Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (Porcine reproductive and respiratory syndrome - PRRS) gây ra bởi vi rút PRRS (PRRS virus - PRRSV) là một trong những bệnh phức tạp và nguy hiểm nhất ở lợn với tỉ lệ tử vong cao. Tại Việt Nam, các đợt bùng phát PRRS xảy ra hàng năm ở nhiều tỉnh thành gây thiệt hại về kinh tế cho người chăn nuôi và rủi ro về sức khỏe người tiêu dùng. Cùng tham khảo bài viết sau đây đề tìm hiểu về việc xây dựng quy trình khuếch đại vòng xoắn đẳng nhiệt phát hiện nhanh vi rút gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn nhé các bạn!
Tạp chí Khoa học & Cơng nghệ Số 15 25 Xây dựng quy trình khuếch đại vịng xoắn đẳng nhiệt phát nhanh vi rút gây hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn Trần Hồng Diễm*, Trần Thị Hậu, Phạm Nguyễn Minh Trang, Phùng Thị Thu Hường Viện Kĩ thuật Công nghệ cao, Đại học Nguyễn Tất Thành *thdiem@ntt.edu.vn Tóm tắt Hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn (Porcine reproductive and respiratory syndrome - PRRS) gây vi rút PRRS (PRRS virus - PRRSV) bệnh phức tạp nguy hiểm lợn với tỉ lệ tử vong cao Tại Việt Nam, đợt bùng phát PRRS xảy hàng năm nhiều tỉnh thành gây thiệt hại kinh tế cho người chăn nuôi rủi ro sức khỏe người tiêu dùng Hiện nay, RT-PCR (Realtime Polymerase Chain Reaction) phương pháp vàng chẩn đoán PRRS, với phương pháp sinh học phân tử khác quan tâm nghiên cứu Trong báo này, nhóm tác giả nghiên cứu phát triển phương pháp khuếch đại vòng xoắn (Polymerase spiral reaction - PSR) đẳng nhiệt Nhờ tối ưu quy trình PSR đạt kết phát PRRSV nhanh xác điều kiện đẳng nhiệt (khơng cần thiết bị luân nhiệt đắt tiền) với giới hạn phát 100.5 TCID50/mL, phản ứng thực nhiệt độ cố định (65 0C) thời gian 40 phút đọc kết chỗ mắt thường qua màu phản ứng ® 2021 Journal of Science and Technology - NTTU Đặt vấn đề Hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn (PRRS) gây Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) loại Arterivirus, họ Arteriviridae [1] Vi rút phát triển, tăng nhanh làm suy giảm nghiêm trọng sức đề kháng lợn bệnh, từ tạo điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn vi rút khác xâm nhập gây triệu chứng nặng cho lợn [1, 2] PRRS phát thơng qua triệu chứng lâm sàng quan sát trực tiếp, nhiên, biểu bệnh thường dễ nhầm lẫn với bệnh nguyên nhân khác xảy lợn [3] Do đó, cần kết hợp phương pháp khác chẩn đoán bệnh phát kháng thể phương pháp ELISA (Enzyme linked immonosorbent assay) [3], phương pháp IPMA (Immunoperoxidase monolayer assay) [3], phương pháp khuếch đại axit nucleic (RTPCR) [3] Hiện RT-PCR coi tiêu Nhận 19.10.2021 Được duyệt 05.11.2021 Công bố 10.11.2021 Từ khóa RT-PSR, PRRSV, isothermal chuẩn vàng việc chẩn đốn có mặt PRRSV RT-PCR cho kết với độ nhạy độ đặc hiệu cao, nhiên, phương pháp địi hỏi máy móc đắt tiền phịng thí nghiệm đạt tiêu chuẩn xét nghiệm an toàn sinh học, kĩ thuật viên có kinh nghiệm sinh học phân tử [4, 5] Chính vậy, song song với việc phát triển kit xét nghiệm RT-PCR để tăng hiệu định lượng vi rút phịng thí nghiệm trung tâm việc phát triển phương pháp sàng lọc có khả xét nghiệm nhanh vi rút với yêu cầu tối thiểu trang thiết bị đào tạo nhân chuyên môn thực địa tuyến sở cần thiết để bổ sung cho máy y tế dự phịng Trong đó, phương pháp khuếch đại đẳng nhiệt vòng xoắn Polymerase spiral reaction (PSR) giới thiệu vào năm 2015 thừa hưởng tất ưu điểm PCR độ nhạy độ đặc hiệu [6] PSR phương Đại học Nguyễn Tất Thành Tạp chí Khoa học & Cơng nghệ Số 15 26 pháp đẳng nhiệt phát triển thời gian gần với nhiều ưu điểm để phát triển quy trình phát nhanh, chỗ [7] Phương pháp cần hoạt động cặp mồi thiết kế đặc biệt với khả tạo vòng xoắn khuếch đại DNA mục tiêu qua chu kì hoạt động enzyme Bst polymerase [6], phản ứng xảy nhiệt độ cố định kết quan sát trực tiếp qua việc quan sát thay đổi màu sản phẩm sau phản ứng có diện chất thị màu Với với kết hợp enzyme phiên mã ngược Bst polymerase, PSR có khả phát dược RNA mục tiêu phản ứng [7] Vì thế, nghiên cứu này, phương pháp PSR tối ưu để phát xác trình tự RNA mục tiêu PRRSV, kết ghi nhận trực tiếp thông qua màu sắc phản ứng với quy trình thực đơn giản, khơng u cầu thiết bị phức tạp Kết chứng minh PSR trở thành phương pháp hữu ích cho chẩn đốn lâm sàng Vật liệu phương pháp Thiết kế mồi PSR đặc hiệu cho PRRSV Dựa theo nghiên cứu trước đó, gen M lựa chọn làm gen mục tiêu phát tính ổn định độ bảo tồn cao trình tự gen PRRSV [8, 9] Trình tự mồi PSR thiết kế đặc trưng cho PRRSV thiết kế phần mềm PrimerExplorerV5 dựa trình tự gen PRRSV có số hiệu JX512910, trình tự mồi kiểm tra PCR insilico phần mềm Geneious Prime trình tự tổng hợp Cơng ty Sinh Hóa Phù Sa (Việt Nam) sử dụng làm mồi cho tất thí nghiệm nghiên cứu Trình tự gen có vị trí từ 14510 đến 14805 gen PRRSV No JX512910.2 tổng hợp Công ty Sinh Hóa Phù Sa dùng làm trình tự mục tiêu cho bước đánh giá điều kiện ban đầu, đồng thời làm chứng dương cho khảo sát Trình tự mục tiêu dạng tổng hợp mồi thể Bảng Bảng Các trình tự sử dụng nghiên cứu Tên PRRS_PSR_F PRRS_PSR_R Trình tự 5’-3’ ACGATTCGTACATAGAAGTATAG-AGAAAAACCCGGAGAAGCCC GATATGAAGATACATGCTTAGCA-ATCTGACAGGGCACAAGTTCC GGAGCAGTAGTTGCACTTCTTTGGGGAGTGTACTCAGCCATAGAA ACCTGGAAATTCATCACCTCCAGATGCCGTTTGTGCTTGCTAGGC CGCAAGTACATCCTGGCCCCTGCCCACCACGTCGAAAGTGCCGC M_gblock GGGCTTTCATCCGATTGCGGCAAATGATAACCACGCATTTGTCGT CCGGCGTCCCGGCTCCACTACGGTCAACGGCACATTGGTGCCCGG GTTGAAAAGCCTCGTGTTGGGTGGCAGAAAAGCTGTTAAGCAGG GAGTGGTAAACCTTGTTAAATATGCCAA Tách chiết RNA vi rút (NEB, UK) nước sinh học phân tử Các phản ứng Mẫu RNA vi rút cung cấp Học viện PSR ban đầu thực 65 0C thời gian Nông nghiệp Việt Nam tách chiết kit 45 phút tách chiết RNA - QIAamp Viral RNA Mini Kit Kết phản ứng ghi nhận thông qua màu (Qiagen, USA) định lượng phương pháp sắc phản ứng phương pháp nhuộm huỳnh nuôi cấy vi rút kết hợp phương pháp RT-qPCR Mẫu quang Theo đó, phản ứng dương thể màu sắc RNA tách chiết sau kiểm tra nồng độ độ tinh phản ứng thay đổi từ màu hồng ban đầu sang màu lưu trữ -80 0C để sử dụng cho phản ứng PSR vàng, màu sắc không thay đổi (màu hồng) Phương pháp PSR phản ứng âm Mặt khác, μL SYBR Green I dye Tất phản ứng PSR thực nghiên cứu (Thermo Fisher Scientific, USA) nồng độ 100X thực với thể tích cuối 15 μL cho vào ống sản phẩm quan sát phát quang Hỗn hợp phản ứng gồm μL mẫu, hỗn hợp mồi (1,6 ánh sáng 460 nm µM mồi PRRS-PSR-F, 1,6 µM PRRS-PSR-R), 7,5 μL Khảo sát điều kiện phản ứng WarmStart® Colorimetric LAMP 2X Master Mix Đại học Nguyễn Tất Thành Tạp chí Khoa học & Cơng nghệ Số 15 Thời gian tối ưu phản ứng khảo sát khoảng (5 – 50) phút phản ứng, mốc cách phút Phản ứng đặt nhiệt độ 65 0C, xác định kết thông qua màu sắc phản ứng nhuộm SYBR Nhiệt độ tối ưu phản ứng PSR khảo sát khoảng nhiệt độ từ (56 - 67) 0C, mốc nhiệt độ cách 0C Phản ứng ủ với thời gian tối ưu trước đó, kết quan sát màu sắc phản ứng nhuộm SYBR Khảo sát giới hạn phát phản ứng Số DNA mạch khn tính tốn chương trình Endmem http://endmemo.com/bio/dnacopynum.php; 109 trình tự gen M đích PRRSV dạng tổng hợp, pha loãng theo bậc 10 nồng độ cuối 10 – 10-2 tiến hành thực phản ứng với điều kiện thành phần theo nghiên cứu trước Sản phẩm phân tích màu sắc sau phản ứng nhuộm SYBR Mẫu RNA tách chiết từ mẫu virus ni cấy có nồng độ 105.5 TCID50/mL pha loãng nồng độ cuối 10 4.5, 103.5, 102.5, 101.5, 100.5 100 TCID50/mL tiến hành thực phản ứng với điều kiện tối ưu Sản phẩm phân tích màu sắc sau phản ứng nhuộm SYBR Khảo sát tính đặc hiệu phản ứng PSR Trong khảo sát này, RNA vi rút gây bệnh phổ biến lợn với triệu chứng gây bệnh có nhiều điểm tương đồng với PRRS (CSFV, PEDV, ASFV) vi khuẩn thông thường phổ biến ngồi mơi trường sử dụng để thực phản ứng PSR S enterica, S 27 aureus, P aeruginosa, L monocytogenes với thành phần điều kiện khảo sát Kết Thiết lập phản ứng PSR Các phản ứng PSR ban đầu thực nhằm kiểm tra hoạt động mồi thành phần phản ứng Phản ứng thực 2X warmstart LAMP colorimetric mastermix diện phenolred – chất thị màu cho phản ứng Phản ứng đặt nhiệt độ 65 0C thời gian 45 phút, kết cho thấy, màu sắc phản ứng thay đổi từ màu hồng ban đầu sang vàng mẫu dương chứa trình tự mục tiêu dạng tổng hợp giữ nguyên màu sắc ban đầu mẫu âm (Hình 1A) Mặt khác kết PSR với RNA tinh PRRSV Hình 1B cho thấy, PSR có khả khuếch đại RNA mục tiêu, thể màu sắc sau phản ứng rõ nét Kết phản ứng đồng thời ghi nhận phương pháp nhuộm SYBR, theo chứng dương phát quang ánh sáng có bước sóng 460 nm chứng âm khơng thể tính hiệu phát quang Các kết cho thấy, mồi thiết kế có khả khuếch đại thành cơng trình tự mục tiêu PRRSV tổng hợp RNA gen tách chiết, kết quan sát trực tiếp mắt thường qua màu sắc phản ứng có kết tương đồng với phương pháp nhuộm huỳnh quang Vì vậy, mồi chọn với thành phần phản ứng áp dụng cho khảo sát Hình Phản ứng PSR kiểm tra thành phần phản ứng Phản ứng ủ 65 0C 45 phút, kết thể qua màu sắc soi SYBR Trong đó: A Phản ứng với trình tự mục tiêu dạng tổng hợp B Phản ứng với RNA gen PRRSV Đại học Nguyễn Tất Thành Tạp chí Khoa học & Công nghệ Số 15 28 Tối ưu nhiệt độ thời gian cho phản ứng PSR Hình Kết khảo sát thời gian phản ứng Phản ứng ủ nhiệt độ 65 0C mốc thời gian từ (5 – 50) phút Kết thể màu tín hiệu phát quang Thời gian kéo dài phản ứng PSR định tới số lượng sản phẩm hình thành phản ứng Trong khảo sát này, phản ứng PSR thực khoảng thời gian (5 – 50) phút phản ứng Tại Hình 2, kết soi SYBR cho thấy, 25 phút thời gian tối thiểu để phản ứng xảy quan sát huỳnh quang Bên cạnh đó, với thời gian phản ứng (40 – 50) phút, phản ứng thể thay đổi màu sắc rõ quan sát mắt thường Qua kết khảo sát, 40 phút thời gian tối thiểu để phản ứng PSR cho kết màu kết SYBR rõ Vì thời gian 40 phút thời gian tối ưu lựa chọn áp dụng cho khảo sát tối ưu phản ứng PSR vào khoảng (60 – 65) ⁰C), nhiệt độ 65 ⁰C nhiệt độ tối ưu cho phản ứng nghiên cứu này, đồng thời nhiệt độ sử dụng cho thí nghiệm Giới hạn phát phương pháp PSR DNA tổng hợp ban đầu có nồng độ 109 pha lỗng theo nồng độ khoảng (107 - 101 ) thực phản ứng PSR với điều kiện tối ưu trước Kết Hình 4A cho thấy, phản ứng PSR phát DNA tổng hợp có phản ứng, kết thể âm tính phản ứng có số lượng DNA mục tiêu bé Đồng thời, mẫu RNA gen tách chiết từ mẫu vi rút nuôi cấy, 105.5 TCID50/mL pha loãng nồng độ cuối 104.5 – 100 TCID50/mL tiến hành thực phản ứng PSR Kết Hình 4B cho thấy, phản ứng PSR tối ưu có khả phát 100.5 TCID50/mL, kết có giá trị ngang với giới hạn phát số kit RT-qPCR chẩn đốn PRRSV có thị trường Điều thể khả phát tối ưu PSR mẫu có nồng độ vi rút thấp thời gian ủ bệnh A B Hình Kết khảo sát nhiệt độ phản ứng Phản ứng ủ thời gian 40 phút với nhiệt độ khác khoảng (56 – 67) 0C Kết ghi nhận màu sắc nhuộm SYBR Nhiệt độ phản ứng khảo sát khoảng (56 – 67) 0C Kết Hình cho thấy, sản phẩm PSR quan sát SYBR nhiệt độ 61 ⁰C, nhiên phải từ nhiệt độ (64 – 67) ⁰C, thay đổi màu sắc phản ứng thể thay đổi rõ nét Cùng với dẫn nhà sản xuất nghiên cứu trước (nhiệt độ Đại học Nguyễn Tất Thành Hình Giới hạn phát phản ứng PSR Phản ứng nhiệt độ 65 0C thời gian 40 phút A Kết với trình tự mục tiêu dạng tổng hợp, B Kết với trình tự mục tiêu RNA tách chiết từ vi rút ni cấy Tính đặc hiệu mồi thiết kế PRRSV Tính đặc hiệu mồi cho PRRSV đánh giá việc thực phản ứng PSR với chủng vi Tạp chí Khoa học & Cơng nghệ Số 15 rút gây bệnh lợn với triệu chứng tương đồng với PRRS bao gồm CSFV, ASFV, PEDV số vi khuẩn phổ biến chuồng trại bao gồm vi khuẩn S enterica, S aureus, P aeruginosa, L monocytogenes V parahaemolyticus Kết khảo sát cho thấy phương pháp PSR tối ưu nghiên cứu phân biệt trình tự gen mục tiêu PRRSV so với vi khuẩn gần gũi, PSR khuếch đại RNA mục tiêu PRRSV có phản ứng (Hình 5) Kết cho thấy, mồi lựa chọn thực phương pháp PSR tối ưu có tính chuyên biệt cao cho PRRSV 29 huyết bệnh phẩm, kiểm tra xác nhận phương pháp RT-qPCR RNA dùng để làm mạch khuôn cho phương pháp PSR Kết cho thấy, phương pháp PSR tối ưu nghiên cứu có khả phát RNA gen PRRS (Hình 6) 10 mẫu RNA tách chiết có nồng độ khác nhau, mẫu RNA tách chiết từ huyết thương mại, khơng chứa vi rút cho kết âm tính (Hình 6, 11-13) Quan sát màu phản ứng cho thấy thay đổi màu sắc từ hồng sang vàng phản ứng chứa RNA mục tiêu, màu phản ứng giữ nguyên phản ứng âm Kết đồng soi chất nhuộm SYBR Kết luận Hình Kết khảo sát tính đặc hiệu PSR Phản ứng thực nhiệt độ 65 0C 40 phút, quan sát màu sắc soi SYBR Trong (-) chứng âm khơng chứa DNA/RNA, mẫu từ - tương ứng: PRRSV, CSFV, ASFV, PEDV, S enterica, S aureus, P aeruginosa, L monocytogenes, V Parahaemolyticus Hoạt động PSR với RNA gen tách chiết Hình Khả phát PSR mẫu RNA tách chiết từ mẫu bệnh phẩm khác Trong đó: (-) mẫu âm khơng chứa trình tự mục tiêu, (+) mẫu dương chưa trình tự mục tiêu dạng tổng hợp, (1-10) mẫu RNA PRRSV tách chiết từ mẫu huyết bệnh phẩm khác nhau, (11-13) mẫu tách chiết từ mẫu huyết thương mại không chứa RNA PRRSV RNA gen PRRSV cung cấp Học viện Nông nghiệp Việt Nam tách chiết trực tiếp từ mẫu Từ trước đến nay, thịt lợn sản phẩm thịt quan trọng hàng đầu ngành chăn nuôi Việt Nam, mà nhiễm PRRSV trở thành mối quan tâm lớn khả lây nhiễm gây nên tỷ lệ tử vong cao lợn Hiện tại, việc kiểm soát lây nhiễm PRRSV phụ thuộc vào việc xác định sớm để ngăn chặn lây lan thêm vi rút Do đó, việc phát triển phương pháp chẩn đốn đơn giản nhanh chóng cho PRRSV vơ quan trọng Bên cạnh đó, phương pháp phát xác bệnh địi hỏi trang thiết bị đắt tiền mơi trường chun biệt, chúng khơng thích hợp để phát PRRSV chỗ phịng thí nghiệm trang bị Trong nghiên cứu này, phương pháp PSR với cặp mồi đặc hiệu gen M thực tối ưu thành cơng phát xác PRRSV thời gian 40 phút nhiệt độ cố định (65 0C) Với kết hợp enzyme phiên mã ngược có phản ứng hoạt động thay mạch enzyme Bst DNA polymerase, RNA mục tiêu khuếch đại đặc hiệu xác thời gian ngắn, đồng thời mồi lựa chọn có tính chun biệt cao so với chủng vi rút gây bệnh lợn, vốn dễ nhầm lẫn với PRRSV xét dấu hiệu lâm sàng ban đầu Với quy trình tối ưu nghiên cứu, PSR có khả phát trình tự mục tiêu PRRSV nồng độ trình tự dạng tổng hợp 100.5 TCID50/mL RNA gen tinh Đây nghiên cứu phát triển phương pháp phát PRRSV phương pháp PSR quan sát kết trực tiếp mắt thường thông qua chất thị màu Đại học Nguyễn Tất Thành Tạp chí Khoa học & Cơng nghệ Số 15 30 phenolred Việc phát xác RNA mục tiêu tách chiết từ mẫu bệnh phẩm PRRSV cho thấy khả ứng dụng cao phương pháp cho chẩn đoán lâm sàng phương pháp tiềm cho việc phát triển kit chẩn đoán nhanh chỗ Lời cảm ơn Nghiên cứu tài trợ Quỹ phát triển Khoa học Công nghệ - Đại học Nguyễn Tất Thành, mã đề tài 2021.01.38/HĐ-KHCN Tài liệu tham khảo Done, S.H., Paton, D.J., and White, M.E (1996) Porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS): a review, with emphasis on pathological, virological and diagnostic aspects Br Vet J 152, 153–174 Gao, M., Cui, J., Ren, Y., Suo, S., Li, G., Sun, X., Su, D., Opriessnig, T., and Ren, X (2012) Development and evaluation of a novel reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) assay for detection of type II porcine reproductive and respiratory syndrome virus J Virol Methods 185, 18–23 Li, J., Ma, B., Fang, J., Zhi, A., Chen, E., Xu, Y., Yu, X., Sun, C., and Zhang, M (2019) Recombinase Polymerase Amplification (RPA) Combined with Lateral Flow Immunoassay for Rapid Detection of Salmonella in Food Foods Liu, W., Dong, D., Yang, Z., Zou, D., Chen, Z., Yuan, J., and Huang, L (2015) Polymerase Spiral Reaction (PSR): A novel isothermal nucleic acid amplification method Sci Rep 5, 1–8 Nodelijk, G (2002) Porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) with special reference to clinical aspects and diagnosis A review Vet Q 24, 95–100 Qin, C., Jian, L., Xue-En, F., and Wei, X (2009) Rapid detection of porcine reproductive and respiratory syndrome virus by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification Intervirology 52, 86–91 Tomar, P.S., Kumar, J.S., Patel, S., and Sharma, S (2020) Polymerase Spiral Reaction Assay for Rapid and Real Time Detection of West Nile Virus From Clinical Samples Front Cell Infect Microbiol Wellenberg, G.J (2006) [Review: diagnostic methods for the detection of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) infections] Tijdschr Diergeneeskd 131, 566–572 Zhao, X., Lin, C.-W., Wang, J., and Oh, D.H (2014) Advances in rapid detection methods for foodborne pathogens J Microbiol Biotechnol 24, 297–312 Đại học Nguyễn Tất Thành Tạp chí Khoa học & Công nghệ Số 15 31 Evaluation of rapid detection of Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) using Polymerase spiral reaction Tran Hong Diem*, Tran Thi Hau, Pham Nguyen Minh Trang, Phung Thi Thu Huong NTT Hi-Tech Institute, Nguyen Tat Thanh University Abstract Porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) caused by PRRS viruses (PRRSV) is one of the most complicated and dangerous diseases in pigs with a high mortality rate In many provinces in Vietnam, annual PRRS outbreaks continue to threaten farmers' livelihoods and consumers' health RT-PCR is currently the gold standard for diagnosing PRRS, with other molecular biology tools constantly being developed The isothermal spiral amplification (Polymerase Spiral Reaction - PSR) method was developed and optimized in this study for rapid and specific detection of PRRSV The method is simple and does not require expensive thermal cycling equipment The optimized PSR could detect PRRSV target sequence with a detection limit of 10 0.5 TCID50/mL and the reaction was carried out at a constant temperature (65 0C) for 40 minutes Simultaneously, the diagnostic results could be immediately confirmed by the color of the reaction Keywords RT-PSR, PRRSV, isothermal Đại học Nguyễn Tất Thành ... 26 pháp đẳng nhiệt phát triển thời gian gần với nhiều ưu điểm để phát triển quy trình phát nhanh, chỗ [7] Phương pháp cần hoạt động cặp mồi thiết kế đặc biệt với khả tạo vòng xoắn khuếch đại DNA... trở thành mối quan tâm lớn khả lây nhiễm gây nên tỷ lệ tử vong cao lợn Hiện tại, vi? ??c kiểm soát lây nhiễm PRRSV phụ thuộc vào vi? ??c xác định sớm để ngăn chặn lây lan thêm vi rút Do đó, vi? ??c phát. .. cao so với chủng vi rút gây bệnh lợn, vốn dễ nhầm lẫn với PRRSV xét dấu hiệu lâm sàng ban đầu Với quy trình tối ưu nghiên cứu, PSR có khả phát trình tự mục tiêu PRRSV nồng độ trình tự dạng tổng