DNA polymerase thay sợi), giúp primer gắn đặc hiệu vào gen đích tổng hợp sợi Phản ứng RPA tiến hành khoảng nhiệt độ từ 24-45°C, so với kỹ thuật khuếch đại đẳng nhiệt khác điều kiện nhiệt độ RPA dễ dàng thiết lập đảm bảo [12] Thêm vào đó, hóa chất kỹ thuật cho phép phát tín hiệu realtime sau kết thúc phản ứng, nhờ ứng dụng phù hợp nhiều hồn cảnh khác nhau, phòng thí nghiệm chẩn đoán đại hay xét nghiệm thực địa Chính lý thực tiễn trên, nhóm nghiên cứu tiến hành xây dựng quy trình khuếch đại đẳng nhiệt RPA phát Leptospira spp gây bệnh Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu quy trình RPA xây dựng mẫu dương tính giả định với serovar Leptospira spp gây bệnh phổ biến; mẫu âm tính với Leptospira spp., chủng Leptospira biflexa serovar Patoc không gây bệnh chủng vi sinh vật thường gặp chẩn đoán phân biệt; đồng thời so sánh thông số với kit thương mại có thị trường (Primerdesign) Vật liệu phương pháp nghiên cứu Vật liệu Chủng chuẩn Leptospira spp Viện Y học Dự phòng Quân đội cung cấp: serovar Leptospira spp gây bệnh gồm Leptospira interrogan serovar Pomona, Leptospira interrogan serovar Australis chủng Leptospira biflexa serovar Patoc khơng gây bệnh Các mẫu bệnh phẩm dương tính giả định gồm 10 mẫu dương tính giả định Leptospira interrogan serovar Pomona 10 mẫu dương tính giả định Leptospira interrogan serovar Australis nồng độ cao, trung bình thấp khác nhóm nghiên cứu chuẩn bị: 8x108, 5x108, 5x107, 8x105, 5x105, 8x104, 5x104, 5x103, 8x102, 5x102 copy/p.ư (tp1-tp10) Các mẫu âm tính với Leptospira spp gây bệnh (10 mẫu) thu thập Phòng Cơng nghệ gen di truyền tế bào, Viện Nghiên cứu Y dược học Quân sự, Học viện Quân y Các chủng vi sinh vật thường gặp chẩn đoán phân biệt gồm Dengue virus, Hepatitis b virus (HBV), Orientia tsutsugamushi, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, Proteus mirabiles, Enterobacter aerogenes, Klebsiella pneumoniae, E coli Khoa Vi sinh, Học viện Quân y cung cấp 61(12) 12.2019 15 Khoa học Y - Dược Bộ kit Leptospirosis outer membrane protein lipl32 gene (Primerdesign) có độ đặc hiệu 100% với loạt trình tự gen chủng Leptospia spp gây bệnh Trong điều kiện PCR tối ưu, kit chẩn đốn leptospirosis có hiệu suất bắt cặp cao (>95%) phát 100 gen đích Bảng Trình tự primer/probe phản ứng RPA phát Leptospira spp gây bệnh Các hóa chất, sinh phẩm thiết bị dùng tách chiết DNA phản ứng RPA Phương pháp nghiên cứu Tách chiết DNA: DNA tách chiết kit QiAmp DNA Mini Kit (QIAGEN) theo quy trình nhà sản xuất (Spin Protocol) Thiết kế primer, probe cho phản ứng RPA: trình tự gen lipL32 gen mã hóa cho lipoprotein màng ngồi lipL32, dường yếu tố độc lực quan trọng giúp xác định chủng gây bệnh tất loài Leptospira spp lựa chọn gen đích đặc hiệu thiết kế primer, probe cho phản ứng RPA phát Leptospira spp gây bệnh Các trình tự mồi thiết kế phần mềm PrimedRPA Trình tự gen đích Leptospira spp lấy từ sở liệu trình tự GenBank (số truy cập trình tự JN683900.1) Primer/probe Trình tự (5’-3’) Forward primer AAAACTTTTAGTAAGAGGTCTTTACAGAAT Reverse primer AGACCAACAGATGCAACGAAAGATCCTTTCAC Probe AAAACTTTTAGTAAGAGGTCTTTACAGAAT-(FAM-dT) -T-(THF)-T-(BHQ1-dT)-TCACTACCTA-blocker Tối ưu nhiệt độ phản ứng RPA Dải nhiệt độ phản ứng từ 37-420C khảo sát để chọn nhiệt độ phản ứng RPA tối ưu Kết hình cho thấy nhiệt độ phản ứng tối ưu 380C với thời gian phát sản phẩm khuếch đại sớm (8 phút) Phản ứng RPA: tổng thể tích phản ứng sử dụng 20 µl gồm thành phần có nồng độ đề xuất nhà sản xuất (TwistAmp exo), nồng độ primer, probe tối ưu 0,42 µM 0,06 µM với thể tích template µl Phản ứng thực 38℃ 30 phút thiết bị Genie®II Phản ứng realtime PCR: phản ứng realtime PCR (Primerdesign) thực với µl PrecisionPLUS 2X qPCR Master Mix, 0,5 µl Leptospirosis primer/probe mix, µl template 2,5 µl nước Phản ứng thực thiết bị Rotor-GeneQ với chu trình nhiệt gồm bước: biến tính ban đầu 95℃ phút, sau 50 chu kỳ gồm bước (biến tính 95℃ 10s thu nhận tín hiệu 60℃ 60s qua kênh FAM) Phản ứng đối chứng dương sử dụng DNA chứng dương kit cung cấp, đối chứng âm nước Kết Trình tự primer, probe đặc hiệu gen đích lipL32 Căn báo cáo tính đa hình gen Leptospira spp lưu hành giới Việt Nam, nhóm nghiên cứu lựa chọn gen đích lipL32 làm khn để thiết kế công cụ primer/probe dùng cho kỹ thuật RPA Bộ primer/probe đánh giá khả bắt cặp đặc hiệu thông số cần thiết công cụ BLAST, kết cho thấy bắt cặp tốt Kết thực phản ứng RPA với cặp primer/probe thiết kế cho thấy cường độ tín hiệu huỳnh quang thời gian thu nhận tín hiệu tốt (bảng 1) 61(12) 12.2019 Hình Tối ưu nhiệt độ phản ứng RPA khuếch đại DNA Leptospira spp Các phản ứng chứng dương lượng khuôn DNA; phản ứng chứng âm khơng có khn DNA với nồng độ primer 0,42 µM, nồng độ probe 0,12 µM Tối ưu thành phần phản ứng RPA phát Leptospira spp gây bệnh Các thành phần phản ứng bao gồm nồng độ mồi, nồng độ probe nồng độ Magnesium-Acetate (MgOAc) tiến hành tối ưu để cải thiện hiệu suất khuếch đại phản ứng Dải nồng độ mồi 0,24 µM, 0,36 µM, 0,42 µM 0,54 µM; dải nồng độ probe 0,06 µM, 0,09 µM, 0,12 µM dải nồng độ MgOAc từ 12-20 mM khảo sát Kết tối ưu tổng hợp bảng cho thấy, nồng độ mồi tối ưu 0,42 µM, nồng độ probe tối ưu 0,09 µM nồng độ MgOAc tối ưu 14 mM 16 Khoa học Y - Dược Bảng Thành phần phản ứng RPA khuếch đại DNA Leptospira spp tối ưu (thể tích phản ứng 20 µl) STT Thành phần Nồng độ Thể tích Reaction Buffer 1x 10 µl dNTPs 1,8 mM 1,44 µl H2O   0,36 µl Probe E-mix 1x µl Primer 872 0,42 µM 0,84 µl Primer 432 0,42 µM 0,84 µl Probe 174p 0,06 µM 0,12 µl Core Reaction Mix 1x µl Exo 1x 0,4 µl 10 Template   µl 11 MgOAc 14 mM µl Ngưỡng phát tương đương với quy trình realtime PCR (Primerdesign) Panel dải nồng độ plasmid tái tổ hợp Leptospira interrogan serovar Australis nồng độ 102-104 copy/p.ư sử dụng để đánh giá ngưỡng phát quy trình RPA xây dựng quy trình realtime PCR kit Leptospirosis outer membrane protein lipl32 gene (Primerdesign), nồng độ lặp lại lần Kết cho thấy, quy trình RPA có khả phát 6/6 lần lặp lại nồng độ 100 copy/p.ư, tương đương với quy trình realtime PCR (Primerdesign) Hình 2, kết đánh giá ngưỡng phát quy trình RPA phát Leptospira interrogan serovar Australis, kết đánh giá ngưỡng phát quy trình realtime PCR (Primerdesign) Hình Đánh giá ngưỡng phát quy trình realtime PCR (Primerdesign) phát Leptospira interrogan serovar Australis So sánh thời gian phát tương ứng nồng độ quy trình (bảng 3) cho thấy, quy trình RPA khơng có khả phát mẫu DNA Leptospira interrogan serovar Australis tương đương với quy trình realtime PCR mà cho phép phân tích kết nhanh nhiều (23,17 phút) điều kiện đẳng nhiệt (380C) Bảng So sánh thời gian phát tương ứng nồng độ quy trình phát Leptospira interrogan serovar Australis Nồng độ (copy/p.ư) Thời gian khuếch đại trung bình Realtime PCR (chu kỳ ≈ phút *) RPA (phút) 10 21,50 ≈ 28,47 14,67 10 25,24 ≈ 33,09 18,17 102 29,80 ≈ 38,72 23,17 Chú thích: (*) với n số chu kỳ, thời gian (phút) phát sản phẩm khuếch đại quy trình realtime PCR quy đổi ≈ thời gian biến tính ban đầu phút + n x (70s chu kỳ + 1,75s thời gian giảm nhiệt (200C/s) + (n-2) x 7/3s thời gian gia nhiệt (150C/s)/60 Độ nhạy mẫu dương tính giả định với serovar khác cho kết tương đương với kit thương mại Hình Kết đánh giá ngưỡng phát quy trình RPA phát Leptospira interrogan serovar Australis (A) - nồng độ 104 copy/p.ư; (B) - nồng độ 103 copy/p.ư; (C) - nồng độ 102 copy/p.ư; (D) - đối chứng âm/đối chứng dương 61(12) 12.2019 Đánh giá mẫu dương tính giả định nồng độ khác serovar Leptospira spp gây bệnh Leptospira interrogan serovar Pomona (Pomona tp1-tp10), Leptospira interrogan serovar Australis (Australis tp1-tp10) cho thấy, quy trình RPA có khả phát 20/20 mẫu bệnh phẩm dương tính giả định, tương đương với độ nhạy 100% Độ nhạy tương đương với quy trình realtime PCR kit thương mại hành (Primerdesign) Hình kết đánh giá độ nhạy quy trình RPA số mẫu dương tính giả định với Leptospira interrogan serovar Pomona 17 Khoa học Y - Dược Hình Kết đánh giá độ nhạy quy trình RPA số mẫu dương tính giả định với Leptospira interrogan serovar Pomona Độ đặc hiệu tương đương với kit thương mại có thị trường Độ đặc hiệu quy trình RPA đánh giá DNA mẫu âm tính với Leptospira spp chủng vi sinh vật thường gặp chẩn đoán phân biệt, đặc biệt có chủng Leptospira biflexa serovar Patoc khơng gây bệnh (đã mô tả trên) Kết đánh giá độ đặc hiệu quy trình RPA xây dựng so sánh với kit thương mại Leptospirosis outer membrane protein lipl32 gene kit qua chuỗi phản ứng realtime PCR tương ứng Kết trình bày bảng hình Quy trình RPA xây dựng không phát mẫu 10 mẫu âm tính với Leptospira spp 10 mẫu DNA chủng vi sinh vật khác thường gặp chẩn đoán phân biệt, tương đương với độ đặc hiệu 100% Quy trình realtime PCR (Primerdesign) cho kết đánh giá độ đặc hiệu tương đương (bảng 4) Bảng So sánh độ đặc hiệu quy trình Độ đặc hiệu (%) Mẫu đánh giá Realtime PCR RPA Đánh giá mẫu bệnh phẩm âm tính với Leptospira spp 100 100 Đánh giá chủng Leptospira khơng gây bệnh vi sinh vật gây triệu chứng tương tự 100 100 61(12) 12.2019 Hình Kết đánh giá độ đặc hiệu quy trình phát Leptospira spp gây bệnh Quy trình RPA (A) quy trình realtime PCR (Primerdesign) (B) chủng Leptospira không gây bệnh chủng vi sinh vật khác thường gặp chẩn đoán phân biệt leptospirosis Bàn luận Tác nhân gây bệnh leptospirosis xác định lần nước ta vào năm 1930 Việt Nam xem khu vực đặc hữu bệnh với đỉnh điểm diễn vào mùa mưa [13] Tuy chưa có số liệu thức cho thấy dịch bệnh bùng phát Việt Nam nghiên cứu gần cho thấy mức độ lưu hành cao Leptospira spp nguy tiềm tàng nhiễm trùng leptosirosis [14, 15] Do vậy, xây dựng phương pháp phát nhanh xác tác nhân gây bệnh leptospirosis hỗ trợ cho cơng tác chẩn đốn, giám sát cảnh báo dịch bệnh, đặc biệt quốc gia phát triển cho vùng đặc hữu bệnh Việt Nam Trong nghiên cứu này, quy trình khuếch đại đẳng nhiệt RPA lần Việt Nam phát Leptospira spp gây bệnh nghiên cứu xây dựng thành công Quy trình phản ứng thực điều kiện đẳng nhiệt 38℃, thiết bị Genie® II vòng 30 phút mà khơng cần sử dụng đến thiết bị luân nhiệt tinh vi với giá thành cao PCR Thiết bị sử dụng Genie® II với thiết kế nhỏ gọn, nhẹ dễ dàng mang đi, phù hợp để thực phương pháp khuếch đại đẳng nhiệt phát sản phẩm khuếch đại qua thu nhận tín hiệu huỳnh quang Thiết bị yêu cầu lượng thấp sử dụng pin Lithium-polymer sạc lại giữ cho máy hoạt động ngày nên dễ dàng mang Nếu quy trình realtime PCR cần để phân tích kết quy trình 18 Khoa học Y - Dược RPA cần 30 phút để đưa kết xác cho mẫu cần phân tích, rút ngắn đáng kể thời gian phát tác nhân gây bệnh Ngưỡng phát quy trình RPA đạt 100 copy/p.ư, ngưỡng phát tương đương với quy trình realtime PCR kit Leptospirosis outer membrane protein lipl32 gene hãng Primerdesign với thời gian phát nhanh nhiều (bảng 3) Ngoài ra, ngưỡng phát xét nghiệm RPA biết đến không bị giới hạn, nhiều nghiên cứu chứng minh khả phát sản phẩm khuếch đại công nghệ RPA từ phân tử DNA [16] Độ nhạy quy trình RPA đánh giá mẫu dương tính giả định với nồng độ khác serovar gây bệnh phổ biến Việt Nam Leptospira interrogan serovar Australis Leptospira interrogan serovar Pomona [17] Kết cho thấy, 20/20 mẫu dương tính giả định với serovar gây bệnh phát 30 phút phản ứng, tương đương với độ nhạy 100% Bên cạnh đó, quy trình RPA thiết lập lập cho thấy độ đặc hiệu cao (100%), tương đương với kit thương mại Primerdesign đánh giá chủng Leptospira không gây bệnh, mẫu bệnh phẩm âm tính chủng vi sinh vật gây số triệu chứng tương tự Kết đánh giá độ đặc hiệu quy trình RPA mong đợi, với việc sử dụng probe làm tăng tính đặc hiệu phản ứng Việc lựa chọn gen đích lipl32 có mặt chủng Leptospira spp gây bệnh góp phần làm tăng tính đặc hiệu quy trình RPA Như vậy, quy trình RPA xây dựng khơng có ngưỡng phát tương đương mà đạt độ nhạy, độ đặc hiệu tương đương với kit thương mại có thị trường, cho thấy khả ứng dụng lâm sàng phát Leptospira spp gây bệnh Mặc dù quy trình RPA tối ưu nghiên cứu mức phát định tính mà chưa phải định lượng, với ngưỡng phát đạt tốt độ nhạy, độ đặc hiệu cao gợi ý sử dụng quy trình điều kiện thực tế mà không cần trải qua công đoạn làm giàu mẫu bệnh phẩm nhằm tăng độ nhạy kỹ thuật khuếch đại gen dựa phản ứng luân nhiệt sử dụng Với thời gian phát nhanh thông số kỹ thuật tương đương với kit hành, quy trình đẳng nhiệt thiết lập hứa hẹn cơng cụ chẩn đốn hữu hiệu có khả ứng dụng phòng thí nghiệm trang bị đại, phòng thí nghiệm di động khu vực có điều kiện hạn chế trang thiết bị sở hạ tầng, giúp chẩn đoán tác nhân gây bệnh leptospirosis Kết luận Nghiên cứu thiết lập thành cơng quy trình đẳng nhiệt RPA Việt Nam, cho phép phát nhanh xác Leptospira gây bệnh với ngưỡng phát hiện, độ nhạy, độ đặc hiệu tương đương với kit thương mại có thị trường 61(12) 12.2019 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] R.A Stoddard (2013), “Detection of pathogenic Leptospira spp through real-time PCR (qPCR) targeting the lipL32 gene”, Methods Mol Biol., 943, pp.257-266 [2] D.A Haake and P.N Levett (2015), “Leptospirosis in humans”, Curr top Microbiol Immunol., 387, pp.65-97 [3] H.S Lee, et al (2017), “Sero-prevalence of specific Leptospira serovars in fattening pigs from provinces in Vietnam”, BMC Vet Res., 13(1), p.125 [4] P.N Levett (2001), “Leptospirosis”, Clin Microbiol Rev., 14(2), pp.296-326 [5] S.V Budihal and K Perwez (2014), “Leptospirosis diagnosis: competancy of various laboratory tests”, J Clin Diagn Res., 8(1), pp.199-202 [6] M.F Palmer and W.J Zochowski (2000), “Survival of leptospires in commercial blood culture systems revisited”, J Clin Pathol., 53(9), pp.713-714 [7] D Musso and B La Scola (2013), “Laboratory diagnosis of leptospirosis: a challenge”, J Microbiol Immunol Infect., 46(4), pp.245-252 [8] Ahmed Ahmed, Paul R Klatser1, and Rudy A Hartskeer (2012), “Molecular approaches in the detection and characterization of leptospira”, Journal of Bacteriology and Parasitology, DOI:10.4172/2155-9597.1000e102 [9] L.M Esteves, et al (2018), “Diagnosis of human leptospirosis in a clinical setting: Real-time PCR high Rresolution melting analysis for detection of leptospira at the onset of disease”, Sci Rep., 8(1), p.9213 [10] J Kim and C.J Easley (2011), “Isothermal DNA amplification in bioanalysis: strategies and applications”, Bioanalysis, 3(2), pp.227239 [11] P Craw and W Balachandran (2012), “Isothermal nucleic acid amplification technologies for point-of-care diagnostics: a critical review”, Lab on a Chip, 12(14), pp.2469-2486 [12] I.M Lobato and C.K O’Sullivan (2018), “Recombinase polymerase amplification: Basics, applications and recent advances”, Trac Trends in Analytical Chemistry, 98, pp.19-35 [13] K.T Thai, et al (2006), “Seroepidemiology of leptospirosis in southern Vietnamese children”, Trop Med Int Health, 11(5), pp.738-745 [14] C.T Van, et al (1998), “Human leptospirosis in the Mekong delta, Vietnam”, Trans R Soc Trop Med Hyg., 92(6), pp.625-628 [15] G Pappas, et al (2008), “The globalization of leptospirosis: worldwide incidence trends”, Int J Infect Dis., 12(4), pp.351-357 [16] I.M.K O’Sullivan (2018), “Recombinase polymerase amplification: Basics, applications and recent advances”, Science Direct [17] Bộ Y tế (2017), Bệnh xoắn khuẩn vàng da, Cục Y tế Dự phòng 19 ... Trong nghiên cứu này, quy trình khuếch đại đẳng nhiệt RPA lần Việt Nam phát Leptospira spp gây bệnh nghiên cứu xây dựng thành công Quy trình phản ứng thực điều kiện đẳng nhiệt 38℃, thiết bị Genie®... đoán đại hay xét nghiệm thực địa Chính lý thực tiễn trên, nhóm nghiên cứu tiến hành xây dựng quy trình khuếch đại đẳng nhiệt RPA phát Leptospira spp gây bệnh Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu quy trình. .. với Leptospira spp 100 100 Đánh giá chủng Leptospira khơng gây bệnh vi sinh vật gây triệu chứng tương tự 100 100 61(12) 12.2019 Hình Kết đánh giá độ đặc hiệu quy trình phát Leptospira spp gây bệnh